TGF-β2在低氧条件下诱导骨髓基质干细胞向软骨细胞分化 的研究

目的：探讨转化生长因子β2(TGF-β2)在低氧条件下诱导骨髓基质干细胞(BMSCs)向软骨细胞分化的作用。方法：无菌条件下 分离Wistar 大鼠股骨骨髓,采用全贴壁培养法纯化BMSCs。传6 代后,将细胞随机分为3 组,A组加入25 ng/mL TGF-β2在1%氧 浓度条件下培养;B 组加入25 ng/mL TGF-β2在21%氧浓度条件下培养;C 组仅加入含10%胎牛血清的DMEM-α培养液在1%氧 浓度条件下培养。3 周后,通过甲苯胺蓝染色检测细胞糖胺多糖,聚合酶链反应检测Ⅱ型胶原和蛋白聚糖(Aggrecan)的表达水平。 结果：骨髓细胞经换液后贴壁聚集生长,形态均一,连续传代后形态无明显改变。分组培养第1 周,A、C 组生长速度低于B 组;第 2 周各组均出现不规则形态细胞,A、C 组细胞形态小于B 组;第3 周各组均可见透明样基质,以A组最明显。3 周后行甲苯胺蓝 染色,A 组细胞内外均可见丰富的蓝染颗粒,B、C 组染色较A 组略浅。A 组Ⅱ型胶原的表达相对量(1.246± 0.287) 高于B 组 (0.973± 0.365)、C组(0.802± 0.196),差异有统计学意义(P＜0.05);B、C 组比较无明显差异(P＞0.05)。A 组Aggrecan 的表达相对量 (0.833± 0.375)高于B组(0.724± 0.173)、C 组(0.602± 0.091),差异有统计学意义(P＜0.05);B、C 组比较无明显差异(P＞0.05)。结 论：TGF-β2联合低氧环境可明显促进骨髓基质干细胞分化为软骨细胞。     

β2微球蛋白在骨髓基质干细胞的表达

通过流式细胞技术和激光共聚焦显微镜探索骨髓基质干细胞（bone mesenchymal stemcells,BMSCs）β2微球蛋白（beta 2 microglobulin,β2M）的表达情况。取第3代相同状态的SD大鼠骨髓基质干细胞,分为A、B两组,A组为未分化的BMSCs,B组为软骨诱导分化1周的BMSCs,两组均采用流式细胞技术和激光共聚焦显微镜分别从数量和细胞轮廓上检测β2M的表达。流式细胞仪和激光共聚焦显微镜检测结果均表明,未分化BMscs的β2M表达明显低于软骨诱导分化的BMSCs。结果表明,未分化的BMSCs免疫原性较低,处于软骨分化的BMSCs免疫原性明显增强。     

富血小板纤维蛋白对兔骨髓间充质干细胞成软骨分化的影响

目的：观察自体富血小板纤维蛋白（platelet-rich fibrin,PRF）对体外培养的兔骨髓间充质干细胞（Bonemarrowmesenchymalstemcells,BMSCs）成软骨分化的影响。方法：兔心脏采血制备PRF,电镜观察其超微结构;分离培养兔BMSCs,取第3代细胞用于实验．分为PIuF组、阳性对照组、空白对照组。诱导培养21d后,对三组细胞分别进行形态学观察,成软骨鉴定染色（甲苯胺蓝、Ⅱ型胶原免疫组化染色）,软骨相关基因表达检测（Ⅱ型胶原、Aggrecan、SOX9）。结果：PRF组和阳性对照组中BMSCs经诱导后,细胞由长梭形变为三角形、多角形、圆形;甲苯胺蓝、Ⅱ型胶原免疫组化染色均为阳性;Ⅱ型胶原、Aggrecan、SOX9基因表达水平均较高,两组比较无统计学差异,空白对照组未见相关分化现象。结论：PRF在体外可促进兔BMSCs成软骨分化,可作为自体生物材料,在构建组织工程软骨中发挥更好的作用。     

富血小板纤维蛋白对兔骨髓间充质干细胞成软骨分化的影响*

摘要目的：观察自体富血小板纤维蛋白（platelet-rich fibrin, PRF）对体外培养的兔骨髓间充质干细胞（Bone marrow mesenchymal stemcells, BMSCs）成软骨分化的影响。方法：兔心脏采血制备PRF,电镜观察其超微结构;分离培养兔BMSCs,取第3代细胞用于 实验,分为PRF组、阳性对照组、空白对照组。诱导培养21d 后,对三组细胞分别进行形态学观察,成软骨鉴定染色（甲苯胺蓝、II 型胶原免疫组化染色）,软骨相关基因表达检测（Ⅱ型胶原、Aggrecan、SOX9）。结果：PRF 组和阳性对照组中BMSCs经诱导后,细 胞由长梭形变为三角形、多角形、圆形;甲苯胺蓝、II 型胶原免疫组化染色均为阳性;Ⅱ型胶原、Aggrecan、SOX9基因表达水平均 较高,两组比较无统计学差异,空白对照组未见相关分化现象。结论：PRF在体外可促进兔BMSCs 成软骨分化,可作为自体生物 材料,在构建组织工程软骨中发挥更好的作用。     

白介素1受体拮抗剂及转化生长因子β1对兔膝关节骨性关节炎（OA）的治疗研究

目的：通过关节腔内注射白介素l受体拮抗剂（IL-1Ra）及转化生长因子β1（TGF]B1）,观察其对骨性关节炎的治疗作用。方法：16只3-4个月龄新西兰大白兔（雌雄不限）随机分为四组,每组四只,分为正常组,对照组,IL1-Ra组,TGF-β组,正常组仅打开左膝关节关节腔,剩余三组均给予左膝关节前交叉韧带离断术（anterior cruciate ligament transaction ACLT）。四周后IL-1Ra组给予关节腔内注射IL-1Ra5g／ml,TGF-β1组给予关节腔内注射TGF-β150mg／ml,每周两次,连续四周,正常组及对照组未采取任何措施。术后八周时采用空气栓塞法处死全部实验动物,取股骨远端长约1cm,固定后切片行细胞形态学观察。结果：大体肉眼观察：对照组股骨远端软骨面色颜色变暗并稍显粗糙,可见少量软骨脱落,其余两组关节软骨大体形态均接近正常。镜下观察：TGF-β1组软骨细胞增生明显,软骨细胞排列较正常软骨细胞排列轻度紊乱。IL—1Ra组软骨细胞增生数量未及TGF-β1组明显,软骨细胞排列也不及TGF-β1组规则。IL-1Ra组及TGF-β1组软骨细胞形态接近正常软骨细胞,基质染色接近正常。两组软骨膜表面光滑,无纤维细胞形成,软骨膜下未见纤维化。对照纽软骨细胞数量明显减少且排列紊乱,软骨细胞形态发生改变,可见软骨细胞凋亡,镜下可见软骨细胞核浓缩、裂解,并可见新生软骨形成,突出于正常软骨膜表面,软骨膜表面下方可见血管翳及纤维母细胞形成,出现轻度纤维化。基质染色不均匀且染色较淡。结论：IL-1Ra及TGF-β1关节腔内注射均能有效抑制骨性关节炎关节软骨的退变并增加软骨细胞再生,促进软骨基质合成,延缓骨性关节炎的发病进程.     

几丁质支架对间充质干细胞成软骨分化中Ⅱ型胶原表达的影响

目的将间充质干细胞诱导分化为软骨细胞,观察分化后的细胞在单层培养和几丁质支架上培养的差别。方法抽取兔股骨骨髓,密度梯度离心分离BMSCs,用TGF-β1诱导第3代的BMSCs向软骨方向分化,2周后用免疫组化检测Ⅱ型胶原表达情况。将分化后的软骨样细胞传代,用无TGF-β1的培养基分别进行单层培养和接种在几丁质支架上培养2周,再用免疫组化检测Ⅱ型胶原表达情况。结果BMSCs经TGF-β1诱导后,具有软骨细胞特点,然而进行无TGF-β1的继续培养后,单层培养的类软骨细胞很快呈去分化表型,而接种在支架上的细胞仍能较好表达Ⅱ型胶原。结论几丁质支架具有延缓软骨样细胞去分化和老化的作用。     

兔BMSCs复合纤维蛋白胶在体外分化为角膜基质细胞的研究

目的：探讨体外诱导兔骨髓间充质干细胞（BMSCs）分化为角膜基质细胞的可行性,并观察纤维蛋白胶（FG）作为细胞支架材料的效果。方法：密度梯度法获得BMSCs,体外诱导实验将细胞分为三组：对照组用普通培养皿、BMSCs培养条件并不加角膜基质细胞共培养的条件下培养;非FG共培养组使用普通培养皿并与角膜基质细胞共培养诱导BMSCs分化;FG共培养组使用铺有FG的培养皿并与角膜基质细胞共培养诱导BMSCs分化。培养1w及2w后用WestenBlot法检测三组细胞Keratocan的表达,在相差显微镜下进行形态学观察。结果：原代培养的BMSCs表现出成体干细胞潜能,CD29染色阳性,符合骨髓基质干细胞的特征。诱导培养2周后对照组BMSCs融合成单层、呈条索状生长;非FG共培养组部分细胞体积变小、多突起,局部呈梭形生长;FG共培养组细胞生长状态良好,部分细胞呈梭形或纺锤形,与FG生物相容性好。Westen检测结果：BMSCs细胞在纤维蛋白胶或普通培养皿上特定培养条件下均能诱导表达角膜基质细胞的特异性蛋白Keratocan。结论：骨髓间充质干细胞在条件培养基下可分化为角膜基质细胞,有望作为治疗角膜疾病及角膜组织工程的备选材料,纤维蛋白胶组织相容性好,可为组织工程提供移植细胞片。     

TGF-β3与TIMP-2联合转染兔骨髓间充质干细胞复合丝素蛋白/壳聚糖生物支架修复兔软骨缺损(英文)

目的:TGF-β3广泛存在于骨组织、软骨组织中,能诱导体外培养的间充质干细胞向软骨分化、生长。TIMP-2能抑制MMP对软骨基质的降解,保护新生软骨组织。本实验探讨单纯TGF-β3和TGF-β3,TIMP-2联合转染兔骨髓间充质干细胞复合丝素蛋白壳聚糖/(silk fibrin/chitosan,SF/CS)生物支架植入动物体内修复兔膝关节软骨缺损的可行性及效果差异。方法:将新西兰大白兔20只分为4组,每组5只(支架组、未转染组、reAAV-TGF-β3转染组、reAAV-TGF-β3,reAAV-TIMP-2联合转染组)。在无菌条件下取兔第三代对数生长期骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs),用携带目的基因的重组腺相关病毒进行转染,将转染成功的BMSCs与SF-CS生物支架复合,分别植入兔膝关节软骨缺损处:未转染组植入SF-CS生物支架,未转染组植入未转染的BMSCs复合SF-CS生物支架,reAAV-TGF-β3转染组植入reAAV-TGF-β3转染的BMSCs复合SF-CS生物支架,reAAV-TGF-β3,TIMP-2联合转染组植入reAAV-TGF-β3,TIMP-2联合转染的BMSCs复合SF-CS生物支架。两月后处死家兔,肉眼观察以及HE染色评定缺损软骨修复情况。并进行软骨细胞特征性染色即甲苯胺蓝染色及II型胶原免疫组化染色鉴定。结果:两个月后除支架组外各实验组兔膝关节软骨缺损处均有软骨样物质形成,且联合转染组诱导的新生成分更接近缺损处周围正常软骨。联合转染组与reAAV-TGF-β3转染组;联合转染组与未转染组;reAAV-TGF-β3转染组与未转染组的评分差异均具有统计学意义(P0.05)。HE染色结果提示联合转染组软骨修复效果较单纯TGF-β3转染组更好。结论:单纯TGF-β3转染兔骨髓间充质干细胞对兔膝关节软骨缺损有修复作用,TGF-β3与TIMP-2联合转染组修复缺损效果更明显,提示TIMP-2与TGF-β3具有协同效应。     

淫羊藿素促进BMSCs成软骨分化的研究北大核心CSCD

研究淫羊藿素在GDF-5诱导BMSCs成软骨分化过程中的作用。全骨髓贴壁法分离培养SD大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs),取P3代细胞随机分成4组:对照组,淫羊藿素(Icaritin)组,Growth differentiation factor 5(GDF-5)组,Icaritin+GDF-5联合组。连续诱导培养14 d,倒置相差显微镜观察细胞形态,Alcian Blue染色检测细胞的蛋白聚糖改变,RT-PCR检测软骨分化标记基因Aggrecan、COL2、Sox9及COL1的表达情况,Western Blot检测COL2和COL1蛋白表达水平。结果提示,与对照组及GDF-5组相比,Icaritin+GDF-5联合组蛋白聚糖染色更深;软骨分化标记基因Aggrecan、COL2、Sox9明显增加;Ⅱ型胶原蛋白表达量均明显增加。淫羊藿素能够促进GDF-5诱导BMSCs成软骨分化。     

淫羊藿素促进BMSCs成软骨分化的研究

研究淫羊藿素在GDF-5诱导BMSCs成软骨分化过程中的作用。全骨髓贴壁法分离培养SD大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs),取P3代细胞随机分成4组:对照组,淫羊藿素(Icaritin)组,Growth differentiation factor 5(GDF-5)组,Icaritin+GDF-5联合组。连续诱导培养14 d,倒置相差显微镜观察细胞形态,Alcian Blue染色检测细胞的蛋白聚糖改变,RT-PCR检测软骨分化标记基因Aggrecan、COL2、Sox9及COL1的表达情况,Western Blot检测COL2和COL1蛋白表达水平。结果提示,与对照组及GDF-5组相比,Icaritin+GDF-5联合组蛋白聚糖染色更深;软骨分化标记基因Aggrecan、COL2、Sox9明显增加;Ⅱ型胶原蛋白表达量均明显增加。淫羊藿素能够促进GDF-5诱导BMSCs成软骨分化。     

软骨细胞联合BMP/bFGF移植对关节软骨损伤的修复作用

目的：探讨同种异体软骨细胞移植联合骨形态发生蛋白（BMP）/碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）对关节软骨损伤的修复作用。方法：取24只14周龄成年大白兔,随机分为A、B、C、D组,每组6只,于双侧膝关节软骨处制作软骨缺损模型,A组采用软骨细胞移植联合应用BMP/bFGF处理,B组采用单纯软骨细胞移植,C组采用单纯BMP/bFGF修复,D组采用磷酸盐缓冲液（PBS）作为阴性对照,于处理后8、12、24周行形态学、电镜观察及组织学评分。结果：8周时,A组关节修复面与周围结合紧密,可见大量软骨细胞出现,电镜下有软骨基质形成;B、C组仅有少量软骨细胞;D组未见修复。12周时,A组关节修复面与周围组织界限模糊,软骨细胞增殖活跃,电镜下可见成熟软骨基质;B、C组修复块周围有肉芽组织生成,电镜下可见未成熟的软骨基质出现;D组可见肉芽组织形成。24周时,A组修复面周围组织融合,电镜下软骨细胞纵行排列;B、C组关节面修复不完全,电镜下软骨细胞分布不均;D组见大量肉芽组织形成。24周时,A组组织学评分（1.87±0.65）,明显低于B组（3.49±0.71）、C组（3.43±0.83）组和D组（13.45±0.97）,差异均有统计学意义（P〈0.05）,B、C组均明显低于D组,差异有统计学意义（P〈0.05）,B、C组之间比较无明显差异。结论：软骨细胞联合BMP/bFGF移植能够促进软骨生长,提高软骨损伤的修复质量。     

TGF-β_1对不同阶段哮喘模型大鼠气道平滑肌细胞增殖的作用

目的探讨TGF-β1对不同阶段哮喘大鼠气道平滑肌细胞（ASMCs）增殖的作用。方法建立2周、6周哮喘大鼠模型,分别以1μg/L、10μg/L和100μg/LTGF-β1干预ASMCs生长。采用流式细胞仪、MTT法检测ASMCs增殖情况,观察不同浓度TGF-β1对ASMCs增殖的影响。结果 2周和6周哮喘组ASMCs的S期比例、A值分别为（34.31±1.41）%、（35.96±3.46）%;（0.546±0.005）、（0.559±0.009）与对照组（12.24±2.64）%、（0.289±0.009）比较均显著增高（均P〈0.01）。2周、6周哮喘模型组的各TGF-β1干预组ASMCs的S期比例、A值与各自哮喘组比较均显著升高（均P〈0.01）,10μg/L和100μg/LTGF-β1组比1μg/LTGF-β1组对ASMCs增殖作用明显增加（P〈0.01）,10μg/LTGF-β1组和100μg/LTGF-β1组相比,ASMCs增殖细胞占细胞总数的百分比无明显变化,两种浓度增殖作用无有明显差别（P〉0.05）。而2周和6周哮喘组相比,加入不同浓度TGF-β1干预后的差别不大（P〉0.05）。结论与正常鼠相比,2周和6周哮喘大鼠气道平滑肌细胞增殖明显,处于S期的细胞比例明显增高,6周哮喘大鼠气道平滑肌较2周哮喘大鼠增殖更明显。经TGF-β1干预后,2周和6周哮喘哮喘大鼠气道平滑肌细胞处于S期的细胞比例增加,增殖增强,提示TGF-β1可能在哮喘早期阶段即可促进大鼠气道平滑肌细胞增殖,并促进各阶段哮喘大鼠气道平滑肌细胞持续增殖。     

白藜芦醇对软骨细胞去分化现象的作用机制

该实验观察白藜芦醇(Resveratrol,Resv)对兔关节软骨细胞去分化现象的作用并探讨其可能的机制。首先,在无菌条件下取4周龄兔关节软骨细胞,行软骨细胞鉴定后将细胞随机分成5组:空白组、0μmol/L Resv组、2.5μmol/L Resv组、5μmol/L Resv组和10μmol/L Resv,体外单层培养传代至第5代。分别取P1、P3、P5代细胞在倒置相差显微镜下观察细胞形态变化,倒置相差显微镜下观察到各组P1代软骨细胞形态基本一致,P3、P5代2.5μmol/L Resv组细胞形态变化不大,其余各组细胞出现胞体变大,胞浆变淡,镜下胞核不明显等衰老的形态变化;Alcian Blue染色检测蛋白聚糖(Aggrecan)含量和β-半乳糖苷酶染色检测衰老软骨细胞,各组P1代细胞Alcian Blue染色和β-半乳糖苷酶染色无明显差别,P3、P5代2.5μmol/L白藜芦醇组较其他组明显深染、衰老软骨细胞数明显减少;RT-PCR检测蛋白多糖(Aggrecan),沉默信息调节因子1(SIRT1),抑癌基因p53、p21以及P16的表达,2.5μmol/L Resv组的Aggrecan和SIRT1基因表达明显上调,P53、P21及P16基因表达显著下调。综上所述:低浓度白藜芦醇(2.5μmol/L)可能通过上调SIRT1,下调P53、P21、P16基因的表达抑制软骨细胞去分化的现象。     

白介素1 受体拮抗剂及转化生长因子β1 对兔膝关节骨性关节炎（OA） 的治疗研究

目的:通过关节腔内注射白介素1受体拮抗剂(IL-1Ra)及转化生长因子β1(TGF-β1),观察其对骨性关节炎的治疗作用。方法:16只3-4个月龄新西兰大白兔(雌雄不限)随机分为四组,每组四只,分为正常组,对照组,IL-1Ra组,TGF-β1组,正常组仅打开左膝关节关节腔,剩余三组均给予左膝关节前交叉韧带离断术(anterior cruciate ligament transaction ACLT)。四周后IL-1Ra组给予关节腔内注射IL-1 Ra 5g/ml,TGF-β1组给予关节腔内注射TGF-β1 50mg/ml,每周两次,连续四周,正常组及对照组未采取任何措施。术后八周时采用空气栓塞法处死全部实验动物,取股骨远端长约1cm,固定后切片行细胞形态学观察。结果:大体肉眼观察:对照组股骨远端软骨面色颜色变暗并稍显粗糙,可见少量软骨脱落,其余两组关节软骨大体形态均接近正常。镜下观察:TGF-β1组软骨细胞增生明显,软骨细胞排列较正常软骨细胞排列轻度紊乱。IL-1Ra组软骨细胞增生数量未及TGF-β1组明显,软骨细胞排列也不及TGF-β1组规则。IL-1Ra组及TGF-β1组软骨细胞形态接近正常软骨细胞,基质染色接近正常。两组软骨膜表面光滑,无纤维细胞形成,软骨膜下未见纤维化。对照组软骨细胞数量明显减少且排列紊乱,软骨细胞形态发生改变,可见软骨细胞凋亡,镜下可见软骨细胞核浓缩、裂解,并可见新生软骨形成,突出于正常软骨膜表面,软骨膜表面下方可见血管翳及纤维母细胞形成,出现轻度纤维化。基质染色不均匀且染色较淡。结论:IL-1Ra及TGF-β1关节腔内注射均能有效抑制骨性关节炎关节软骨的退变并增加软骨细胞再生,促进软骨基质合成,延缓骨性关节炎的发病进程。     

体外诱导骨髓间充质干细胞向甲状腺滤泡细胞分化的实验研究

目的研究体外诱导SD大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)分化成甲状腺滤泡细胞的培养条件,探讨其对BMSCs向甲状腺滤泡细胞分化的诱导作用。方法实验分组:阴性对照组(B组)、阳性对照组(T组)、共培养组(C组)、诱导素组(F组)、共培养+诱导素组(C+F组)。倒置显微镜下观察各组诱导1周后细胞形态的变化;细胞免疫染色法检测甲状腺特有标记物的表达;RT-PCR分析诱导后细胞内甲状腺细胞相关基因表达水平。多组间均数比较使用单因素方差分析ANOVA,两组间资料差异比较采用t检验。结果 SD大鼠BMSCs (P3)诱导1周:(1)细胞免疫染色结果显示各实验组甲状腺转录因子TTF1和PAX8及钠/碘同向转运体(NIS)、甲状腺过氧化物酶(TPO)与甲状腺球蛋白(Tg)表达情况不同,其中以C+F组染色效果显著加深;(2)RT-PCR分析与C+F组比较,B组、C组、F组PAX8 (6.21±0.04,0.02±0.01,0.54±0.03,3.31±0.30,F=283.07,P 0.05)、TTF1 (0.33±0.04,0.03±0.01,0.15±0.03,0.08±0.02,F=73.36,P 0.05)、TG (14.90±2.00,0.10±0.05,1.61±0.40,1.91±0.39,F=134.03,P 0.05)mRNA水平下降。结论在体外BMSCs与FRTL-5间接接触共培养体系中添加TSH、胰岛素、转铁蛋白、生长抑素及氢化可的松可诱导BMSCs分化为表达甲状腺滤泡细胞特异抗原的细胞。     

柚皮苷和木犀草素联合应用对大鼠BMSCs诱导成骨过程中Wnt/β-cantein通路相关基因表达的影响

摘要 目的：探讨柚皮苷和木犀草素联合应用对大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）诱导成骨过程中Wnt/β-cantein通路相关基因表达的影响。方法：取大鼠股骨中提取的BMSCs,分别建立A组（空白组）、B组给予柚皮苷溶液10 μmol/L,C组给予木犀草素溶液5 μmol/L;D组给予骨碎补总黄酮溶液10 mg/mL;E组给予柚皮苷-木犀草素混合溶液配伍比为10 μmol/L：5 μmol/L,并诱导其向成骨细胞分化。应用碱性磷酸酶（ALP）染色及分光光度法检测第7 d各组细胞ALP活性。应用实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测第7 d各组细胞Wnt/β-cantein通路相关基因及成骨基因的表达。结果：B组、C组、D组、E组细胞562 nm波长下光密度（OD）值显著高于A组,E组细胞562 nm波长下OD值最高,显著高于B组、C组、D组（P＜0.05）。B组、C组、D组、E组细胞ALP、骨钙素（OCN）、Runt相关转录因子2（RUNX2）基因表达水平显著高于A组,E组ALP、OCN、RUNX2基因表达水平最高,显著高于B组、C组、D组（P＜0.05）。B组、C组、D组、E组细胞β-catenin、Cyclin D1基因表达水平显著高于A组;B组、E组LEF-1基因表达水平显著高于A组;E组β-catenin、LEF-1、Cyclin D1基因表达水平最高,显著高于B组、C组、D组（P＜0.05）。结论：柚皮苷和木犀草素均具有促进大鼠BMSCs增殖和诱导其成骨向分化的作用,柚皮苷和木犀草素联合应用诱导大鼠BMSCs增成骨作用最强,其主要机制与Wnt/β-cantein通路激活有关。     

D-半乳糖诱导大鼠骨髓基质细胞衰老

目的建立体外骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells,BMSSCs)衰老模型,分析衰老BMSCs生物学特性,为进一步研究衰老BMCs对造血细胞的影响奠定实验基础。方法雄性健康SD大鼠BMSCs全骨髓贴壁法体外培养,实验分为对照组和衰老模型组。对照组为常规培养48h;衰老模型组为常规培养基内加入D-半乳糖。CCK-8法测定BMSCs增殖能力;流式细胞术分析细胞周期;衰老特异性β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)染色观察衰老BMSCs百分率;酶学法检测BMSCs内过氧化物丙二醛(MDA)含量和总超氧化物歧化酶(SOD)活性,DCFH-DA流式荧光检测BMSCs活性氧簇(ROS)水平;Western Blotting检测BMSCs衰老相关信号蛋白P16、P21、P53的水平;ELISA检测BMSCs培养上清液中IL-1β、GM-CSF、SCF的含量。结果与对照组相比,衰老模型组BMSCs增殖能力显著下降;处于G1期的BMSCs比例增高、S期细胞比例降低,细胞阻滞于G1期;BMSCs SA-β-Gal染色阳性率显著上升;胞内ROS、MDA含量上升,SOD含量下降;P16、P21、P53水平明显上调;BMSCs培养上清液中IL-1β、GM-CSF、SCF含量明显下降。结论 D-半乳糖诱导骨髓基质细胞衰老可能与氧化损伤激活衰老相关信号通路有关,衰老骨髓基质细胞分泌活性造血生长因子减少。     

早期吸入不同浓度布地奈德对哮喘大鼠气道炎症和重构的干预

目的：研究早期吸入不同浓度布地奈德对哮喘大鼠气道炎症和气道重构的干预情况。方法i32只Wistar大鼠随机分为4组：A对照组8只,B卵蛋白（OVA）致哮喘组8只,C卵蛋白致哮喘后吸入低浓度布地奈德治疗组8只,D卵蛋白致哮喘后吸入高浓度布地奈德治疗组8只。分别测定各组大鼠血中肿瘤坏死因子-α（TNF-α）及肺泡灌洗液（BALF）中内皮素．1（ET-1）的水平,计数BALF中细胞总数及分类。各组大鼠行肺组织切片HE染色,再行胶原染色、免疫组化NGF、TGF-β1染色,借助计算机图象分析软件测量单位气道面积炎性细胞数目,基底膜周径（Pbm）、平滑肌面积（WArn）、气道内壁面积（WAi）、胶原面积（Wcol）,NGF及TGF-β1阳性信号积分吸光度。结果：B组BALF中细胞总数、嗜酸细胞分类及TNF—α、ET-1水平与A组比较均明显增加,差异有统计学意义（P〈0．01）,C组及D组较B组均明显降低,差异有统计学意义（P〈0．01）。B组NGF及TGF-β1的表达、气道壁炎性细胞计数、气道内壁面积、平滑肌面积、胶原面积与A组比较均明显增加,差异有统计学意义（P〈0．01）,C组及D组与B组比较均明显降低,差异有统计学意义（P〈0．01）,C组及D组与A组比较差异有统计学意义（P〈0．05,P〈0．01）,C组与D组差异均有统计学意义（P〈0．05,P〈0．01）。结论：早期吸入不同浓度的布地奈德均可明显抑制气道炎症和气道重构,高浓度较低浓度对气道炎症和气道重构的影响更明显。     

高密度微团培养法对人骨关节炎软骨细胞分化影响的实验研究

目的探讨高密度微团(Micromass)的细胞培养方法对人骨关节炎软骨细胞终末期成熟分化的作用影响。方法临床获取人骨关节炎关节软骨组织,分离骨关节炎软骨细胞,分别进行低密度单层培养和高密度微团培养,隔日细胞换液1次。每2日倒置显微镜观察细胞形态的变化;碱性磷酸酶(ALP)染色方法检测ALP的分泌;RT-PCT方法检测细胞内Col2、Aggrecan、ALP和MMP-13等因子mRNA的表达。结果人骨关节炎软骨细胞具有自发性向终末期成熟分化的特征,在相同时间点,Micromass培养的软骨细胞与低密度单层培养的细胞相比,更具有软骨细胞的形态特征;ALP染色显示,Micromass培养的细胞内ALP染色强度明显减弱;RT-PCT显示,Micromass培养的细胞内Col2和Aggrecan因子mRNA的表达显著提高(P0.05);ALP和MMP-13因子mRNA的表达显著降低(P0.05)。结论高密度微团培养法抑制人骨关节炎软骨细胞过快的成熟分化,更好的维持了细胞的软骨细胞表型。     

使用透明质酸钠复合海藻酸钠水凝胶球3D培养软骨细胞抑制细胞去分化的研究

目的:验证海藻酸钠(Alginate,Alg)水凝胶球添加透明质酸钠(Sodium hyaluronate,HA)后,对大鼠膝软骨细胞体外3D培养时软骨细胞去分化的抑制情况。方法:用Ⅱ型胶原酶消化法获取2周龄SD大鼠膝关节原代软骨细胞,体外培养传代至P2。细胞分为2组,1组用2%海藻酸钠水凝胶球3D培养(Alg组),另一组用2%海藻酸钠+1%透明质酸钠的水凝胶球3D培养(Alg/HA组),采用正交法制作海藻酸钠水凝胶球。培养14天后,两组各取水凝胶球进行死活细胞染色观察细胞状态。其他水凝胶球收集后用4%多聚甲醛固定,30%蔗糖溶液脱水,OCT(Optimal cutting temperature compound)包埋剂包埋切片,采用苏木精-伊红染色法(Hematoxylin-eosin staining,HE染色)、甲苯胺蓝染色观察软骨细胞形态;采用阿利新蓝染色观察对比糖胺聚糖(Glycosaminoglycan,GAG)含量;采用免疫荧光染色对比Ⅱ型胶原(Collagen typeⅡ,ColⅡ)含量;采用蛋白质免疫印迹法(Western blot)检测软骨细胞ColⅡ和聚蛋白多糖(Aggrecan,ACAN)的表达情况。结果:死活细胞染色显示两组水凝球内软骨细胞状态良好,几乎无死细胞;阿利新蓝染色显示Alg/HA组与Alg组相比软骨细胞分泌更多的GAG;免疫荧光染色显示Alg/HA组比Alg组软骨细胞内含更多的Ⅱ型胶原;Western blot显示Alg/HA组软骨细胞比Alg组ColⅡ的蛋白表达更多。结论:含透明质酸钠的海藻酸钠水凝胶可以更好地维持软骨细胞的表型,抑制软骨细胞去分化。