三角帆蚌KuSPI基因的克隆及表达分析

Kuntiz型丝氨酸蛋白酶抑制剂(Kuntiz-type serine proteinase inhibitor,KuSPI)又称胰腺胰蛋白酶抑制剂,能够和相应的蛋白酶互作来调控生物体内的级联反应。本研究通过RACE克隆得到三角帆蚌KuSPI cDNA全序列共624 bp,包含38 bp和148 bp的5'和3'端UTR,ORF(open reading frame)438 bp,编码氨基酸145个,分子量为16 397.5 u,KuSPI氨基酸序列的同源性分析后发现其包含1个典型Kuntiz结构域,属于典型的KuSPI基因。qRT-PCR检测表明:KuSPI基因在闭壳肌、外套膜、肠、斧足、肝、血液、鳃、性腺和肾脏中均有表达,在外套膜中最高。利用嗜水气单胞菌进行诱导后发现,KuSPI基因在外套膜中表达量变化最大,呈现明显的先升高再降低趋势。外套膜是三角帆蚌先天免疫的首道防线,我们推测Ku SPI基因在其免疫反应中起到重要作用。     

三角帆蚌碳酸酐酶Ⅳ基因的克隆及表达分析

三角帆蚌碳酸酐酶Ⅳ(carbonic anhydraseⅣ, HcCA4)基因属于α-CA家族,这是一类含Zn2+的金属酶。α-CA家族加速了CO2和HCO3-之间的相互转化,并对软体动物碳酸钙(CaCO3)的形成、酸碱平衡、钙化和生物矿化起重要作用。本研究通过RACE的方法得到了HcCA4的全长cDNA,共3 043 bp,其中3'与5'端的UTR分别为137 bp、2 021 bp和885 bp的ORF (Open reading frame)区,共编码294个氨基酸,分子量为34.086 kD。对HcCA4的氨基酸序列进行同源性分析之后,发现一个完整的α-CA Superfamily结构域,证明HcCA4属于α-CA家族的基因。qRT-PCR结果表明:CA4基因在前端缘膜、中央膜、后端缘膜、斧足、肝、鳃、性腺和肾脏都有表达,在外套膜的前缘膜和中央膜,鳃中具有高表达。鳃是三角帆蚌呼吸器官,推测CA4参与呼吸作用;外套膜是三角帆蚌分泌矿化物质的关键组织,推测HcCA4参与珍珠层形成。     

三角帆蚌精氨酸酶基因的cDNA克隆与组织表达分析

精氨酸酶(Arginase,Arg)是生物体尿素循环当中一种标志性的酶类,它不但与生物体许多疾病相关,而且是目前用于治疗肿瘤和癌症的一种重要的工具酶。根据三角帆蚌消减杂交cDNA文库获得的EST序列,运用cDNA末端快速扩增(Rapid amplification of cDNA ends,RACE)技术获得三角帆蚌精氨酸酶基因的全长cDNA序列。生物信息学方法分析表明精氨酸酶基因cDNA序列长1720 bp,开放阅读框(651072)1008 bp,编码335个氨基酸,5端非编码区为64 bp,3端非编码区为648 bp,软件推测其编码蛋白相对分子量为36.81 kD。研究采用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)方法分析该基因在不同组织中的表达规律,结果表明,该基因在肝脏、胃、肠、鳃、心脏、外套膜、斧足共7个组织中都有表达,但主要集中在肝脏、胃和肠消化器官中表达。这可能说明低等的无脊椎动物三角帆蚌的精氨酸酶兼具有Ⅰ型和Ⅱ型精氨酸酶的特征和功能,既可以参与尿素循环,又可以在生理和病理过程中发挥重要作用,但还需进一步验证。       

三角帆蚌Hc-GSK3β基因鉴定及内壳色性状相关SNP筛选

为了探究三角帆蚌(Hyriopsis cumingii)糖原合成激酶-3β(GSK3β)基因对壳色的影响,研究采用RACE技术获得Hc-GSK3β基因cDNA全长1867 bp,其中包含1261 bp的ORF区编码420个氨基酸, ORF中含有一个S＿TKc结构域,该结构域序列高度保守。组织差异表达分析发现Hc-GSK3β基因在紫色蚌鳃、斧足、内脏团和边缘膜组织中表达量高于白色蚌的表达量(P<0.05),且在斧足和边缘膜表达差异水平达到极显著(P<0.01),而在紫色蚌闭壳肌组织中表达量显著低于白色蚌(P<0.05)。原位杂交(ISH)实验结果显示在三角帆蚌外套膜的外褶、中褶、內褶、背膜区和腹膜区均有阳性信号产生,且在外褶的信号表达较强烈。该基因经重测序比较,共鉴定出6个SNP位点,其中在C+185A位点的CA基因型在紫色蚌的分布频率显著高于白色三角帆蚌(P<0.05);在紫色蚌中, T+341G位点TT基因型三角帆蚌内壳颜色参数b值显著低于TG基因型(P<0.05)。研究表明, Hc-GSK3β基因参与了三角帆蚌壳色形成,筛选的SNP标记可用于三角帆蚌壳...     

三角帆蚌BPI/LBP基因cDNA的分子特征及表达分析

杀菌通透性增加蛋白/脂多糖结合蛋白(bactericidal permeability-increasing protein/LPS-binding protein,BPI/LBP)在生物体的免疫应答过程中发挥着重要作用,但是在三角帆蚌中未见其相关的研究。我们采用RACE法获得三角帆蚌BPI/LBP基因c DNA全长(Gen Bank KX363568),该基因序列全长为1 793 bp,5'非编码区(untranslated region,UTR)和3'UTR分别为65 bp和219 bp,开放阅读框(open reading frame,ORF)1 509 bp,共编码氨基酸502个。氨基酸序列包括BPI1和BPI2两个结构域,同源性分析其与一些已知物种的BPI/LBP基因氨基酸发现各物种间具有相似的结构域,属于典型的BPI/LBP基因。q RT-PCR(Quantitative Real-time PCR)分析结果表明BPI/LBP基因表达于血液、肠、肾脏、外套膜、肝、腮、闭壳肌、性腺和斧足9个正常组织,表达量最高的是血液,最低的是肝脏。利用嗜水气单胞菌诱导后检测发现,血液、外套膜变化趋势最为明显,均呈现出先升高再降低的趋势,在3 h或12 h达到最大值,之后开始逐渐下降并趋于稳定,我们推测BPI/LBP基因在三角帆蚌的免疫反应中发挥着重要的作用。     

池蝶蚌组织蛋白酶L基因的组织表达及免疫应激分析

应用cDNA文库筛查及同源片段克隆拼接技术,克隆了池蝶蚌组织蛋白酶L(Hs-CtsL)cDNA基因全长序列(GenBank注册号为JN604558)。其cDNA全长1152 bp,5′-非翻译区(Untranslated Region,UTR)长1 bp,3′-UTR长149 bp包括1个多聚腺苷信号AATAAA和Poly(A)尾巴,开放阅读框(Open reading frame ORF)为1002 bp,编码333个氨基酸组成的多肽链。其分子量约37.7 kD,理论等电点为7.16,包含信号肽、前体域和成熟域。系统进化分析显示,Hs-CtsL同无脊椎动物组织蛋白酶L聚为一支,且同三角帆蚌亲缘关系最近,其次为褶纹冠蚌。组织表达分析结果显示,池蝶蚌组织蛋白酶L在肠、鳃、性腺、外套膜、斧足、闭壳肌、血细胞、肝胰腺、肾和心脏均有表达,其中血细胞中表达量最高。应激实验表明,经嗜水气单胞菌刺激后,Hs-CtsL在血细胞、鳃、肝胰腺和外套膜中的表达量显著上调。其中在肝胰腺中刺激后6h表达量到达峰值,在血细胞、鳃和外套膜中的表达模式近似,表现为一个波动变化,在4h、12h和48h被上调。结果暗示着Hs-CtsL除参与了池蝶蚌血细胞的先天性免疫防御以外,还参与了其消化腺免疫器官的免疫应答反应。     

三角帆蚌SOX2基因的分子鉴定及表达分析

SOX基因家族是一系列在性别分化、胚胎发育、细胞多功能性的维持等方面具有重要作用的转录因子,在高等脊椎动物中研究比较深入,但在淡水珍珠蚌中却很少见。本研究利用RACE法克隆获得了三角帆蚌SOX2基因的序列,其cDNA全长为1 840 bp,开放阅读框为672 bp,编码氨基酸223个。该基因具有SOX基因家族典型的HMG-box蛋白结构域,与其他物种对比发现,保守性极高。实时荧光定量PCR组织表达结果显示,在斧足中表达量最高,在肝脏中最低,同时发现雌雄性腺之间存在极显著性差异,雌性性腺表达量明显高于雄性性腺;性腺在早期胚胎中表达量明显高于其他时期,推测SOX2基因参与了三角帆蚌的性别分化和胚胎发育过程。     

三角帆蚌热休克蛋白70基因克隆及其表达分析

对三角帆蚌HSP70基因序列进行全长克隆及其分子生物学分析,并检测其在不同水温刺激下鳃组织中的表达变化。通过高通量转录组测序获得三角帆蚌HSP70基因（HcHSP70）长片段,采用3'RACE对其进行了3'末端克隆,经拼接得到HcHSP70 cDNA全长序列。采用多种分子生物学软件对HcHSP70 cDNA全长序列进行了特征分析,采用实时荧光定量PCR技术检测了其组织分布,并结合Western-blot技术检测蚌鳃中该基因mRNA与蛋白经不同水温刺激后的表达变化。结果显示,HcHSP70 cDNA全长为2298 bp,其中开放阅读框为1974 bp,编码657个氨基酸。预测分子量大小为71.6 Ku,pH7.0时的理论等电点为5.61。氨基酸序列分析表明,HcHSP70氨基酸序列含HSP70家族的3个标签序列（I₉DLGTTYS₁₆、I₁₉₇FDLGGGTFDVSIL₂₁₀和I₃₃₆ VLVGGSTRIPKVQK₃₅₀）,与长牡蛎及泥蚶的HSP70同源性最高（91%）。实时荧光定量PCR检测结果显示,HcHSP70在鳃、性腺、肝胰腺、外套膜及肌肉等5种被检组织中均有表达,以肝胰腺中的表达水平最高。实时荧光定量PCR与Western-blot技术检测皆表明,蚌鳃组织中HcHSP70基因与蛋白的表达量在37℃时达到最高,而在40℃水温刺激下表达水平下调至正常值,表明其在适应高温刺激时发挥了重要作用。     

三角帆蚌LRR基因的分子特征及表达分析

近年来珠蚌养殖业一直饱受病害困扰,现有资料表明富亮氨酸重复序列(leucine-rich repeat,LRR)蛋白在无脊椎动物的蛋白互作、识别过程和免疫反应中都起到至关重要的作用,本实验通过RACE法克隆并表达了三角帆蚌LRR基因,全长为3 492 bp,其中开放阅读框2 142 bp,编码713个氨基酸,其中5个氨基酸组成信号肽,而其余688个氨基酸则形成成熟肽,氨基酸序列经相关软件预测存在跨膜结构。运用荧光定量PCR技术分析LRR在正常组织中及受到嗜水气单胞菌侵染后相关组织表达量的变化,分析发现,在非胁迫状态下,LRR基因在斧足中高表达,在其他组织中几乎不表达。嗜水气单胞菌刺激侵染后可以看到斧足和肝胰腺中LRR基因表达显著下调,而其他组织表达量在不同时间点均出现表达峰值,显示能被显著诱导,说明LRR基因表达可能与抵挡病原体入侵有关。     

水体Ca2+对三角帆蚌珍珠质沉积的影响

为研究不同水体Ca2+浓度(10-80 mg/L)下三角帆蚌生长和珍珠质沉积量和晶体结构的变化, 采用鱼蚌混养的养殖模式养殖10周。结果表明, 1龄幼蚌生长的适宜Ca2+浓度为40 mg/L, 2龄未植片三角帆蚌生长的适宜Ca2+浓度为40-70 mg/L, 2龄植片三角帆蚌珍珠沉积的适宜Ca2+浓度为40 mg/L。拉曼光谱分析和珍珠层小片的扫描电镜观察结果表明, 适宜Ca2+浓度影响三角帆蚌珍珠质沉积可能是通过促进外套膜组织有机基质分泌从而调节CaCO3晶体形成和生长实现的。研究结果提示, 在三角帆蚌生长快速季节, 养殖水体中添加一定的钙源如生石灰等将有利于蚌体和珍珠的生长。同时研究结果也为加快珍珠培育, 提高珍珠品质提供理论依据和实践操纵手段。     

三角帆蚌GPX基因cDNA全序列的克隆及其编码蛋白的结构分析

根据本实验室构建的三角帆蚌cDNA文库中已标注的EST序列, 利用cDNA末端快速扩增法(RACE)克隆了三角帆蚌(Hyriopsis cumingii)谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione peroxidase, GPX)基因cDNA全序列。序列分析表明, 该基因cDNA序列全长1286 bp, 包括5′端非翻译区(Untranslated Region) 39 bp、3′端非翻译区659 bp和开放阅读框(Open reading frame, ORF)588bp, 共编码195个氨基酸, 分子量约为22.2 kDa, 理论等电点为8.44, 属于含硒类GPX。该氨基酸序列具有GPX所有亚型中均高度保守的3个环状结构, 对酶的三级结构起稳定作用。在线分析结果表明: GPX的氨基酸序列不存在明显的疏水区, 也不存在信号肽序列。氨基酸相似性对比结果显示, 三角帆蚌GPX氨基酸序列与脊椎动物GPX-2及GPX-1的序列相似度较高, 为73.1%-80.8%, 与其他型GPX相似度较小, 相似度低于60%。构建的系统进化树显示三角帆蚌GPX与其他几种鱼类GPX聚为一类, 与其他已发表的几种软体动物GPX相距较远, 推测本实验克隆的三角帆蚌GPX基因和已发表的软体动物不属于同一种GPX类型。     

Molecular characteristics and expression analysis of calreticulin in Chinese shrimp Fenneropenaeus chinensis

Calreticulin (CRT), as an endoplasmic reticulum luminal resident protein, plays important roles in Ca(2+) homeostasis and molecular chaperoning. CRT on the surface of the cell can modulate cell adhesion, phagocytosis and integrin-dependent Ca(2+) signaling. The full length cDNA of calreticulin (FcCRT) was cloned from Chinese shrimp Fenneropenaeus chinensis. It consists of 1672 bp with an open reading frame of 1221 bp, encoding 406 amino acids. This is the first reported cDNA sequence of calreticulin in Crustacea. The deduced amino acid sequence of FcCRT showed high identity with those of Bombyx mori (88%), Drosophila melanogaster (83%), Mus musculus (82%) and Homo sapiens (82%). Highest expression of FcCRT was detected in ovary by Northern blot and in situ hybridization. Different mRNA levels of FcCRT were detected at various molting stages. Expression of FcCRT was induced significantly after 3 h of heat shock treatment, reached the maximum at 4 h and dropped after that. Differential expression profiles of FcCRT were observed in hepatopancreas and haemocytes when shrimp were challenged by white spot syndrome virus (WSSV). From the above results, we inferred that FcCRT might play important roles in Ca(2+) homeostasis, chaperoning and immune function in shrimp.     

三角帆蚌热休克蛋白60基因克隆及其表达分析

利用3'RACE技术, 对高通量转录组测序所得三角帆蚌HSP60基因（hcHSP60）长片段（2629 bp）进行了3'末端克隆, 经拼接得到hcHSP60 cDNA全长序列。采用多种分子生物学软件对hcHSP60 cDNA全长序列进行了特征分析, 并采用RT-PCR技术检测了其组织分布及经冷热应激后的表达变化。结果显示, hcHSP60 cDNA全长为2807 bp, 其中开放阅读框为1707 bp, 编码568个氨基酸, 预测分子量大小为61.04 ku, pH 7.0时的理论等电点为5.63。序列中不存在信号肽与跨膜结构。氨基酸序列保守性分析表明, hcHSP60氨基酸序列与光滑双脐螺HSP60同源性最高（达82%）, 而与牙鲆、白云金丝鱼HSP60的同源性最低（为75%）。RT-PCR检测结果表明, hcHSP60在肝胰腺中的表达水平最高, 而在血液中的表达水平最低。30℃与35℃水温处理三角帆蚌4h后, 各组织中hcHSP60表达水平明显上升, 表明hcHSP60可能在三角帆蚌耐热应激反应中起着重要作用。       

Molecular cloning and copy number variation of a ferritin subunit (Fth1) and its association with growth in freshwater pearl mussel Hyriopsis cumingii

Iron is one of the most important minor elements in the shells of bivalves. This study was designed to investigate the involvement of ferritin, the principal protein for iron storage, in shell growth. A novel ferritin subunit (Fth1) cDNA from the freshwater pearl mussel (Hyriopsis cumingii) was isolated and characterized. The complete cDNA contained 822 bp, with an open reading frame (ORF) of 525 bp, a 153 bp 5' untranslated region (UTR) and a 144 bp 3' UTR. The complete genomic DNA was 4125 bp, containing four exons and three introns. The ORF encoded a protein of 174 amino acids without a signal sequence. The deduced ferritin contained a highly conserved motif for the ferroxidase center comprising seven residues of a typical vertebrate heavy-chain ferritin. It contained one conserved iron associated residue (Try27) and iron-binding region signature 1 residues. The mRNA contained a 27 bp iron-responsive element with a typical stem-loop structure in the 5'-UTR position. Copy number variants (CNVs) of Fth1 in two populations (PY and JH) were detected using quantitative real-time PCR. Associations between CNVs and growth were also analyzed. The results showed that the copy number of the ferritin gene of in the diploid genome ranged from two to 12 in PY, and from two to six in JH. The copy number variation in PY was higher than that in JH. In terms of shell length, mussels with four copies of the ferritin gene grew faster than those with three copies (P<0.05), suggesting that CNVs in the ferritin gene are associated with growth in shell length and might be a useful molecular marker in selective breeding of H. cumingii.     

维生素D3对三角帆蚌外套膜细胞内Ca2+浓度的影响

采用胰酶消化法获得三角帆蚌(Hyriopsis cumingii)外套膜细胞,用Fluo-3/AM荧光标记技术和激光共聚焦扫描显微镜(confocal laser scanning microscope,CLSM)检测外套膜内外表皮细胞在静息状态下细胞的游离ca2+浓度及不同浓度维生素D.(VD.)孵育后的外套膜细胞的...     

一个新的二色补血草金属硫蛋白基因LbMT2的克隆及其表达分析

从二色补血草cDNA文库中分离出一个新的金属硫蛋白基因LbMT2全长cDNA序列。该基因全长518 bp, 其中5′非翻译区(UTR)64 bp, 3′非翻译区205 bp, 开放阅读框(ORF)249 bp, 编码由82个氨基酸组成的蛋白质, 编码蛋白的分子量为8.1 kDa, 理论等电点(pI)为4.72。利用实时定量PCR方法研究了二色补血草在CuSO4、CdCl2、NaCl、低温和PEG胁迫下不同时间该基因的表达模式。结果表明, CuSO4、CdCl2、NaCl和低温处理均能诱导LbMT2基因在二色补血草的根和叶中的表达, 而PEG处理则抑制了LbMT2在根和叶中的表达。构建LbMT2基因的原核表达载体pGEX-LbMT2, 通过IPTG诱导在大肠杆菌(Escherichia coli) BL21中融合表达, SDS-PAGE 电泳获得35 kDa 的蛋白条带, 大小与预期相符。     

Ca2+-dependent redox modulation of SERCA 2b by ERp57

We demonstrated previously that calreticulin (CRT) interacts with the lumenal COOH-terminal sequence of sarco endoplasmic reticulum (ER) calcium ATPase (SERCA) 2b to inhibit Ca2+ oscillations. Work from other laboratories demonstrated that CRT also interacts with the ER oxidoreductase, ER protein 57 (also known as ER-60, GRP58; ERp57) during folding of nascent glycoproteins. In this paper, we demonstrate that ERp57 overexpression reduces the frequency of Ca2+ oscillations enhanced by SERCA 2b. In contrast, overexpression of SERCA 2b mutants defective in cysteines located in intralumenal loop 4 (L4) increase Ca2+ oscillation frequency. In vitro, we demonstrate a Ca2+-dependent and -specific interaction between ERp57 and L4. Interestingly, ERp57 does not affect the activity of SERCA 2a or SERCA 2b mutants lacking the CRT binding site. Overexpression of CRT domains that disrupt the interaction of CRT with ERp57 behave as dominant negatives in the Ca2+ oscillation assay. Our results suggest that ERp57 modulates the redox state of ER facing thiols in SERCA 2b in a Ca2+-dependent manner, providing dynamic control of ER Ca2+ homeostasis.