人腺病毒55型感染肺部病变与外周血淋巴细胞关系研究

目的:探讨人腺病毒55型感染肺部病变与外周血淋巴细胞改变的关系及致病意义。方法:以50例经胸部CT证实为腺病毒肺炎的患者为研究对象(肺炎组),调查其外周血细胞及T淋巴细胞亚群变化情况,并与同期腺病毒55型感染未出现肺部病变的患者30例(非肺炎组)对照;亚组分析50例肺炎组中多肺叶病变与单肺叶病变患者之间T淋巴细胞变化的差异。结果:与非肺炎组患者相比,肺炎组患者急性期外周血淋巴细胞比例明显降低、单核细胞比例明显升高(P0.01);肺炎组CD3+T淋巴细胞比例、CD3+CD4+T淋巴细胞比例及CD4/CD8比值较非肺炎组均有明显降低(P0.01)。亚组分析显示,肺炎组患者肺部病变范围不同,T淋巴细胞亚群的变化亦有差异,多肺叶病变组患者CD3+CD8+T淋巴细胞比例较单肺叶病变组明显升高、CD4/CD8比值较单肺叶病变组明显降低(P0.05)。结论:HAdv-55感染引起肺炎病变时,宿主存在明显的细胞免疫功能受损,且与肺部病变程度有一定正相关。     

表达狂犬病毒糖蛋白抗原的重组犬2型腺病毒的构建及鉴定

为研制一种预防犬科动物狂犬病的新型疫苗,将含有狂犬病毒ERA株糖蛋白基因(Rabies glycoprotein,Rgp)表达盒的穿梭质粒pVAXΔE3Rgp中的Rgp表达盒克隆入犬2型腺病毒(Canine adenovirus type2,CAV2)骨架质粒pPoly2-CAV2中,获得重组质粒pPoly2-CAV2-ΔE3-Rgp,释放其基因组,转染MDCK细胞系,获得E3缺失区(Deletion of early protein3,ΔE3)含有Rgp表达盒的重组病毒CAV2-ΔE3-Rgp。该重组病毒能在MDCK细胞上产生典型的腺病毒细胞病变。通过酶切、PCR、基因测序,表明该重组病毒含有完整的Rgp表达盒。通过RT-PCR、Western blot等检测,表明该重组病毒能够表达Rgp抗原。用该重组病毒免疫犬,3次免疫后,可以诱导犬产生特异的抗CAV2HI抗体,其效价超过1∶256和抗狂犬病病毒(Rabies virus,RV)中和抗体,其效价超过0.50IU/mL。试验结果表明,获得的重组病毒免疫犬后,能够产生抗狂犬病毒和腺病毒的高效价保护性抗体,是一种有潜力的犬科动物狂犬病毒腺病毒二联疫苗候选株。     

人腺病毒36型与肥胖发生相互关系的研究进展

病毒感染与肥胖发生之间关系的研究在近年来受到关注,尤其是人腺病毒36型（Ad-36）感染。Ad-36抗体的存在与肥胖者体重指数增加具有相关性。体外动物模型和细胞模型实验也支持Ad-36诱导肥胖发生。在肥胖发生机制方面,E4 orf-1基因、脂肪细胞分化的细胞通路受到关注。磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）途径被认为在Ad-36引发降血糖作用中发挥重要作用。目前,Ad-36的研究数据仍然有限,其与肥胖发生之间关系的确认仍需更多的流行病学数据和更深入的研究。     

长春和北京地区引起婴幼儿肺炎的3型与7型腺病毒的分子流行病学研究

对长春和北京地区连续12年(1976年冬至1988年春)引起小儿肺炎的3、7型腺病毒102株标本,进行了限制性内切酶核酸电泳图谱分析。56株7型腺病毒经BamHⅠ、BclⅠ、BglⅠ、XbaⅠ、SmaⅠ、HindⅢ分析后,表现为两个基因组型——Ad7 b和Ad7 d。46株3型腺病毒被Bg1 Ⅱ、BamHⅠ酶解后,表现为 3个基因组型——Ad 3Ⅰ、Ad 3Ⅱ、Ad 3Ⅲ。各基因组型的分布情况是:56株7型腺病毒中,43株为Ad 7 b(76.8％),流行于1976年冬至1986年春;13株是Ad 7 d(23.2％),出现于1982年,与Ad 7 b共同流行;1986年～1988年分析的5株病毒都是Ad 7d。43株3型腺病毒中,Ad3Ⅰ42株(91.0％),分布于12年中;Ad 3Ⅱ、Ad 3Ⅲ各2株,散在分布。此结果表明,国内这12年中引起小儿肺炎的3型腺病毒至少有3个基因组型,7型腺病毒至少有两个基因组型。Ad3Ⅰ和Ad7 b是流行优势基因组型。但自80年代初开始出现Ad7 d以来,有逐年增多的趋势,最近两年的标本又都是Ad7 d,很可能它将取代Ad7 b而成为流行的优势基因组型.     

犬2型腺病毒E3区表达载体的构建

利用构建的犬2型腺病毒E3区缺失质粒pBE3L分别构建了含有和不含外源性启动子的绿色荧光蛋白（GFP）基因和在犬病病毒糖蛋白（Rgp）基因的重组表达质粒pBE3LGFP、pBE3LCGFP、pBE3LRgp和pBE3LCPgp,并分别对DK细胞进行了转染实验,以检测其表达,结果显示,pBE3LCGFP质粒在转染DK细胞后,于36h即可观察到荧光,72～96h无明显差别,传3代后仍可见表达荧光的细胞,pBE3LCRgp质粒转染DK细胞后,于48～96h用间接免疫荧光染色可检测到糖蛋白的表达,而pBE3LGFP和pBE3Rgp质粒转染DK细胞后经检测均无表达,表明构建的E3区缺失性载体不能利用E3区自身的启动子进行目的基因的表达,但利用外源性的启动子可使外源基因获得良好表达。     

广州地区人腺病毒5型血清流行病学初步调查

目的评估广州地区人群中人腺病毒5型(HAdV-5)先存中和抗体的流行情况。方法采用以β-半乳糖苷酶(LacZ)为报告基因,结合CMV启动子的人重组腺病毒5型,使用化学发光法,检测了209份免疫功能正常的成人血清样本中HAdV-5的中和抗体阳性率情况。结果 HAdV-5中和抗体的阳性率为82.3%(172/209)。HAdV-5中和抗体在<1/20(低滴度)、1/40-1/160(中滴度)、1/320-1/1280(高滴度)、>1/1280(超高滴度)时均能检测到,而且随着滴度的增加,阳性率逐渐升高。在20～40岁时HAdV-5中和抗体阳性率最高,在<20岁时HAdV-5阳性率最低。结论广州地区人群中针对HAdV-5的先存中和抗体阳性率高,应用基于该种DNA病毒作为载体进行基因疫苗及基因治疗的研究时,具有一定的局限性。     

人eNOS复制缺陷型重组腺病毒的构建

目的:构建以巨型细胞病毒(CMV)为启动子的heNCS重组腺病毒转移载体.方法和结果:将heNOS cDNA全长亚克隆到穿梭质粒启动子CMV的下游,通过I-Ceu Ⅰ和PI-SceⅠ两个稀有酶切位点将目的基因heNOS与腺病毒质粒DNA(pAdeno-X)进行体外连接,获得重组腺病毒质粒DNA(pAdeno-heNOS),后者经限制性内切酶PacⅠ切割,利用脂质体转染法获得heNOS重组腺病毒.PCR双引物法鉴定是否成功构建heNCS重组腺病毒.结论:PCR双引物检测含有heNOS片段,表明成功构建了heNOS重组腺病毒转移载体AdhCMV-heNOS.     

腺病毒4型E3区核苷酸序列测定及其基因结构与功能分析

本文将Ａｄ４基因组相当于７３．３－８９．２基因图谱单位的ＤＮＡ片段进行了序列测定及基因结构分析,它包括了Ａｄ４Ｅ３区全基因及该区两侧的部分序列。序列分析表明,Ａｄ４ Ｅ３区从ＴＡＴＡＡ ｂｏｘ起至该区基因结束共４７７８ｂｐ,编码１１个大于６ｋＤ的开放读码框架。对Ａｄ４ Ｅ３区ＯＲＦ分析结果表明,Ａｄ４ Ｅ３区编码的１９．３ｋ,１５ｋ,１０．４ｋ蛋白,分别与Ａｄ２ Ｅ３区的ｇｐ１９ｋ,１４．ｋ和１０     

血清10型禽腺病毒AHFY19株全基因组序列测定与分析

禽腺病毒（Fowl Adenovirus,FAdV）是一组血清型众多及致病性多样的病原体,多数呈亚临诊性长期潜伏带毒,部分毒株可造成禽群包涵体肝炎、心包积液、肌胃糜烂症、产蛋下降、生长迟缓等病症,严重威胁养禽业健康发展。为分析血清10型禽腺病毒（FAdV-10）全基因组序列特征,本研究将分离自外表健康鸡泄殖腔拭子的FAdV-10 AHFY19株经卵黄囊途径接种8日龄SPF鸡胚扩繁,从死亡鸡胚肝组织中提取病毒基因组,采用illumina二代基因测序技术和特殊结构区二温式PCR扩增测定病毒全基因组并分析其遗传特征。结果显示,AHFY19株（103.1EID50/0.1 mL/枚）接种的鸡胚于18～21日龄全部死亡。全基因组测序显示,AHFY19株病毒基因组全长为45 757 bp(GenBank登录号：MN542422),其G+C含量为54.63%,末端重复序列（ITR）长为56 bp,共有52个开放阅读框（ORF）。基因组比对分析显示,AHFY19株属I群FAdV C种FAdV-10型,与C2-B-FAdV-10株（MK572851）全基因组同源性最高（99.91%）,但AHFY19株基...     

表达猪圆环病毒2型Cap蛋白重组复制缺陷型人5型腺病毒的构建及小鼠免疫试验

构建表达猪圆环病毒2型Cap蛋白重组复制缺陷型人5型腺病毒,评价其对小鼠免疫效果。本研究将编码PCV2Cap蛋白的ORF2克隆到腺病毒表达系统穿梭质粒,构建了重组穿梭质粒pacAd5CMV-Cap。将被限制性内切酶PacI线性化后的骨架质粒和重组穿梭质粒共转染HEK293AD细胞,两者在真核细胞内同源重组并包装出携带PCV2-Cap基因的复制缺陷型重组人5型腺病毒,命名为rAd5-Cap;以同样方法重组获得了不含任何靶基因的野生型重组腺病毒wt-rAd5。病毒增殖稳定后,rAd5-Cap与wt-rAd5滴度可达到108.5 TCID50/mL左右;一步增殖实验证明,相对于wt-rAd5,rAd5-Cap中Cap基因的引入几乎没有给重组腺病毒增殖造成影响。RT-PCR和间接免疫荧光实验显示,rAd5-Cap能够有效介导PCV2Cap蛋白在真核细胞HEK293AD细胞中表达。以107 TCID50的rAd5-Cap肌肉注射接种小鼠,14d后小鼠血清中产生可检测水平的针对Cap蛋白的体液免疫应答,并且至少在免疫后28d之前抗体水平持续加强。对重组腺病毒的分子生物学鉴定和在小鼠上的初步免疫试验结果表明,重组腺病毒rAd5-Cap可介导Cap蛋白在真核细胞中的表达,并且表达的靶蛋白具有较好的免疫原性,为进一步将其开发成新型PCV2疫苗奠定了基础。     

选择性复制型腺病毒介导的自杀基因HSV -tk 在 肿瘤基因治疗中的应用

自杀基因治疗是肿瘤基因治疗的手段之一,治疗效果与自杀基因能否被高效、选择性的导入肿瘤细胞有关。肿瘤选择性复制型腺病毒（conditionally replication adenovirus,CRADs）可以特异性的在肿瘤细胞中复制,在复制的同时所携带的治疗基因也大量表达。由CRAds介导的自杀基因,实现了对肿瘤的病毒治疗和基因治疗的结合,提高了治疗效率和使用复制型腺病毒的安全性。     

重组虎源H5N1流感病毒HA基因犬2型腺病毒的构建与实验免疫研究

H5N1流感病毒可以对虎和猫产生致死性感染,为研制可用于预防猫科动物流感的新型疫苗,构建了重组虎源H5N1流感病毒HA基因的犬2型腺病毒。将A/Tiger/Harbin/01/2003(H5N1)的HA基因克隆入pVAX1载体中,然后将含有HA基因的表达盒(CMV HA PolyA)克隆入pVAXΔE3的SSPⅠ酶切缺失处,获得含有HA表达盒的穿梭载体pΔEHA。用SalⅠ NruⅠ分别对pΔEHA和pPoly-2-CAV2进行双酶切,将含有HA表达盒的SalⅠ NruⅠ片段克隆入pPoly2-CAV2,获得了在E3区缺失处插入HA表达盒的重组质粒pCAV-2/HA。释放CAV-2/HA重组基因组转染MDCK细胞,获得了重组活病毒CAV2/HA,经Western blot分析表明重组表达产物可被流感病毒HA单克隆抗体3A13所识别。使用该重组病毒免疫猫可以产生效价为1∶8~1∶16的抗H5亚型流感病毒血凝抑制抗体。     

在大肠杆菌中人腺病毒5型及昆虫核多角体病毒晚期启动子表达CAT基因

本文证明,含有人5型腺病毒及苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒(AutograPha californica Nuclear Polyhedrosis Virus, AcNPV)启动子的DNA片段,可在大肠杆菌中起始氯霉素乙酰基转移酶(Chloramphenicol Acetyltransferase,CAT)基因的转录和表达,使转化宿主菌表现为氯霉素抗性型。这说明,除痘苗病毒启动子外,其它人类病毒及昆虫病毒的启动子也能有效地在大肠杆菌中工作。     

利用5型腺病毒晚期启动子在真核细胞中表达乙型肝炎病毒表面抗原

近年来,随着基因工程研究工作的迅速发展,病毒载体越来越受到重视。用腺病毒(AdV)做载体也早已有人研究。Carl Thummel等构建了AdV-SV40重组体,在AdV晚期启动子控制下表达SV40T抗原。我们用AdV5晚期启动子(LLP)构建了一个新的质粒。用SV40启动neo基因做为真核细胞筛选标志,用AdV5 LLP在Vero细胞内表达HBsAg。并单独用AdV5LLP代替SV40早期启动子,在Vero细胞内表达neo基因。     

快速获取55型腺病毒基因组序列的方法

【目的】建立快速获取55型腺病毒的全长基因组序列的方法。【方法】根据55型腺病毒的基因组特点,设计覆盖55型腺病毒基因组序列的12对引物,分别以55型腺病毒DNA为模板,扩增得到12个PCR产物,通过对12个PCR产物测序及序列拼接,获得55型腺病毒的全长基因组序列。【结果】从本院急性上呼吸道感染者咽拭子标本中分离得到一株55型腺病毒毒株SF04/SC/2016,以其DNA为模板扩增成功获得12个PCR产物,对其进行测序,并对12段序列进行拼接得到55型腺病毒的全长基因组序列,与已报到的各型腺病毒序列进行比对,采用邻位相连法构建系统发育进化树,所得序列与55型腺病毒处于同一分支,进一步确认该病原体为55型腺病毒。【结论】研究公布的序列和方法,能够实现更方便对腺病毒的快速测序,为揭示55型腺病毒的进化特点及制订疾病防控策略提供了有效手段。