RNP免疫沉淀技术在斑马鱼胸苷酸合成酶基因翻译调控研究中的应用

为检测斑马鱼胸苷酸合成酶基因的表达产物TS蛋白在体内是否结合于自身的mRNA,并进一步检测TS蛋白与c-myc mRNA的结合情况。采用免疫沉淀结合得到相应的RNA,即RNP免疫沉淀技术,进一步结合RT-PCR技术分析与蛋白结合的核酸序列,并用Western蛋白印迹分析了TS蛋白。结果显示,人的TS106单克隆抗体可以免疫沉淀斑马鱼的TS蛋白,抗体免疫沉淀的核酸中含有TS mRNA和c-myc mRNA。在斑马鱼中,TS蛋白在体内结合于自身的TS mRNA,并能结合c-myc mRNA,参与基因的表达调控,阐明了TS的翻译调控机制在体内条件下的作用方式,同时也为构建斑马鱼抗肿瘤药理模型提供了理论基础。     

胸苷酸合成酶mRNA亲和多肽的鉴定及其对翻译过程的抑制作用

胸苷酸合成酶(thymidylate synthase, TS)是催化生物体内胸苷酸合成所必需的酶, 多年来一直作为肿瘤化疗的靶点. 研究表明, TS是一种RNA结合蛋白, 可以与其自身mRNA的2个位点结合, 使mRNA翻译受阻. 本文以mRNA体外展示技术进行了由大容量多肽库(>10¹³)中筛选胸苷酸合成酶mRNA亲和多肽的研究, 对随机库进行了12轮循环的选择及扩增. 结果表明, 与初始库相比, 经选择循环之后, 碱性氨基酸及芳香族的苯丙氨酸含量明显增加, 它们在TS RNA与蛋白质的相互作用中扮演着重要角色. 按其理化特性对每一随机位点的氨基酸进行分类, 并与初始库比较, 发现位点1, 12, 17和18具有明显的带正电荷的特性, 表明碱性侧链参与了与RNA的结合. 二级结构预测表明, 随着筛选的进行, 与TS mRNA 亲和的多肽显示出明显的螺旋倾向, 而且形成螺旋的区域富含碱性氨基酸. 凝胶迁移及体外翻译实验证实, 选择循环之后的多肽能够与TS mRNA高度亲和, 并能抑制TS mRNA的翻译. 本研究表明mRNA体外展示方法得到的亲和多肽可以用作新的TS RNA的翻译抑制剂, 并有可能成为一类新型的抗肿瘤药物.     

胸苷酸合成酶表达调控的分子机制

胸苷酸合成酶(thymidylate synthase,TS)是生物体内催化胸苷酸合成所必需的酶．多年来一直作为肿瘤化疗的重要靶酶。对TS基因调控机制的研究表明：基因扩增、转录、翻译和翻译后过程都参与了TS表达的调控。先前的研究表明：TS可与自身的mRNA结合形成TS-mRNA复合物,使mRNA翻译受阻,5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU)等抗代谢药物可与TS蛋白结合,结合后的复合物不能与TS mRNA作用,导致体内TS的表达升高,是肿瘤细胞产生抗药性的重要分子机制之一。现对TS基因表达调控研究进展、翻译调控与抗药性产生的分子机制进行综述。     

运用 mRNA 体外展示技术筛选胸苷酸合成酶 RNA 亲和肽

以体外选择方法筛选不同功能的核酸、肽和蛋白质是近年的研究热点, mRNA 体外展示是一种新兴的高效多肽选择技术,其基本原理是通过含嘌呤霉素寡核苷酸的 Linker 使 mRNA 与它编码的肽或蛋白质共价结合,形成 mRNA- 蛋白质融合体,这一方法已用于多种功能肽的鉴定 . 以 mRNA 体外展示技术进行了由大容量多肽库中 (>1013) 筛选胸苷酸合成酶 (thymidylate synthase , TS) RNA 亲和肽的研究,通过精密的实验设计,建立了一套完整有效的筛选方法,并对实验条件进行了优化 . 已进行了 8 轮筛选,结果表明,以 mRNA 体外展示技术获得的多肽分子,可以与 TS mRNA 亲和 . 将测序结果与初始肽库进行比较,发现亲和肽中碱性氨基酸及芳香族氨基酸含量明显增加,说明其在与 RNA 结合中具有重要作用 . mRNA 展示技术作为一种大容量文库的体外筛选方法,将广泛应用于与固定化靶物质具高度亲和性及特异性的多肽和蛋白质的筛选 .     

胸苷酸合成酶的表达对原发大肠癌患者预后的影响

目的:研究表明大肠癌组织内胸苷酸合成酶(thymidylate systhase,TS)是独立于分期之外影响大肠癌预后的影响因子,TS高水平表达是预后的不良因素,并且与大肠癌患者应用氟脲嘧啶类或其衍生物类药物化疗疗效有关.本研究是探讨对于接受根治术后应用5-氟脲嘧啶或其衍生物化疗的原发性大肠癌患者,TS表达水平高低对患者预后的判断价值.方法:应用免疫组化法检测了89例大肠癌患者的石腊组织标本的TS表达水平.患者为Dukes'A期、B期、C期原发性大肠癌,均接受大肠癌根治术,术后接受5.氟脲嘧啶或其衍生物的4～6周期的化疗.结果:癌组织中TS表达水平比正常组织中TS表达水平高(67.8%vs 5.1%,P＜0.01).TS低表达患者与TS高表达患者总生存期、无病生存期无差异(P=0.1785,P=0.0798),多因素分析显示分期是唯一与生存期有关因素.结论:癌组织TS表达水平高低不能预测接受大肠癌根治术且术后接受5-氟脲嘧啶或其衍生物化疗的原发性大肠癌患者的预后,但TS表达水平高的患者可能从辅助化疗中获益.     

应用变性高效液相色谱技术建立胸苷酸合成酶基因多态检测平台

TS基因5′非翻译区(5′ untranslation region, 5′UTR)增强子区域(TS enhancer region, TSER)存在28 bp的2次(2R)、3次(3R)的串联重复多态, 在3R等位基因第二次重复中还存在一个G→C的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms, SNPs), 同时在3′非翻译区(3′ untranslation region, 3′ UTR)存在6个碱基片段缺失/插入多态。这些多态形式的存在影响了TS基因mRNA的稳定和翻译效率, 并可导致不同TS基因型肿瘤患者对以5-fuorouracil (5-FU)为基础的化疗疗效产生差异。为提高TS基因型临床检测的效率和准确性, 方便、快捷、准确和自动化区分各种纯合及杂合基因型, 设计多重PCR反应, 同时扩增TS基因5′ 和3′ 非翻译区多态所处片段。利用DHPLC技术建立TS基因多态性检测平台, 在非变性条件下, 通过优化DHPLC 洗脱梯度, 同时检测5′ TSER区的串联重复多态和3′ UTR片段长度多态; 在变性条件下, 检测5′ TSER区单核苷酸多态。同时采用PCR-RFLP和DNA 测序方法, 验证DHPLC分析结果。     

Reverse ChIP:研究DNA-蛋白质相互作用的新方法

反向染色质免疫共沉淀技术(reverse chromatin immunoprecipitation assay,Reverse ChIP)是一种在体内状态下分析DNA-蛋白质相互作用的新方法.它用特异的核酸探针捕获靶DNA片段及与其相结合的蛋白质,蛋白质用质谱仪检测,以达到确定靶DNA位点全部相关蛋白质的目的.其可对靶DNA位点相关蛋白质进行全面、系统地鉴定,特别是寻找已知DNA元件相应的调节蛋白.在发现、鉴定靶DNA位点相关蛋白质和研究DNA-蛋白质相互作用中有重要应用价值.     

结构域相互作用数据库的产生、发展与应用

结构域是进化上的保守序列单元,是蛋白质的结构和功能的标准组件．典型的两个蛋白质间的相互作用涉及特殊结构域间的结合,而且识别相互作用结构域对于在结构域水平上彻底理解蛋白质的功能与进化、构建蛋白质相互作用网络、分析生物学通路等十分重要．目前,依赖于对实验数据的进一步挖掘和对各种不同输入数据的计算预测,已识别出了一些相互作用/功能连锁结构域对,并由此构建了内容丰富、日益更新的结构域相互作用数据库．综述了产生结构域相互作用的8种计算预测方法．介绍了5个结构域相互作用公共数据库3DID、iPfam、InterDom、DIMA和DOMINE的有关信息和最新动态．实例概述了结构域相互作用在蛋白质相互作用计算预测、可信度评估,蛋白质结构域注释,以及在生物学通路分析中的应用．     

酿酒葡萄分支酸合成酶基因(VvCS)的克隆与表达分析

本研究以酿酒葡萄(Vitis vinifera)品种赤霞珠(Cabernet Sauvignon)及霞多丽(Chardonnay)为试材,采用in silico克隆和分子克隆相结合的策略,从果实中克隆到分支酸合成酶基因,命名为VvCS。该基因的cDNA编码区全长1312bp,编码436个氨基酸残基,预测其编码蛋白质分子量为46.9kD,等电点为7.8;生物信息学分析显示VvCS的DNA全长7117bp,包含13个外显子和12个内含子,定位于葡萄的第13号染色体上。VvCS编码的蛋白与其它植物来源的分支酸合成酶在氨基酸水平上的同源性为75%左右;实时荧光定量PCR分析表明VvCS在葡萄果实、茎、叶和叶柄组织中均有表达,且在果皮、果肉和种子中的表达变化趋势相似,与盛花后5周的果实相比,盛花后11周果实各部位中VvCS表达丰度均有不同程度增加。     

DNA甲基化转移酶抑制剂与胸苷酸合成酶抑制剂体外联合用药的抗肿瘤增效作用

通过在体外分别对DNA甲基化转移酶（DNA methyhransferase,DNMT）抑制剂5-氮杂胞苷（5-azacytidine,5-aza—C）和新型胸苷酸合成酶抑制剂盐酸洛拉曲克（nolatrexed dihydrochloride．Nolatrexed）联合用药于人大肠癌细胞LoVo和人肝癌细胞Hep3B的相互作用性质的观察,探讨DNMT抑制剂和胸苷酸合成酶抑制剂联合用药的可能性．使用MTT法测定二者单独用药或联合用药的抗肿瘤活性,用抑制浓度的分数之和（sum of fractional inhibitory concentration,SFIC）值及等效剂量分析方法（isobologram）评价联合用药的作用性质．结果显示,联合用药时其SFIC值均小于或等于1,由此得到的等效剂量曲线图形表现为凹形．可见,5-aza—C和Nolatrexed体外联合用药抗肿瘤相互作用性质为明显的增效作用,DNMT抑制剂和胸苷酸合成酶抑制剂联合用药达到抗肿瘤增效作用是可行的．     

百合查尔酮合成酶基因的克隆与分析

以西伯利亚百合为试材,通过半巢式PCR和RT-PCR技术分别克隆了查尔酮合成酶基因(CHS)的DNA和cDNA.生物信息学分析显示,CHS的DNA序列全长1 397 bp(登录号HM622754),包含2个外显子和1个内含子;cDNA序列编码区全长1 182 bp(登录号HQ161731),编码393个氨基酸,具有3个典型的CHS蛋白结构域:N-末端结构域(Lys3-Pro229)、C-末端结构域(Gln239-Pro389)和聚合酶Ⅲ结构域(Met1-Thr391);不同百合品种的CHS基因编码的氨基酸序列相似性高达98%,表明百合CHS基因在进化上呈现出十分保守的趋势;不同植物CHS基因序列的系统进化邻接树结果表明:百合与单子叶植物鸢尾及禾本科的水稻、大麦、玉米等亲缘关系更为接近.     

新疆3种藜科盐生植物NHX基因的克隆与序列分析比较

从新疆野生植物盐角草(Salicornia europaea)、盐爪爪(Kalidium foliatum)和盐穗木(Halostachys caspica)中分别克隆了约1.7kb的NHX基因cDNA片段,此片段均包含了NHX完整基因,三者之间有较高的同源性,盐角草NHX基因与盐爪爪NHX基因同源性达92.81%,盐角草与盐穗木同源性达92.19%,盐爪爪与盐穗木同源性达97.66%.它们与其它几种藜科盐生植物如滨藜、碱蓬、灰绿藜的NHX基因同源性也很高,达到80%以上,与拟南芥同源性也达到86%.此基因在植物尤其是藜科盐生植物中高度保守,其编码的功能性蛋白可能在影响植物耐盐中起作用.     

不同日龄大白猪视黄酸受体α基因组织表达

研究采用RT-PCR方法对大白猪的视黄酸受体α基因在1日龄、90日龄、180日龄、270日龄和360日龄的心、肝、胃、脾、肾、肺、大肠、小肠、肌肉、子宫、卵巢共11个组织的表达情况进行了研究。结果表明,RARαmRNA在肝、脾、肾、大肠、小肠、子宫和卵巢中持续表达,其中脾、大肠和小肠是持续高表达;180日龄时,所有组织的RARαmRNA的表达量普遍降低;360日龄时,所检的11个组织均高水平表达该基因。     

苏云金芽孢杆菌芽孢萌发相关基因gerM的克隆及功能研究

依照蜡状芽孢杆菌gerM基因的保守序列设计引物,从苏云金芽孢杆菌中扩增出640bp的DNA片段。以此为探针,从苏云金芽孢杆菌部分基因组酶切文库中成功地克隆到了一个4·5kb的DNA片段。序列分析表明,该片段包含一个完整的开放阅读框,其预测的编码产物与枯草芽孢杆菌GerM蛋白具有很高的同源性,将该基因命名为gerM。RT-PCR分析表明,gerM基因仅在芽孢形成的过程中表达。通过同源重组的策略构建了gerM基因的阻断突变株。研究表明,gerM基因的破坏影响苏云金芽孢杆菌芽孢萌发的速率和比例。     

马铃薯S病毒RT-PCR检测技术的研究

从感染PVS病毒的马铃薯病叶组织中提取出病毒的RNA,进行反转录cDNA的合成,用特异性引物进行PCR扩增,得到一条长度约为199 bp的特异性PCR扩增产物,与理论设计的外壳蛋白基因大小一致。在基因水平上为PVS的检测提供了一种快速、灵敏、简便的新方法,为PVS的防治提供了有效手段。     

小鼠IL-18基因的克隆及真核表达载体的构建

研究ＩＬ－１８是否具有对造血功能调控的作用。采用常规分子生物学技术,从小鼠骨髓细胞中克隆了含信号肽序列的ＩＬ－１８,构建了表达载体。经序列测定表明所克隆的ＩＬ－１８序列与文献报道的一致,构建的真核表达载体正确。     

利用逆转录酶的聚合酶链式反应检测外周血中的肿瘤细胞

本文就RT－PCR技术检测外周血中肿瘤细胞的基本原理及其在黑色素瘤,肝癌,乳腺癌,结直肠癌,前列腺癌等检测中的应用加以综述。     

我国河南与北京腹泻患儿中的星状病毒感染

人星状病毒（ＨＡｓｔＶ）是ＲＮＡ病毒的新家族,从我国河南和北京两地区的急性腹泻患儿便样中鉴定了７株星状病毒,经电镜观察病毒颗粒直径约为２８ｎｍ,表面呈五角或六角星状形态,用ＲＴ－ＰＣＲ检定为阳性,比较ＰＣＲ扩增产物的核苷酸序列构建的序列同源性树表明,１９９０年在河南流行的星状病毒主要为ＨＡｓｔＶ－１,另有一株ＨＡｓｔＶ－５,１９９６年北京流行株为ＨＡｓｔＶ－５。对ＨＡｓｔＶ患儿的临床症状进行了讨论