基因组编辑技术及未来发展

基因组编辑技术是合成生物学的一项核心使能技术.CRISPR基因组编辑技术在生命科学领域掀起了一场全新的技术革命,助推了合成生物学快速发展.然而,目前CRISPR基因组编辑技术的性能尚有欠缺,智能设计、表达和投递系统等相关技术也不能满足医疗和农业领域的应用需求.未来基因组编辑技术的发展方向,一方面亟待开发更精准、高效、全...     

质粒拯救法克隆细菌基因组大片段

[目的]细菌基因组大片段尤其是基因簇的克隆与操作,是细菌基因功能分析的一个难点.基因组测序工作的不断完成和序列信息的大量积累,为细菌基因组:DNA的操作提供了方便.本文报道了利用细菌的全基因组信息和质粒拯救法的原理建立的一种克隆细菌基因组大片段的方法.[方法]首先,根据基因组序列信息,在待克隆片段的一侧扩增一段DNA,并将其克隆到自杀载体上构建打靶质粒,然后,将打靶质粒整合到细菌的基因组中构建重组菌,提取重组菌的基因组DNA,酶切,自连,转化,将自杀质粒与待克隆的目的片段一起拯救出来.最后,根据需要将拯救的DNA片段亚克隆到新的载体中.[结果]我们利用该方法克隆了布鲁氏菌中长度为11kb的virB操纵子,并构建了互补质粒.将该质粒导入到virB的突变株中后使virB操纵子的转录活性得到了恢复,表明该策略切实可行.[结论]这种重组克隆策略给我们提供了一种新的对细菌基因组大片段进行操作的方法.     

放线菌基因组大片段克隆载体及异源表达宿主改造的研究进展

大规模基因组测序发现放线菌基因组内包含有极丰富的天然产物合成基因, 是非常有价值的资源。放线菌基因组中负责天然产物合成的基因通常成簇存在。要想完整地克隆这些较大的基因簇并且进行功能研究, 或者通过异源表达激活原本沉默的天然产物合成基因簇, 需要大容量的载体系统和合适的异源宿主。本文重点介绍了放线菌中常用于基因组大片段克隆的载体及异源表达宿主改造的研究进展。     

构建丝状真菌大片段基因组文库载体DNA的制备

载体DNA的制备是构建大片段基因组文库的关键步骤之一,高质量载体DNA受到酶切、脱磷等因素的影响,以载体pBHYG为材料,优化了限制性内切酶胁HindⅢ酶切和小牛肠碱性磷酸酶(CLAP)脱磷的作用条件,并在T4连接酶作用下自连,通过胶回收纯化制备了可用于进一步构建大片段基因组文库的线性载体DNA。     

合成生物学技术的研究进展——DNA合成、组装与基因组编辑

合成生物学作为一门新兴学科,其目标主要有两点:一是利用非天然的分子使其出现生命的现象,也就是―人造生命‖;二是―改造生命‖,比如利用一种生命体的元件(或经过人工改造),组装到另一个生命体中,使其产生特定功能。无论是哪种目的,对生命遗传物质DNA的操作都非常关键,其具体包括DNA的从头合成、组装和编辑等。同时,这些使能技术的进步也促进了合成生物学其他领域的发展。本文介绍了DNA操作相关的合成生物学使能技术的最新进展。     

噬菌体基因组编辑技术及其研究进展

阐述了噬菌体的基因整合、缺失、点突变等内容,并汇总噬菌体的基因组编辑方法,旨在为噬菌体的进一步应用和研究作铺垫.     

大片段克隆载体研究进展

DNA克隆技术是分子生物学研究中一项重要的技术手段。自第一个质粒载体pSC1 0 1作为克隆载体以来 ,随着分子生物学技术的发展 ,克隆载体的整体结构、容载能力和转化效率都有了很大的改善。尤其是人类基因组计划的实施 ,产生了YAC和BAC克隆体系。随着植物基因组计划的进行 ,又产生了既能够克隆大片段DNA又能够将候选克隆直接通过农杆菌介导进行功能互补实验的载体。综述了几种常用大片段克隆载体YAC、BAC、BIBAC、PAC和TAC的特点及其应用 ,并对克隆载体的发展作了展望。     

甜菜多粘菌基因组片段的克隆4及PCR检测

根据资料报导设计引物，扩增Ｐｏｌｙｍｙｘａ ｂｅｔａｅ的基因组片段，钭其克隆在ＰＧＥＭ－３Ｚｆ（＋）质粒载体上，并通过双酶切、ＰＣＲ扩增和部分序列测定，证明克隆片段为Ｐ．ｂｅｔａｅ基因组片段。用扩增Ｐ．ｂｅｔａｅ基因组片段的引物 Ｐ．ｇｒａｍｉｎｉｓ侵染小麦和Ｏ．ｔｒａｓｓｉｃａｅ侵染豇豆根系抽提的总ＤＮＡ进行ＰＣＲ扩增，均未获得任何ＤＮＡ产物，进一步证实了上述结果。对移人病士２、３．５天的甜菜苗     

一种大肠杆菌快速连续CRISPR基因组编辑的新策略

【背景】通过CRISPR结合λ-Red同源重组技术进行染色体编辑是大肠杆菌遗传改造的重要手段。虽然目前已经有多个以CRISPR为基础的大肠杆菌基因组编辑策略,但这些方法往往涉及单独质粒消除、多片段组装等过程,存在效率低、操作繁琐、耗时长等问题。【目的】建立一种基于不同温度敏感程度的多种质粒协同使用的大肠杆菌快速、连续、高效的CRISPR基因组编辑方法,提高CRISPR在大肠杆菌基因编辑过程中的效率。【方法】将传统CRISPR方法中使用的pTarget质粒改造为RK2ts型温敏型质粒,并采用pTW-A/S两种抗性标记质粒交替使用的方法消除假阳性,实现质粒消除与下一步基因组编辑同步进行。【结果】在相同温度下RK2ts型质粒先于pSC101ts型质粒发生丢失,从而能够选择性缺失RK2ts型质粒pTW-A/S。同时实现pTW-A/S质粒的消除和下一轮基因整合过程中质粒与打靶片段的转入。利用该方法基因敲除/整合效率高达100%。通过对菌株BP01基因Bspan D与asp A进行高效连续整合,构建得到菌株BP03,成功提升产物β-丙氨酸的产量。【结论】建立起一种新的高效、方便、灵活的CRISPR/Cas9介导的大肠杆菌基因组连续编辑策略。通过这种不同温度敏感程度的多种质粒协同使用方法,一方面解决了传统方法中质粒消除繁琐等问题,另一方面也避免了大质粒多片段连接等步骤,并极大地缩短了实验周期,为代谢工程菌株改造提供有力工具。     

合成型酵母基因组重排技术

基因组的结构变异是生物体表型进化的重要驱动力之一。设计与合成酵母基因组为人工基因组结构变异提供了新途径。人工合成酿酒酵母基因组(Sc2.0)通过系统性地引入重排元件,赋予了基因组柔性可变的功能,可诱导产生 DNA 片段的删除、反转、复制、移位等基因组结构变异。合成型酵母基因组重排技术可实现菌株性状的快速进化,并且为研究基因组结构变异与表型变化间的关系提供了一种快速、全新的方法。综述了合成型酵母基因组重排技术的研究热点和技术进展,并展示了其在创新菌种中的应用价值。     

基于CRISPR/Cas系统的天然产物生物合成基因簇克隆和编辑技术

合成生物学和基因组测序技术的快速发展使挖掘和高效合成天然产物进入了一个全新的时代。由于多数原始菌株生长缓慢、难以培养及遗传改造困难等问题,导致天然产物生物合成基因簇的激活和高效表达受到严重制约。基于此,将原始菌株来源的基因簇转移到操作简便、遗传背景清晰的模式宿主中进行异源表达成为天然产物发现和产量提高的一种有效手段。其中,基因簇的克隆与编辑是实现天然产物异源表达的一个主要限速步骤。CRISPR/Cas技术的应用极大地提高了大型基因簇克隆和编辑的效率,有效促进了微生物来源新药的发现。本文针对基于CRISPR/Cas开发的基因簇克隆和编辑技术进行了系统梳理和全面总结,探讨相关技术在天然产物挖掘和高效合成中的应用及其重要意义。     

CRISPR /Cas9基因编辑技术在山羊和绵羊中的应用研究进展

CRISPR/Cas9系统是近年来新兴的一种基因编辑技术,可将特定DNA基因序列敲除、插入或定点突变,具有快捷、高效、精准、特异性高等特点,广泛地应用于遗传育种、生物医药和基因工程等研究领域。山羊和绵羊是重要的经济家畜动物和实验动物,利用CRISPR/Cas9基因编辑系统对羊进行遗传修饰,将加速品种改良,提高动物生产性能,获得更加优质的农副产品。主要对CRISPR/Cas9基因编辑技术的概述、作用机理及在羊乳"人源化"改造、提高肉品质、改善毛纤维质量等方面的应用研究进展及发展前景作简要阐述,以期为相关科研人员提供参考。     

CRISPR/Cas9在放线菌合成生物学研究中的应用和发展

放线菌是活性天然产物和抗生素药物的重要来源。利用合成生物学高效地开发其中丰富的天然产物资源,将为加速新药开发奠定坚实的基础。CRISPR/Cas9作为一种多功能基因编辑系统,因其便捷高效而被广泛应用于真核生物的遗传操作。但在原核生物尤其是放线菌中的应用仍处于起步阶段,机遇和挑战并存。本综述总结了目前CRISPR/Cas9系统在放线菌基因编辑和调控,以及活性天然产物的产量提升、生物合成机制解析和资源开发等方面的研究进展。同时,也对该系统在应用中面临的包括重组修复效率低,以及靶向切割效率不足等关键挑战进行了分析,并提出了相应的优化解决方法。随着CRISPR/Cas9在放线菌应用中的不断完善和发展,将极大地推动放线菌的合成生物学研究,促进其中天然产物资源的有效挖掘和应用开发。     

纳米粒子在CRISPR/Cas9基因治疗中的应用

CRISPR/Cas9基因编辑技术已成为基因治疗领域最有前景的工具。在临床应用中,对CRISPR/Cas9进行安全有效的递送一直是亟待解决的问题。纳米粒子,如脂基纳米粒子、聚合物纳米粒子、纳米金颗粒以及生物膜类纳米粒子等,因其生物相容性、安全性和可设计性等特点有望为基因治疗带来新的突破。文中首先对纳米粒子的特性和基因治疗中CRISPR/Cas9的发展进行了概述,然后详细归纳了纳米粒子在递送不同形式的CRISPR/Cas9中的应用,最后对纳米粒子介导的基因治疗的递送在未来面临的挑战和安全性等方面作出总结论述。     

Chromosome engineering in zygotes with CRISPR/Cas9

Deletions, duplications, and inversions of large genomic regions covering several genes are an important class of disease causing variants in humans. Modeling these structural variants in mice requires multistep processes in ES cells, which has limited their availability. Mutant mice containing small insertions, deletions, and single nucleotide polymorphisms can be reliably generated using CRISPR/Cas9 directly in mouse zygotes. Large structural variants can be generated using CRISPR/Cas9 in ES cells, but it has not been possible to generate these directly in zygotes. We now demonstrate the direct generation of deletions, duplications and inversions of up to one million base pairs by zygote injection. genesis 54:78–85, 2016. © 2016 The Authors. genesis Published by Wiley Periodicals, Inc.     

基于CRISPR/Cas9系统构建绵羊VASA基因敲入载体及验证

本研究旨在探索VASA基因在绵羊睾丸发育中的表达变化,并通过构建VASA基因敲入载体,为下一步进行绵羊生殖细胞体外诱导分化研究提供基础。采集性成熟前后即3月龄（3-month-old,3M）和9月龄（9-month-old,9M）绵羊睾丸组织,利用实时荧光定量PCR （quantitative real-time PCR,qPCR）和Western blotting技术分析VASA基因的差异表达,并利用免疫组织化学技术对VASA基因的表达定位进行分析。设计靶向VASA基因的向导RNA （guide RNA,gRNA）,并构建同源重组载体,进行质粒转染绵羊耳成纤维细胞。结合CRISPR/dCas9技术对VASA基因进行激活,进一步验证载体效率。结果表明,VASA基因随着绵羊睾丸发育,表达水平极显著增加（P<0.01）,且主要定位在精母细胞和圆形精子细胞中。利用CRISPR/Cas9系统构建了VASA基因敲入载体,联合pEGFP-PGK puro-VASA载体转染耳成纤维细胞,CRISPR/dCas9系统激活后,耳成纤维细胞成功表达VASA基因。结果提示,VASA基因在绵羊睾丸发育和精子发生中发挥潜在功能,且通过CRISPR/Cas9系统可在体外构建VASA基因敲入载体,为下一步探究VASA基因对绵羊雄性生殖细胞的发育和分化提供有效的研究手段。