镁,钙子对组装于人工膜上CF0—CF1质子传导的影响

在电压箝位下,研究Ｍｇ＾２＋、Ｃａ＾２＋对重组于平板脂双层上ＣＦ０－ＣＦ１质子传导的影响,表明：（１）跨膜质子梯度０时（ΔｐＨ＝０）,在３０￣１５０ｍＶ范围内有大量的金Ｃａ＾２＋引起的正电流比在无金属离子溶液中的一定幅度的增加。在５０ｍＶ以上,Ｍｇ＾２＋比Ｃａ＾２＋有更大的促进正向电流的作用;（２）当ΔｐＨ＝３时,Ｍｇ＾２＋比Ｃａ＾２＋更有显著增加正向膜电流的作用,电压在０ｍＶ时就已显示出来;（３     

叶绿体H^＋—ATP酶在平板脂双层上重组及其质子传导的研究

从菠菜(Spinacia oleracea Mill.)叶中分离获得H~ -ATP酶(CF_0-CF_1)复合体。将CF_0-CF_1重组于平板脂双层上,在电压钳位下,研究CF_0～CF_1的质子传导性能,观察到:(1)当CF_0-CF_1重组于平板脂双层上后,平板膜电阻由10～20GΩ立即下降到1GΩ左右。(2)溶液中蛋白质(CF_0-CF_1)浓度在2mg/L下可记录到单通道电流的涨落,单位电导约在5～10pS。(3)通道电流随膜两侧ΔpH变化而改变,在ΔpH为2～4时,膜电流随ΔpH增加而增大,在ΔpH为4.5时膜电流呈现回落。(4)质子传导抑制剂Dicyclohexyl-carbodiimide(DCCD)显示出迅速地且不可逆地阻断通道电流。(5)无金属离子的溶液中,跨膜(BLM)的ΔpH为3时,在0～ 150mV钳位下,镁离子比钙离子所引起的CF_0-CF_1的通道电流要大得多。以上结果不仅表明CF_0-CF_1已成功地组装于人工膜上,而且也显示出镁离子直接参与了质子传导过程。     

菠菜能量转化复合体的人工组装

从菠菜叶绿体中分离了H~+-ATP酶复合体,其SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳呈九条亚单位带,为纯度较高的酶复合体。将H~+-ATP酶复合体重组于人工膜(脂质体)上,表现出PiATP交换活力。Mg~(++)-ATP酶活力也明显提高。并表现对DCCD,寡霉素的敏感性。 重组H~+-ATP酶复合体表现有ATP诱导的H~+转移。但脂质体也出现类似现象,为此对以pH改变为标准的检测方法提出商榷。     

CF0质子传导对两光系统间光能分布的影响

用饱和闪光法测定类囊体中叶绿素荧光猝灭。观察到作用于质子通道ＣＦ０的氯化三苯基锡促进ｑＱ而降低ｑＥ,ＤＣＣＤ无此作用。在解联条件下或在高盐介质中ＴＰＴ对ｑＱ的促进作用消失;在Ｈ２Ｏ－ＰＤ０Ｘ或Ｈ２Ｏ－ＰＢＱ电子传递系统中此促进作用亦消失;用调制荧光法或低温荧光测定均表现ＴＰＴ增加了两光系统间光能分布的不平衡,有利于光能在ＰＳＩＩ的分布。     

二硫苏糖醇对叶绿体H~＋－ATP酶复合体CF_0的修饰

ＤＴＴ（二流苏糖醇）可解除ＴＰＴ（氯化三苯锡）对叶绿体光合磷酸化的抑制、减弱ＴＰＴ对类囊体跨膜△ｐＨ的抑制和对类囊体腔内质子外流的促进。由于ＴＰＴ较专一作用于ＣＦ０,推测ＣＦ０受ＤＴＴ修饰。这从ＤＴＴ可消除ＴＰＴ对去除ＣＦ１的类囊体残缺膜△ｐＨ的重建和对残缺膜光下收缩的促进得到进一步的证明。ＤＴＴ的作用是还原二硫键成为游离的巯基,因而ＣＦ０可能含有二硫键。从光下ＤＴＴ或暗中ＤＴＴ处理残缺膜对ＴＰＴ作用的影响,可以看到ＤＴＴ对ＣＦ０的修饰是需光的,类囊体膜在光下发生的构象变化,使ＣＦ０的二硫键暴露而被ＤＴＴ修饰。ＣＦ０的二硫键较ＣＦ１γ的二硫键更快、更敏感地被ＤＴＴ所修饰。     

胡杨液泡膜微囊的纯化及其质子转运活性

 为进一步研究液泡膜及 H+ - ATP酶在胡杨抵御盐胁迫中所起的作用 ,比较了研磨、捣碎和超声破碎三种细胞破碎方法 ,从悬浮培养的胡杨细胞中制备液泡膜微囊的效果 ;并用差速离心和不连续蔗糖密度梯度离心纯化了胡杨液泡膜微囊 .通过测定 H+ - ATP酶对 NO-3 、VO3-4和 Na N3的敏感性 ,以及焦磷酸酶质子转运活性表明 ,液泡膜微囊主要分布在 0 %～ 2 5%的蔗糖界面上 .捣碎法破碎细胞结合差速离心和蔗糖密度梯度离心可获得正向微囊比例高、封闭性好和酶活性高的液泡膜微囊     

重装于平板脂双层膜的叶绿体CF_0－CF_1复合体的通透特性

叶绿体Ｈ＋－ＡＴＰａｓｅ（ＣＦ０－ＣＦ１复合体）是光合磷酸化系统能量转换的关键装置。本工作报告,从菠菜提取、纯化了这种复合体,并成功地将其重装于平板磷脂双层膜。在电压钳位下,观察到,随着ＣＦ０－ＣＦ１复合体的参入,出现跨膜通道样活动电导变化,这种变化可被Ｄｉｃｙｃｌｏｈｅｘｌ－ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ（ＤＣＣＤ）所抑制;参入了ＣＦ０－ＣＦ１复合体的脂双层的稳态膜电导随膜两侧Ｈ＋浓度梯度的提高而增大。     

Mg~(2 )对巯基修饰类囊体膜H~ -ATP酶的质子传导途径的调节效应

镁离子为巯基修饰类囊体还原型H~ -ATP酶光活化所必需。介质中MgCl_2浓度由2mmol/L增加到10mmol/L时,解联剂NH_4Cl对H~ -ATP酶光活化的抑制作用明显减弱,而对跨膜⊿pH的消除效应并未减轻。介质中Mg~(2 )浓度的增加不影响DCMU对H~ -ATP酶光活化的抑制作用。 介质中含40μmol/LADP时,低浓度NH_4Cl对H~ -ATP酶催化的刺激效应被消除,仅呈现抑制作用。这种NH_4Cl对H~ -ATP酶催化活性的抑制作用随着反应介质中Mg~(2 )浓度的增加而降低,因此认为Mg~(2 )参与质子传导途径的调节。     

三苯基锡,二环己基碳二亚胺和寡霉素对叶绿体CF0与CF1功能联系的影响

作用于H~ —ATP酶复合体质子通道的能量传递抑制剂 TPT、DQCD和 OM能明显抑制叶绿体光合磷酸化反应和膜上 ATP酶活性,减小恒态ΛpH值,加速ΛpH和515 nm吸收衰减。这种在正常叶绿体加速H_(in)~ 经CF_0外流与在残缺膜中阻塞质子外流不一致。TPT等物质是干扰了CF_0与CF_1的构象连接,使 CF_0的质子传导失去CF_1的控制,H_(in)~ 无效漏失或质子逆向转移受影响,从而抑制与质子传导紧密相关的光合磷酸化反应和膜上ATP酶活性。     

乙醇对F_1-ATP酶和H~+-ATP酶的抑制与其核苷酸结合位点状态的关系

 本文利用动力学方法研究了乙醇对F_1-ATP酶和H~(+)-ATP酶复合体的抑制与其结合核苷酸位点状态的关系,结果表明天然情况下乙醇对F_1呈现反竞争性抑制类型,对H~(+)-ATP酶呈现非竞争性抑制类型,且乙醇对F_1和H~(+)-ATP酶的抑制与核苷酸结合位点的构象密切相关。游离状态下和膜结合状态下的F_1在部分结合的核苷酸被洗脱前后动力学行为的不同,反映了二种状态下的F_1具有不同的构象,且F_0和膜脂对F_1起着一定的调控作用。     

Proton-Conductivity of CF0-CF1 Reconstructed into Planar Lipid Bilayer

The proton conductable ATP synthase (CF0-CF1) is the key enzyme of energy conversion in the membrane of bacteria, mitochondria and chloroplast. In spite of a large body of studies, the structure and molecular mechanism of ATP synthases are still elusive. In order to learn the mechanism of ATP synthases, the authors used voltage-olamp technique to study the effect of different conditions on the proton conductance of F0-F1 into planar lipid bilayer membrane. The results obtained were as follows: (1) When CF0-CF1 was reconstructed into planar lipid bilayer membrane, the resistance decreased by 10 times. (2) Channel-like current was recorded at the low concentration of CF0-CFl(protein 2 mg/L) in the solution. (3) In metal ion-free solution, the channel currents changed with the trans-membrane proton gradient (ApH). Under holding potential from 0 to + 150 mV, the stimulation of △pH on channel current increased with a rise in the ApH from 2 to 4, the stimulation of 4.5 △pH on channel current was weaker than that of △pH 4.0. (4) The proton conduetance inhibitor, dicyclohexylcarbodiimide (DCCD), showed a rapid and irreversible inhibition effect on the channel current. (5) In metal ion-free solution (10 mmol/L Tris-HC1), when the ApH across the black lipid membrane (BLM) maintained at 3.0, the addition of Mg2 + caused a alger channel current of CF0-CF1 than the addition of Ca2+ , with holding potential from 0 to + 150 mV. The results indicated that reconstruction of CF0-CF1 was successful and Mg2 + was directly involved in the proton conductance pathways.     

利用CHAPS分离豌豆叶绿体偶联因子复合物

近年来不少工作者对叶绿体偶联因子复合物的结构、功能和发生的问题颇为关注(程秋琛等 1986,Merchant等 1985,Nelson 1982,Pick等1979,Strontman等1983,Suss等 1983)。分离生物膜蛋白质的     

多粘菌素B对类囊体膜上M_g~(2+)-ATPase功能的影响及其作用部位

多粘菌素B抑制类囊体膜上的Mg~(2+)-ATP酶活力,且其部分抑制作用受控于高能态。如将酶反应速度和[Mg~(2+)ATP]的浓度作双倒数图,则可观察到多粘菌素B和[Mg~(2+)ATP]浓度之间存在着类似竞争的关系。再经用多粘菌素B抑制游离的β亚单位的活力。证明多粘菌素B在偶联因子上的作用部位是在β亚单位上。     

大麦根质膜微囊的制备及其H~ ,Ca~(2 )转运活性

用蔗糖密度梯度离心法制备出密闭程度较高的大麦根细胞质膜微囊。喹吖咽荧光猝灭和~(45)Ca~(2 )同位素示踪测定表明所制备的微囊具H~ ,Ca~(2 )转运活性。对制备出的质膜制剂纯度和膜朝向进行了分析,并探讨了质膜纯化中影响膜微囊密闭性的因素。匀浆液和悬浮液巾的单价离子盐有利于密闭膜微囊的形成。蔗糖密度梯度和葡聚糖密度睇度离心法均可得到密闭性较高的膜微囊,但后者的纯化效果较差。     

GM3与Ca~(2+)-ATP酶的重建及其冷冻断裂电镜观察

应用生物膜的分离与重建技术 ,将GM3、大豆磷脂与肌质网Ca2 + ATP酶共同重建在脂质体上 ,酶活力明显增加 .经负染、冷冻断裂复型后电镜等形态学方法证实形成的脂酶体囊泡封闭性好 ,脂酶体上Ca2 + ATP酶蛋白颗粒均匀、直径增大     

大麦根细胞质膜Ca~(2+)转运系统对盐胁迫的反应

大麦幼苗经短时间盐处理,尚未发生伤害时,虽然质膜上需Mg~(2+)和不需Mg~(2+)的两个Ca~(2+)转运系统的转运能力均基本未变,但两者的动力学特征却有所不同。在盐处理3h内,不需Mg~(2+)的Ca~(2+)转运过程对Ca~(2+)的亲和力便明显降低,而需Mg~(2+)的Ca~(2+)转运过程对Ca~(2+)的亲和力变化不大。较长时间盐处理,两个Ca~(2+)转运系统的转运能力和ATP亲和力均有不同程度的减小。这种减小与幼苗的伤害相伴出现,随处理时间加长而加剧。不同时间的盐处理下,质膜Ca~(2+)—ATP酶活性与不需Mg~(2+)的Ca~(2+)转运过程变化规律一致。Ca~(2+)—ATP酶受钙调素激活的特性在盐处理3h内即有所减小,至处理24h基本丧失。由动力学分析结果推测,短时间盐胁迫下质膜上两个Ca~(2+)转运系统的不同变化是植物的一种调节反应,它们在钙信使系统传递胁迫信号的过程中起不同作用。Ca~(2+)—ATP酶驱动的初级Ca~(2+)转运系统可能与胁迫信号的传递有关,而次级Ca~(2+)转运系统即可能起着信息传递之后将剩余 Ca~(2+)运出胞外的功能。较长时间盐胁迫下两系统Ca~(2+)转运能力的降低则是一种伤害反应。     

The effect of external Ca^2＋ and Ca^2＋—channel modulators on red—light—induced swelling of protoplasts of Phaseolus radiatus L.

Red-light-induced swelling of the protoplasts isolated from hypocotyl of etiolated mung bean(Phaseolus radiatusL.)was observed only when Ca^2 ions were present in the medium.The optimal CaCl2 concentration was 250μM,Swlling response declined when Ca^2 was supplied into the medium after red light irradiation.The Ca^2 -chelator EGTA eliminated the red-light-induced swelling and 45Ca^2 accumulation in the protoplasts.In conltrast,A23187,a Ca^2 -ionophore,could mimic the effect of red light in darkness.These results indicate that Ca^2 may play a role in light signal transduction.In addition,swelling response was prevented by TFP and CPZ(both are CaM antagonists),implying the involvement of CaM in red-light-induced and Ca^2 -dependent protoplast swelling.     

低温处理对冬、春小麦细胞Ca^2＋时空变化的影响

用Fluo-3/AM染色,通过激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）方法,对静息态及连续降温条件下不同抗寒性小麦（Triticum aestivum L.）叶肉细胞原生质体[Ca^2 ]cyt（the free Ca^2 concentration in the cytoplasm）的时空变化进行了比较。结果表明,静息态下小麦原生质体整体荧光强度基本不变,暗示[Ca^2 ]cyt能维持在一稳定水平;同时,不同品种小麦间也显示了[Ca^2 ]cyt水平荧光强度的不同。温度由15℃连续降至约2℃时,抗寒冬小麦[Ca^2 ]cyt出现升高后的回复,2℃之后逐渐升高;冷敏感春小麦则无此回复过程,而是一直升高到最大值。推测这一不同的动态变化最终决定了植物在低温下产生冷适应的不同能力。这进一步为“Ca^2 是低温下生理信号的传导”这一假说提供了新的证据。