DC-CIK对K562/A多药耐药基因mdr1 表达的影响

目的：体外观察树突状细胞（dendritic cell,DC）联合细胞因子诱导的杀伤细胞（cytokine inducedkiller,CIK）对K562/A细胞株多药耐药基因mdr1 表达的影响。方法：采集健康人的外周血,分离出单个核细胞( peripheral blood mononuclear cell,PBMC ),在体外加入多种细胞因子经诱导生成DC及CIK 细胞,以流式细胞仪检测其表面标志,将DC 细胞内加入K562/A 细胞裂解物致敏后,再与CIK细胞混合培养48 小时。将致敏后的DC-CIK 细胞与K562/A及K562 分组培养后以荧光定量PCR 检测其mdr1 基因表达的情况,PBMC 作为对照组。结果：RT-PCR 中可见K562/A+DC-CIK 组中mdr1 mRNA 表达较K562/A明显降低,经荧光定量PCR 观察到K562/A 内mdr1 mRNA 表达为K562 的10.27 倍、K562/A/PBMC 略低于未处理的K562/A（P>0.05）,K562/A/DC-CIK 细胞中mdr1 mRNA含量较K562/A、K562/A/PBMC 少（P<0.05）。DC-CIK细胞与细胞株混合培养后,mdr1 基因表达较混合培养前明显降低。结论：实验数据显示DC-CIK 可使耐药细胞株内mdr1 基因表达下调。但K562 与DC-CIK 混合培养后该基因降低不明显,提示该基因在细胞中存在着基础表达,意义在于维持细胞内稳态。目前针对逆转白血病耐药的研究较少,需要多进行相关研究以拓宽细胞免疫治疗在逆转耐药领域的应用。DC-CIK 是具有发展潜力的抗肿瘤方法。本实验将为下一阶段研究逆转耐药的机制提供依据,DC-CIK 细胞免疫疗法有望成为逆转肿瘤耐药的新方法。     

自体DC、CIK细胞在急性髓细胞白血病治疗中的研究进展

树突状细胞(DC)是初级免疫应答的激发者,是最有活力的抗原递呈细胞(APC),可以有效地抑制白血病细胞逃逸。未成熟DC细胞从细胞外捕获各种抗原信息,成熟DC细胞传递各种抗原信息给宿主淋巴结的T细胞,激活抗原相关的主要组织相容性复合体(MHC)限制性特异性免疫应答,另外,亦可通过影响B细胞的增殖,不同程度的活化体液免疫应答。细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)是一组具有细胞毒作用的异质细胞群,是较LAK细胞溶瘤活性更强的一种免疫活性细胞,对包括白血病在内的多种恶性肿瘤具有抗肿瘤效应,具有非MHC限制性的杀瘤特点。二者联合培养及应用又增强了各自的活性。DC细胞与CIK细胞对于白血病的疗效不仅在实验室得以证实,而且已经逐步应用于临床,其在清除微小残留病以及预防造血干细胞移植后复发中取得了良好的效果。随着细胞制备技术的完善和研究的进一步深入,自体DC、CIK细胞治疗急性髓细胞白血病逐渐获得众多专家的认可。中国卫生部已经把自体免疫细胞治疗技术做为第三类医疗技术应用于临床,批准号200984。本文就目前DC、CIK、DC-CIK细胞免疫疗法在急性髓细胞白血病中的应用进展加以综述。     

PIC—BE对K562／ADM多药耐药细胞mdr—1和bcl—2基因表达的影响

The effect of PIC-BE on the expression of mdr-1, bcl-2 and bax genes and their protein products (P-gp, Bcl-2 and Bax) was observed respectively in a multidrug resistance (MDR) cell variant K562/ADM. The results showed that PIC-BE could significantly inhibit the expression of mdr-1 and bcl-2 genes at both mRNA and protein levels in K562/ADM cell line, and the effect was dose- and time-dependent within limited range. Under same condition, although PIC-BE could increase the expression of Bax slightly, there was no statistically significant difference. These results suggest that the reversal of the MDR of K562/ADM cell line by PIC-BE may result from its effect on the expression of mdr-1, bcl-2 genes and their protein products.     

三氧化二砷对K562/A02 细胞的凋亡及细胞周期的影响

目的:研究三氧化二砷对多药耐药急性白血病细胞株K562/A02凋亡与细胞周期的影响及可能机制。方法:取阿霉素(Adr)的耐药白血病细胞株分为未加药的对照组及加入不同浓度的三氧化二砷(其终浓度为4.0μmol/L、5.0μmol/L)组,流式细胞仪检测细胞凋亡及细胞周期分布,Western blot方法检测不同浓度三氧化二砷对K562/A02细胞核NF-κBp65蛋白水平。结果:与对照组比较,三氧化二砷可显著增加Adr对K562/A02细胞凋亡率,阻滞细胞于G0/G1期,降低K562/A02细胞胞核中NF-kB p65的表达(P均<0.05)。结论:三氧化二砷可能是通过抑制NF-kB的胞内活化转位,从而促进K562/A02细胞凋亡及抑制细胞增殖。     

过继免疫治疗中DC-CIK的研究进展

目前,免疫细胞生物学和免疫分子生物学发展迅猛,由于其具备低毒性和高效率的特性,肿瘤免疫治疗在恶性肿瘤治疗中所起的作用引起了学者们的广泛关注,其中细胞介导的过继免疫治疗为当前研究的热点之一。过继免疫治疗(adoptive cellular immunotherapy,ACI)是目前恶性肿瘤治疗的新方向,它通过向细胞免疫功能低下者回输具有抗肿瘤活性的免疫细胞,直接杀伤或间接杀伤肿瘤细胞,使其获得抗肿瘤免疫力。树突状细胞(Dendritic cell DC)是专职抗原递呈细胞(antigen presenting cell APC)之一,在机体免疫应答的启始、调节、维持中发挥核心作用。细胞因子诱导的杀伤(cytokine induced killer CIK)细胞具有高效的MHC非限制性溶瘤活性,具有极其广泛的杀瘤范围。近年来,国内外大量研究表明,联合培养的DC-CIK抗肿瘤活性提升明显,患者预后生存期延长,效果显著。本文就DC与CIK生物学特点及抗肿瘤作用予以简要综述。     

DC-CIK治疗大肠癌的研究进展

大肠癌是消化道常见的恶性肿瘤之一,发病率和死亡率均较高。过继免疫治疗是当今肿瘤治疗的热点,已逐步成为一些肿瘤的首选治疗方法。树突状细胞(DC)是目前已知功能最强大的抗原呈递细胞,具有呈递肿瘤抗原和抵制肿瘤细胞免疫逃逸及刺激T淋巴细胞产生免疫应答的作用。细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)由多种细胞因子诱导而成,具有T淋巴细胞及NK细胞抗肿瘤作用的特点。DC和CIK细胞有效结合可以同时促进DC细胞的增殖和免疫功能及加强CIK细胞的抗肿瘤作用。本文就近年来国内外应用DC-CIK治疗大肠癌的研究进展进行综述。     

细胞因子诱导杀伤细胞过继免疫治疗恶性血液肿瘤的临床应用进展

细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine-induced killer cells,CIK cells)是将脐血、外周血和骨髓等不同来源的单个核细胞经适当浓度的IFN-γ、IL-2和CD3单抗等联合诱导后获得的异质细胞群。CIK细胞具有增殖能力强、溶瘤谱广、对耐药细胞株也有杀伤作用,且兼有T细胞强大的杀伤活性和NK细胞(nature killer cells)非主要组织相容性复合体(non-major histocompatibility complex,non-MHC)限制性的特点,使其在肿瘤治疗中具有广阔的临床应用前景。恶性血液肿瘤患者接受CIK细胞过继免疫治疗的生存时间延长,不良反应少,但仍面临许多问题。     

K562耐药细胞的建立及相关蛋白表达改变的研究

为研究肿瘤细胞发生多药耐药后蛋白整体水平表达的改变,将K562细胞与阿霉素(ADR)共同培养,逐渐增加药物浓度,最后建立耐阿霉素的细胞K562／ADR株。MTT法检测阿霉素(ADR)、顺铂(DDP)、5-氟尿嘧啶(5-FU)和长春新碱(VCR)对K562和K562／ADR细胞的半数抑制率(IC50)。利用蛋白质组学技术,通过双向凝胶电泳分离K562和K562／ADR细胞的总蛋白,银染显色,分析差异蛋白,对部分蛋白点进行胶内酶解,用基质辅助激光解析飞行时间质谱法得肽质量指纹图谱,用AutoMS-Fit软件查询NCBInr数据库鉴定蛋白质。结果表明K562细胞经ADR诱导后出现多药耐药现象,ADR、DDP、5-FU和VCR对K562／ADR细胞的IC50明显高于K562。将K562和K562／ADR的双向电泳图谱进行差异比较,初步鉴定仅在K562／ADR图谱上出现的蛋白是一些与细胞分裂、基因转录有关的蛋白质。这些蛋白的变化与耐药细胞的特性相关,可能与临床化疗的多药耐药现象有联系。     

树突状细胞与CIK细胞共培养诱生的DCCIK细胞群对肿瘤的杀伤作用

由树突状细胞(DC)与细胞因子诱导的同源杀伤细胞(CIK)的共培养诱生的细胞群(DCCIK)对肿瘤细胞的细胞毒活性的研究。DCCIK细胞体外杀伤肿瘤靶细胞A549(MTT法),效靶比为10∶1、5∶1时杀伤率分别为61%、52%。DCCIK细胞诱导培养3周后,效靶比为10∶1、5∶1时杀伤率分别为64%和56%。数据亦表明DCCIK细胞对靶细胞的杀伤优于CIK细胞。动物体内实验分荷瘤A549、BEL7404和A375三组,每组分(A)DCCIK 化疗、(B)单用化疗。治疗20天、35天后测量各组肿瘤消失率。结果显示:DCCIK 化疗的抑瘤效果明显好于单纯化疗。提示DCCIK细胞有临床应用前景。     

敲除LSD1基因对人慢性髓系白血病K562细胞周期的影响

为了探讨敲除LSD1基因后抑制人慢性髓系白血病 K562细胞增殖的原因,使用前期CRISPR/Cas9技术构建的人慢性髓系白血病 K562 LSD1基因敲除株,通过细胞凋亡Annexin V/PI（碘化丙啶）双染色、细胞PI染色以及流式细胞术技术,探究敲除LSD1基因后,K562细胞的凋亡水平是否改变,细胞周期是否受到影响。结果表明敲除LSD1基因后K562细胞被阻滞在G0/G1期,进入DNA复制期的细胞变少,因此导致细胞增殖速度减慢;通过细胞凋亡Annexin V/PI双染色并分析早期以及晚期凋亡细胞总比例,显示敲除LSD1基因后,不影响K562细胞的凋亡。研究结果表明,敲除LSD1基因后人慢性髓系白血病 K562细胞的增殖受到抑制,这是由于K562细胞增殖周期发生了改变,进入DNA复制期和分裂期的细胞减少;而与细胞凋亡水平的变化无关。     

Effect of phenols on natural killer (NK) cell-mediated death in the K562 human leukemic cell line

Cancer disease is a major cause of death in Western societies. Epidemiologically, antioxidant phenols have been associated with diminished incidence of cancer, while experimentally, they have cytotoxic effects on cancer cells. The aim of this study was to clarify whether natural antioxidant phenols render K562 human leukemic cells more susceptible to natural killer (NK) cell apoptosis and/or necrosis. K562 cells were pre-incubated with 7 different phenols (p-hydroxy benzoic acid, syringic acid, ferulic acid, p-coumaric acid, o-coumaric acid, gallic acid, and rutin) individually and afterwards targeted with NK cells at a ratio 1/5. Percentages of apoptotic and necrotic cells were assayed via flow cytometric analysis of annexin V and PI-stained cells. For the morphological assessment, cells were stained with acridine orange and ethidium bromide and were examined under a fluorescence microscope. Pre-treatment with gallic acid significantly rendered K562 cells more susceptible to NK cell-mediated necrosis, while pre-treatment with rutin significantly rendered K562 cells more susceptible to apoptosis. Gallic acid and rutin exert anticarcinogenic activity via the enhancement of K562 cell susceptibility to NK cell-mediated necrosis and apoptosis, respectively.     

青蒿琥酯抑制白血病耐药细胞株K562/ADM转铁蛋白受体表达

目的:观察青蒿琥酯对于白血病多药耐药细胞细胞株K562/ADM转铁蛋白受体表达的影响。方法:将K562/ADM(耐阿霉素)细胞分别经浓度为12.5、25、50μg/m L的青蒿琥酯处理48 h,同时25μg/m L实验组在12 h、24 h、36 h分别收集足量细胞。采用流式细胞术检测青蒿琥酯对细胞转铁蛋白受体(Tf R)密度的调控作用,Western blot检测青蒿琥酯对细胞Tf R蛋白表达的调控作用。CCK-8法分析青蒿琥酯对K562/ADM细胞生长增殖的影响。结果:K562/ADM细胞Tf R密度和Tf R蛋白表达水平分别经12.5、25、50μg/m L青蒿琥酯处理后均下降,呈浓度依赖性。25μg/m L青蒿琥酯处理K562/ADM细胞不同时间段后转铁蛋白受体蛋白表达水平随着Art作用时间延长而逐渐降低,表明呈时间依赖性。K562/ADM细胞经青蒿琥酯处理后其耐药性减弱:与对照组相比,12.5、25、50μg/m L实验组细胞耐药逆转倍数分别为1.38、2.12和2.95倍,从而抑制K562/ADM细胞增殖。IC50值为19.7μmol/L。结论:青蒿琥酯能降低细胞Tf R密度和下调Tf R蛋白的表达,逆转K562/ADM细胞的耐药性,从而起到抗肿瘤作用。     

氯化高铁血红素诱导K562细胞红系分化对其细胞周期的影响

细胞周期的测量是细胞增殖动力学的研究基础。通过添加30μmol·L-1氯化高铁血红素(Hemin)诱导人慢性髓系白血病K562细胞红系分化,利用5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)与7-AAD双染的方法检测Hemin诱导的K562红系分化细胞对细胞周期各期比例的影响,未诱导的K562细胞周期各期比例作为对照,检测发现Hemin诱导的K562红系分化细胞对其细胞周期相对值无明显影响。应用BrdU间隔染色结合流式细胞术的方法,通过分析BrdU间隔染色后BrdU阳性细胞群的动态变化规律,从而推算出K562红系分化细胞的倍增时间及细胞周期各期时长。根据测量结果发现,未诱导的K562细胞总倍增时间约为20 h,与通过生长曲线公式法计算倍增时间的结果相符,Hemin诱导的K562细胞的细胞周期倍增时长约为23 h。Hemin诱导的K562红系分化细胞较未诱导的K562细胞倍增时间与各期时长无明显差异。因此,Hemin诱导K562细胞红系分化对其细胞周期绝对值及相对值均无明显影响。     

Atpif1基因对K562细胞血红蛋白合成的影响*

目的:探讨线粒体三磷酸腺苷酶抑制因子-1(Atpif1)对血红蛋白合成的影响。方法:首先,将K562细胞分为低氧实验组、常氧对照组,低氧实验组采用O₂浓度为2%,分别培养24 h,48 h,72 h后收集两组细胞,通过细胞增殖-毒性检测试剂盒(CCK8)法检测细胞的活性,流式细胞仪检测低氧对细胞凋亡的影响,通过氯化血红素诱导K562细胞,检测低氧对血红蛋白合成的影响,qRT-PCR检测Atpif1,核因子(NF-κB),delta-氨基酮戊酸合成酶2(Alas2)基因的转录表达。然后,将K562细胞置于低氧培养箱培养并分为空白组,阴性对照组和si-Atpif1三组。转染siRNA,沉默Atpif1基因,观察血红蛋白合成和NF-κB、Alas2基因mRNA水平变化。结果:与常氧对照组相比,低氧实验组K562细胞活性降低、凋亡增加,血红蛋白含量增加(P＜0.05)。Atpif1、Alas2、NF-κB的mRNA表达水平上调(P＜0.05)。与空白对照组和阴性对照组相比,si-Atpif1组血红蛋白含量均有减少(P＜0.05),同时NF-κB、Alas2的mRNA水平也出现下调(P＜0.05)。结论:Atpif1基因参与调控血红蛋白合成,探究其在高原红细胞增多症(HAPC)发生中的作用,可以为防治HAPC提供新的思路和治疗靶点。     

利用CRISPR/Cas9技术建立敲除JAK2基因K562细胞系

目的:利用CRISPR/Cas9技术对K562细胞系JAK2基因进行编辑,构建JAK2基因敲除的K562细胞系。方法:使用CRISPR在线设计工具,针对JAK2基因设计sgRNA,构建Cas9-sgRNA共表达质粒。使用第二代慢病毒包装系统包装慢病毒并感染K562细胞,提取细胞基因组DNA,Sanger测序和TA克隆检测基因编辑活性。无限稀释法将编辑阳性的细胞接种于96孔板并扩培得到单克隆细胞株,提取基因组DNA,Sanger测序和TA克隆分析敲除JAK2单克隆细胞的基因型。结果:成功构建靶向敲除JAK2基因的lentiCRISPRv2-sgRNA3-1质粒。优化方案得到低细胞毒性高转染效率的感染K562细胞慢病毒量。CRISPR/Cas9系统成功在JAK2基因sgRNA3-1识别位点发挥基因组编辑活性,获得纯合敲除JAK2基因细胞株K562-JAK2~(-/-)(两个等位分别发生移码突变,预期编码没有功能的JAK2蛋白)。结论:CRIAPR/Cas9系统通过慢病毒感染方式获得JAK2基因纯合敲除的K562细胞株,该细胞模型可用于研究在慢性髓系白血病中JAK2基因的作用,为构建K562敲除其他基因细胞系提供实验依据,为探究造血分化机制的研究奠定实验基础。     

RNAi干扰Shp2基因对K562细胞增殖的抑制效应

通过RNA干扰技术沉默蛋白酪氨酸磷酸酶跏2基因,构建重纽质粒,采用实时荧光定量PCR（Real-timePCR）法、Westernblot、MTT法、流式细胞术（FCM）分别检测转染后K562细胞中bcr／abl融合基因、bcr／abl融合蛋白的表达水平、细胞生长增殖变化及细胞凋亡率,探索该基因的沉默表达对K562N胞的抑制作用。结果表明,该实验成功构建出能明显下调Shp2基因及其蛋白表达的重组质粒,转染K562细胞后,其bcr／abl融合基因及融合蛋白水平均明显降低、K562细胞增殖活力被抑制（P〈0．05）、细胞凋亡水平上升（P〈0．05）。与对照组相比,其差异具有统计学意义。提示,重组质粒可显著降低bcr／abl基因及蛋白的表达,抑制K562细胞的生物学效应,表明在细胞水平沉默Shp2有可能成为治疗慢性粒细胞白血病的有效靶点。     

PESV 对K562 细胞BCR/ABL 融合基因及凋亡调控因子Bcl-2、Bad 表达的影响

目的:探讨PESV对K562细胞BCR/ABL融合基因及凋亡调控因子bcl-2和bad表达的影响.方法:将体外培养K562细胞,经PESV处理不同时间后,流式细胞术检测细胞凋亡率,荧光定量RT-PCR检测BCR/ABL、Bcl-2、Bad mRNA水平变化.结果:与对照组相比,PESV处理后K562细胞,凋亡率增加,BCR/ABL融合基因表达降低,抗凋亡相关基因Bcl-2 mRNA表达降低,促凋亡基因Bad mRNA表达增加.结论:PESV能降低降低K562细胞BCR/ABL融合基因的表达,可能通过调节Bcl-2和Bad表达,抑制K562细胞增殖,促进其凋亡.