HBcAg基因在甲醇型酵母中的表达、产物纯化及其性质的初步研究

为研究乙肝核心抗原蛋白(HBcAg)在甲醇型酵母(PichiaPastoris)中的表达和性质,用PCR方法将HBcAg基因(L)克隆到P.Pastoris胞内表达载体pPIC3k中,并利用电击和同源重组法,将重组质粒pPIC3kL转化感受态的甲醇型GS115酵母菌株。经过筛选得到阳性P.Pastoris重组子。重组菌株经甲醇诱导培养,表达产物的Western印迹结果表明,HBcAg蛋白能在甲醇型酵母(PichiaPastoris)中诱导表达,产物为一215kDa的蛋白。经蔗糖密度梯度超离心和CsCl密度梯度超离心纯化后,ELISA和密度测定结果表明重组HBcAg蛋白主要分布在密度为12576gml和13013gml的2个峰值处。电镜观察表明,该重组HBcAg蛋白能自主装配成大小不同的2种颗粒(即核心颗粒),大颗粒直径约34nm左右,小颗粒直径约30nm左右。同时,我们还观察到,该核心蛋白颗粒在体外可发生集聚现象。     

乙型肝炎病毒PreS2S基因在毕赤酵母中表达的研究

构建重组质粒PHIL-D2/PreS2S以研究乙肝病毒PreS2(120-146)S基因编码蛋白在毕赤酵母中的表达。通过PCR扩增获得PreS2S片段,插入含AOX1启动子的Pichia Pastoris表达载体PHIL-D2中,构建重组表达质粒PHIL-D2/PreS2S,转化酵母宿主菌GS115。挑取阳性克隆摇床培养,甲醇诱导表达。通过ELISA、RPHA鉴定表达产物。成功构建了PHIL-D2/PreS2S真核表达载体,经过序列分析,插入的基因为在中国流行的adr亚型。在毕赤酵母中重组载体表达了S蛋白,S蛋白的表达量为34.9 mg/L,PreS2抗原检测为强阳性。利用毕赤酵母表达系统能够有效地表达乙型肝炎病毒的PreS2S蛋白,PreS2S蛋白具有良好的生物学活性。     

在甲醇酵母Pichia pastoris胞内表达有活性的辣根过氧化物酶

为了开辟在甲醇酵母 Pichia pastoris中表达 HRP的新途径 ,将编码成熟 HRP同功酶 C基因克隆到表达载体 p PIK3.5K中 .p PIK3.5KHRP转化 GS1 1 5后 ,用 PCR筛选阳性 P.pastoris重组株 ,并用甲醇进行诱导 . Western印迹杂交分析表明目标蛋白 (约为 38k D)能被天然 HRP的多克隆抗体所识别 ,因此活性辣根过氧化物酶已在 P.pastoris胞内表达 .筛选菌株中显示了明显的过氧化物酶活性 ,同时诱导过程中血红素和 Ca Cl2 的加入对过氧化物酶的活力影响不大     

HIV—1 P24截短体与gp41截短体的融合蛋白在大肠杆菌中的表达、纯化和鉴定

用基因重组技术将截短的HIV－1 p24基因和gp41基因连接成嵌合基因,插入质粒pGEX-4T3,构建成重组表达质粒pGEX-F。将pGEX-F转化大肠杆菌BL21。经IPTG诱导表达,pGEX-F在大肠杆菌BL21中获得了高效表达。融合蛋白P24－gp41经Glutathione-Sepharose4B亲和层析纯化后,用间接ELISA和免疫印迹检测HIV抗体阳性血清和正常人血清,P24－gp41只与HIV抗体阳性血清反应,证明获得的融合蛋白P24－gp41有很强的抗原特异性和免疫反应性,具有较高的应用价值。     

里氏木霉内切葡萄糖苷酶Ⅳ在毕赤酵母中的表达

进行了内切葡萄糖苷酶Ⅳ（EGⅣ）在毕赤酵母（Pichia pastoris）表达系统中的表达。采用RT—PCR的方法从里氏木霉（Trichoderma reesei）中分离到eg4基因。将eg4基因与毕赤酵母表达载体pPICZαA连接,得到重组质粒pPICZαA-eg4。将该重组质粒线性化后转化毕赤酵母GS115,eg4基因通过同源重组被整合到毕赤酵母的染色体上,并处于酵母α因子的下游,得到重组菌株P.pastoris—EGⅣ1。在甲醇诱导下,重组菌株P.pastoris-EGⅣ1可以合成并分泌EGⅣ,培养液的CMC活力达到2．11U／mL。     

蓄势待发的印度生物技术产业

构建的重组表达质粒pPIC9K-HSA-IFNα-2b经限制性内切酶SalI酶切线性化后电转化巴斯德毕赤酵母菌（P.Pastoris）SMD1168,将阳性转化子用甲醇诱导表达并进行PCR鉴定和Mut表型鉴定,再用Western-Blot法及Wish细胞-VSV病毒系统来鉴定表达蛋白的免疫原性及生物活性,同时,在摇瓶培养条件下,初步研究了甲醇诱导浓度及菌体诱导的起始OD值两因素对目的蛋白表达量的影响,本研究成功表达出具有高生物学活性的白蛋白融合干扰素蛋白（HSA-IFNα-2b）,对摇瓶发酵表达条件的初步摸索也为进一步在大规模发酵中提高目的蛋白在P.Pastoris的表达水平提供一个参考依据。     

共表达内质网响应蛋白HAC1对α-半乳糖苷酶在毕氏酵母中表达的影响

为提高毕氏酵母(Pichia pastoris)中重组α-半乳糖苷酶的表达,将来源于P.pastoris GS115的hac1基因构建至pPIC9K表达载体中,转化到重组P.pastoris中与α-半乳糖苷酶共表达。研究结果表明,在AOX1启动子控制下,HAC1过表达提高了重组P.pastoris中α-半乳糖苷酶蛋白表达含量,使α-半乳糖苷酶活性提高了2.2倍。经PCR产物鉴定,结果表明重组P.pastoris基因组中插入hac1基因。经50 L发酵罐甲醇诱导168 h,Gal-HAC1-4#工程菌最终酶活达到6 560 U/mL,比Gal-21#工程菌提高了27%。甲醇诱导后Gal-HAC1-4#发酵液中粗蛋白浓度均高于Gal-21#工程菌。表明共表达HAC1蛋白可提高毕氏酵母产α-半乳糖苷酶蛋白的能力。     

猪瘟病毒E2基因在Pichia pastoris中的表达及其免疫活性的初步研究

将猪瘟病毒的E2基因克隆入酵母分泌型表达载体pPIC9K中,酶切线性化后电穿孔导入Pichia pastoris进行整合,经G418筛选得到高拷贝转化子,甲醇诱导表达。SDS－PAGE和Western blit结果证实了酵母培养上清液中含有E2蛋白。免疫活性研究证明P.pastoris表达的E2蛋白能刺激动物产生抗猪瘟病毒的抗体。     

α-2b干扰素重组质粒的建立及在毕赤酵母中的表达

目的:采用基因工程手段构建基因工程菌表达α-2b干扰素。方法:根据毕赤酵母密码子嗜好性原理设计并合成α-2b干扰素基因序列,将其插入到毕赤酵母Pichia pastoris的分泌型表达质粒pPIC9K中,得到重组分泌表达质粒pPIC9K-IFNα-2b,并用电转化法转化P.pastoris GS115。筛选出整合型His Muts菌株,进一步用G418筛选获得高拷贝转化子,经5d诱导表达后SDS-PAGE检测。结果:菌落PCR和序列测定结果显示重组表达质粒已成功构建,SDS-PAGE结果显示目的蛋白已成功表达。结论:在毕赤酵母中成功表达α-2b干扰素。     

细极链格孢菌peaT2基因在毕赤酵母中的表达及蛋白功能确定

从细极链格孢菌表达文库获得阳性克隆子,序列分析表明,克隆的DNA片段中含有完整的开放阅读框架,将该基因命名为peaT2(GenBank登录号为EF212880)。用PCR法扩增peaT2基因的编码序列并亚克隆到毕赤酵母表达系统的表达载体pPIC9K上,得到重组质粒pPIC9K/peaT2。重组质粒经SacⅠ线性化后用电穿孔法导入到毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115中,采用MD、G418-YPD平板和PCR法筛选Mut+表型,获得了分泌表达的重组毕赤酵母。随机挑取一菌株作为表达菌,用甲醇诱导PeaT2蛋白表达。SDS-PAGE及Western blot检测结果均表明PeaT2在毕赤酵母中成功地分泌表达。用peaT2基因的表达蛋白处理小麦种子,生物测定表明,表达蛋白能明显促进小麦的生长,具有蛋白激发子作用。     

虎源猫瘟热病毒VP2蛋白基因在毕赤酵母中的表达

克隆了虎源猫瘟热病毒VP 2蛋白基因并首次在Pichia pastoris酵母中进行了分泌表达。用特异性引物从虎源FPV中扩增出VP 2基因,将其克隆到pGEM-T载体中,得到重组质粒pTVP 2进行测序。用EcoR I和NotI双酶切pTVP 2,回收目的基因VP 2片段将其定向克隆到pPICZαA中,构建出重组质粒pPICZαAVP 2。将pPICZαAVP 2用SacI内切酶线性化后,电转化毕赤酵母细胞GS115,PCR法筛选阳性重组酵母,并用1%甲醇诱导表达。结果在重组酵母菌培养物上清中经SDS-PAGE检测到相对分子量约为32 kD的重组蛋白,W estern-b lotting证实该重组蛋白可以与FPV多克隆抗体发生特异性血清学反应,表明重组VP 2蛋白具有正确的空间构象,有望作为虎FPV感染的诊断和免疫预防用抗原。     

细极链格孢菌peaT2基因在毕赤酵母中的表达及蛋白功能确定

从细极链格孢菌表达文库获得阳性克隆子,序列分析表明,克隆的DNA片段中含有完整的开放阅读框架,将该基因命名为peaT2(GenBank登录号为EF212880)。用PCR法扩增peaT2基因的编码序列并亚克隆到毕赤酵母表达系统的表达载体pPIC9K上,得到重组质粒pPIC9K/peaT2。重组质粒经SacⅠ线性化后用电穿孔法导入到毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115中,采用MD、G418-YPD平板和PCR法筛选Mut 表型,获得了分泌表达的重组毕赤酵母。随机挑取一菌株作为表达菌,用甲醇诱导PeaT2蛋白表达。SDS-PAGE及Western blot检测结果均表明PeaT2在毕赤酵母中成功地分泌表达。用peaT2基因的表达蛋白处理小麦种子,生物测定表明,表达蛋白能明显促进小麦的生长,具有蛋白激发子作用。     

灰葡萄孢菌激发子pebC1在毕赤酵母中的分泌表达及其生物活性分析

为了实现激发子PebC1编码基因在毕赤酵母中的分泌表达,采用PCR方法从灰葡萄孢菌BC-4-2-2-1菌株中扩增获得激发子PebC1的编码序列,将其亚克隆至酵母分泌型表达载体pPIC9K中,以此片段构建了pPIC9K-pebC1重组表达质粒。重组表达质粒经Bgl Ⅱ线性化处理,电击转化至毕赤酵母宿主菌GS115,经MD、G418-YPD平板和PCR法筛选,获得了重组毕赤酵母菌GS115/pPIC9K-pebC1。用甲醇诱导重组酵母菌表达目标蛋白,发酵液经SDS-PAGE电泳分析,在约39 kDa处出现特异目标条带。Western blotting检测结果说明,重组表达产物具有良好的抗原性。生物活性检测表明,酵母重组表达蛋白PebC1能够诱导拟南芥和黄瓜幼苗对灰霉病的抗性。     

鲈鱼生长激素在甲醇酵母中的胞内表达

甲醇酵母pichia pastoris是一种理想的真核蛋白高水平表达系统.将鲈鱼(Lateolabrax japonicus)生长激素基因克隆到酵母整合型质粒载体pHIL-D2,经转化his4缺陷型酵母GS115,用PCR方法筛选阳性转化子,并用斑点印迹法筛选多拷贝转化子,经甲醇诱导表达,SDS-PAGE和蛋白质印迹杂交结果证实了表达产物为重组的鲈鱼生长激素.     

法氏囊病病毒vp2基因在酵母中的分泌表达及鉴定

应用Pichia酵母表达系统高效分泌表达了传染性传染性法氏囊病病毒vp2基因片段.首先用Primer5.0设计1对引物P1、P2,以插入IBDV vp2基因的PMD18-T-VP2载体为模板,扩增出带有终止密码子的1.4kb片段,将此片段正向亚克隆到酵母表达载体pPICZα-A上,将构建好的重组载体pPICZα-A-VP2用Sac Ⅰ内切酶线性化后,电击转化整合入Pichia PastorisX-33酵母菌,经高浓度ZeocinTM筛选、表型鉴定、诱导表达及表达产物的鉴定,得到高效表达vp2基因的酵母工程菌X-33/pPICZα-A-VP2.工程菌72h培养上清的SDS-PAGE电泳与免疫印迹结果显示,vp2基因表达产物大小约为55 kDa,比预期的41kDa大.凝胶薄层扫描结合Bradford蛋白质总含量测定结果表明,表达产物占工程菌培养上清总蛋白的28%,表达量可达23 mg/L.间接ELISA结果表明重组表达产物能够有效地区分法氏囊病病毒标准阳性与阴性血清.     

犬冠状病毒S蛋白主要抗原区基因片断的表达及免疫原性

应用Pichia pastoris酵母表达了犬冠状病毒大熊猫野毒株(CCV DXMV)S蛋白主要抗原区基因片断。用特异性引物扩增出CCV DXMV株S1基因片断,并将其克隆到pGEM-T载体中得到pTS1。用KpnI和Notl双酶切pTS1回收目的基因S1定向克隆到pPICZCαA中,构建出重组质粒pPICZCαAS1。将pPICZCαASl用SacI内切酶线性化后,电转化感受态GS115酵母细胞,用PCR法筛选阳性重组子。用1％的甲醇诱导重组酵母菌,取培养物上清进行重组蛋白的检测。结果重组酵母菌培养物上清用SDS-PAGE电泳可检测到相对分子量为106kDa大小的重组蛋白,Westem-blot证实该重组蛋白可以与CCV多克隆抗体发生特异性血清学反应。凝胶薄层扫描分析表明,3株重组酵母菌在1％甲醇诱导144h后,重组蛋白S1表达量约占培养物上清总蛋白量的6．6-8．6％左右。用重组蛋白S1免疫BALB／C小鼠3次后,小鼠血清CCV中和抗体可达1：8-1：16,表明重组S1蛋白具有一定的免疫原性。     

毕赤酵母Mut+和Muts重组子表达植酸酶基因及其表达物的酶学性质比较

将本实验室已成功构建的植酸酶基因表达载体pPIC9K-phyA酶切线性化后,通过原生质体法整合到巴氏毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115菌株细胞中,利用测定酶活、观察转化子在MM和MD平板上的生长情况以及PCR菌落鉴定,筛选出表型为甲醇利用缓慢型的重组子(His Muts)。在相同培养条件下比较甲醇利用缓慢型的重组子和Mut 重组子在表达植酸酶方面的异同。实验结果表明,诱导表达48h后,Mut 和MutS重组子表达的产物在SDS-PAGE胶上都出现了清晰的目的带。酶学性质测定表明,酶学性质无显著差异。     

鲤鱼生长激素在毕赤酵母中的表达

 将编码鲤鱼 (Cyprinuscarpio )生长激素 (GH)成熟肽的cDNA克隆到毕赤酵母 (P .pastoris)胞内表达载体pHIL D2中 ,构建重组表达质粒pHIL D2 GH .转化组氨酸缺陷型酵母GS115,获得表达鲤鱼GH的酵母工程菌 .经甲醇诱导 ,SDS PAGE和Western印迹检测表明 ,鲤鱼GH在酵母中得到表达 ,表达产物在胞内以可溶状态存在 ,具有鲤鱼GH的免疫活性 .用诱导后的酵母投喂罗非鱼 ,实验结果证实所构建的工程菌具有明显的促生长作用     

戊型肝炎病毒结构区ORF2蛋白在巴氏毕赤酵母中的胸内表达与纯化的初步研究

为寻求新型表达系统来研制戊型肝炎基因工程疫苗,利用甲醇营养型酵母pichia pastoris表达系统表达戊型肝炎病毒（HEV）结构区ORF2蛋白。采用PCR方法从HEV cDNA中扩增得到ORC2基因克隆到酵母表达载体pPIC3.5K上,构建成重组质粒pPIC3.5KORF2。该质粒转化酵母菌GS115,经G418筛选得到高拷贝转化子,转化菌株经Mut表型鉴定后,用含甲醇的培养基诱导表达,SDS－PAGE及ELISA筛选高表达活性菌株,放大培养后进行亲合层析纯化。在该系统中成功地表达了高生物活性的HEV ORF2蛋白,经亲和层析纯化后扫描分析重组蛋白分子量约为59kD,纯度可达96%。Wester blotting证实,它与HEV ORF2单克隆抗体有特异性反应。HEV结构区ORF2蛋白在甲醇营养型酵母中的成功表达,以及初步纯化得到的具有强免疫学活性的重组蛋白,为研究新型戊型肝炎基因工程苗奠定了基础。     

乙醇酸氧化酶基因在巴斯德毕赤氏酵母中的表达

将菠菜乙醇酸氧化酶基因片段克隆至表达载体pPIC3．5k。提取重组质粒,进行限制性酶切鉴定。重组质粒用Sal I酶切线性化,电导入法转化毕赤酵母(Pichia pastoris),在缺乏组氨酸的RDB平板筛选重组子,提取酵母的染色体基因组进行PCR扩增鉴定整合情况,用甲醇诱导表达。结果表明,SDS-PAGE电泳显示表达蛋白的分子量约为39．8kD,与文献报道的乙醇酸氧化酶分子量接近。酶的活力达到了40．8IU／g湿菌体,比不含有目的片断的对照菌酶活提高了17倍,确认了导入的乙醇酸氧化酶基因片段在酵母中高效表达。