香茄叶霉病菌蛋白CfHNNI1中诱导植物坏死所需氨基酸序列的鉴定

非寄主抗性具有持久和广谱的特点,因而在作物抗病方面有巨大应用潜力而越来越受人们关注.然而对非寄主抗性的机制仍知之甚少.以前已分离到一个番茄叶霉病菌(Cladosporium fulvum Cooke)cDNA克隆,与bZIP转录因子有很高序列同源性.该cDNA表达后导致叶霉菌寄主植物番茄(Lycopersicon esculentum Mill.)和非寄主植物烟草属多个种(Nicotiana spp.)产生坏死,并诱发对马铃薯病毒X的抗性,因而被称为CfHNNI1(C. fulvum host andnonhost necrosis inducer 1).本文报告有关CfHNNI1中DNA结合结构域和亮氨酸拉链结构域的氨基酸序列与其坏死诱导功能之间相互关系的突变分析研究结果.DNA结合结构域R112-N117(RKRQRN)中6个氨基酸的缺失及精氨酸R125和R127被丙氨酸的替代突变,分别完全解除和严重降低CfHNNI1对植物坏死的诱导能力.亮氨酸拉链结构域亮氨酸L149和L163被丙氨酸的替代突变也部分降低了CfHNNI1对植物坏死的诱导能力.5'端加上烟草PR-1a信号肽序列使其成熟产物定位于胞外,导致CfHNNI1完全丧失对植物坏死的诱导能力.因此,CfHNNI1中DNA结合结构域R112-N117和精氨酸R125和R127、亮氨酸拉链结构域的亮氨酸L149和L163以及成熟蛋白的胞内定位可能为CfHNNI1诱导植物坏死所必需.     

病毒诱导的基因沉默及其在植物基因功能研究中的应用

RNA介导的基因沉默是近年来在生物体中发现的一种基于核酸水平高度保守的特异性降解机制.病毒诱导的基因沉默（virus induced gene silencing, VIGS）是指携带植物功能基因cDNA的病毒在侵染植物体后,可诱导植物发生基因沉默而出现表型突变,进而可以研究该目的基因功能.至今,已经建立了以RNA病毒、DNA病毒、卫星病毒和DNA卫星分子为载体的VIGS体系,这些病毒载体能在多种寄主植物（包括拟南芥、番茄和大麦）上有效抑制功能基因的表达.VIGS已开始应用于N基因和Pto基因介导的抗性信号途径中关键基因的功能研究、抗病毒相关的寄主因子研究以及植物代谢和发育调控研究.在当前植物基因组或EST序列大量测定的情况下,VIGS为植物基因功能鉴定提供了有效的技术平台.     

一种拟南芥ZIP蛋白全长cDNA的克隆及表达

利用异质DNA探针 ,从拟南芥叶片cDNA文库中筛选到一个阳性cDNA克隆———AT10 3。DNA序列分析表明 ,其编码产物含有一个亮氨酸拉链结构域和一个核定位信号肽。GenBank数据库搜寻结果显示 ,AT10 3未与任何已知功能基因有同源性 ,但与裂叶牵牛PNZIP、集胞藻的一个ORF、紫菜的一个ORF ,构成了一个在进化上非常保守的含有亮氨酸拉链结构域的新家族 ,极有可能是一新的核基因转录因子。AT10 3是一个单拷贝基因 ,在叶片组织中强烈表达并受光调节     

植物抗病基因结构、功能及其进化机制研究进展

植物与病原菌在长期的共进化和相互选择的过程中,逐渐形成了组织障碍、非寄主抗性和小种专化抗性等有效的防御机制。小种专化抗性(基因对基因抗性)主要是由植物抗病基因识别相应的病原菌无毒基因并激活植物体内抗病信号进而抵御病原菌的侵染。从目前已克隆的 70 多个抗病基因来看,它们在结构上具有高度保守性,主要包括核苷酸结合位点(NBS),亮氨酸重复结构(LRR), 蛋白激酶结构域(PK), 果蝇蛋白 Toll 和哺乳动物蛋白质白细胞介素 1 受体[interleukin(IL)-1 receptor]类似结构域(TIR), 双螺旋结构(CC)或亮氨酸拉链(LZ)和跨膜结构域(TM)等,其在抗病基因与病原菌无毒(效应)蛋白互作以及植物内部免疫信号传导中起着重要的作用。同时,抗病基因又通过基因复制、遗传重组等进化机制形成多基因家族,为植物抗病的专化性和多样性提供了重要的遗传基础。本文主要讨论了近来已克隆抗病基因的结构特征、功能以及抗病基因进化机制研究的进展。     

早熟油菜成花相关基因LFY的克隆与分析

以甘蓝型油菜晚熟品种RG-8的早熟突变体RG-8M为材料,通过同源克隆法得到1个LEAFY(LFY)同源基因,命名为BnLFY。该基因cDNA全长为1 310bp,包含1个长为1 248bp的开放阅读框,编码415个氨基酸。序列分析表明,推测的氨基酸序列含双子叶植物LFY类蛋白特有的N端脯氨酸富集区、中央酸性区、亮氨酸拉链结构以及富含赖氨酸与精氨酸的碱性区;且与几种十字花科植物LFY类蛋白的氨基酸序列一致性均在84%以上。转录表达分析表明,BnLFY基因在油菜中为组成型表达。     

火鹤AaSERK基因克隆及其在体细胞胚胎发生中的表达分析

为了探讨体细胞胚胎发生相关类受体蛋白激酶(SERK)基因在火鹤体细胞胚胎发生中的作用,以火鹤胚性愈伤组织为材料,利用RT-PCR结合RACE技术,克隆了火鹤体细胞胚胎发生相关类受体蛋白激酶基因(AaSERK),通过实时荧光定量PCR(Real time-PCR)技术分析了AaSERK的相对表达量。结果显示:(1)该基因全长为1 949bp,包含1 866bp开放阅读框,编码蛋白由622个氨基酸组成。(2)预测该基因具有SERK家族典型的结构域:1个信号肽、1个亮氨酸拉链结构域、5个富亮氨酸重复序列结构域、1个SPP基序、1个跨膜结构域、含11个亚区的激酶结构域、1个C端结构域。DNAMAN分析显示,该基因编码的氨基酸序列与其它植物的一致性达到65%~89%。(3)在离体诱导体细胞胚胎发生的各阶段中,AaSERK基因在诱导阶段及发育培养阶段微弱表达或者几乎不表达,在继代培养第30天的胚性愈伤组织中表达量最高。推测该基因可以作为火鹤体细胞胚胎发生的一个标记基因。     

香蕉抗病种质NBS类RGAs的克隆及相关序列差异分析

根据植物NBS类抗病基因保守氨基酸序列P-loop和疏水氨基酸GLPL保守序列设计简并引物,从香蕉抗镰刀菌枯萎病(4号小种)材料GCTCV-119的基因组DNA及cDNA中扩增获得9个DNA片段和10条cDNA片段,均编码为通读的氨基酸序列,命名为"BR-1"-"BR-19",GenBank登录号依次为EF515833-EF515836, EU123871-EU123885。同源性分析表明,均与已报道的植物抗病基因有不同程度的同源性,具有P-loop(Kinase-1a)、Kinase-2、RNBS-B(Kinase-3a)以及GLPL等保守氨基酸序列,属于non-TIR-NBS类候选抗病基因。其中,BR-5和BR-6与番茄抗镰刀菌枯萎病番茄专化型I2、I2-1和I2-2基因聚为一类,可能与香蕉镰刀菌枯萎病的抗性相关。     

彩叶草中一个富亮氨酸重复相关蛋白基因SsLRP的克隆和分析

根据彩叶草叶片小型EST库中一条具有1个富亮氨酸重复（leucine-rich repeat,LRR）结构域的EST序列,采用RACE与文库结合的方法,克隆了1个具有5个LRR结构域的全长cDNA,SsLRP（LRR-Related Protein）（GenBank登录号FJ787729）。SsLRP cDNA全长1024bp,包含一个657bp的ORF框,编码218个氨基酸。其5’-UTR区含有2个终止子TAG,3’-UTR区具有推测的加尾信号AATAAA。SsLRP蛋白N端具有的信号肽和保守的亮氨酸拉链结构域,具有5个保守的LRR结构域,多个磷酸化位点和N-糖基化位点。多序列比对和系统进化分析表明,SsLRP与番茄SlLRP同源性最高。二级结构和三级结构预测表明,SsLRP的功能可能与保守的LRR结构域密切相关,推测该基因可能参与蛋白间的相互作用与信号识别。RT-PCR分析表明,SsLRP与番茄SlLRP具有相似的表达模式,在正常植株的根、茎、叶和花中都有表达,在受菌核病感染植株的茎和叶中表达上调。     

与拟除虫菊酯抗性相关的烟粉虱钠通道基因突变及其检测

通过RT-PCR克隆了烟粉虱Bemisia tabaci (Gennadius) 南京种群(B-生物型)的钠离子通道结构域ⅡS4-6 cDNA片段,证实了与拟除虫菊酯抗性相关的是位于第925位亮氨酸到异亮氨酸的突变(L925I),并建立了L925I突变的PASA检测技术。与SUD-S敏感品系相比,2002年采自南京棉花上的烟粉虱种群对氯氰菊酯具有77倍的抗性,用氯氰菊酯对该种群进行多次筛选后,该种群对氯氰菊酯的抗药性提高到227倍。PASA检测结果表明筛选后的南京种群中100%个体都具有L925I突变(61.1%的个体为L925I突变纯合子,38.9%的个体为杂合子),而未筛选的南京种群只有75%个体具有L925I突变(35%个体为L925I突变纯合子,40%的个体为杂合子,25%的个体为野生型)。该结果表明了烟粉虱钠离子通道L925I突变与对拟除虫菊酯抗性密切相关。还讨论了烟粉虱对拟除虫菊酯抗性的代谢机理。     

茶树CsCBF1基因克隆和转录活性分析

采用RACE技术克隆了一个受冷诱导的茶树CBF基因全长cDNA,命名为CsCBF1(GenBank登录号为EU563238)。CsCBF1cDNA全长序列为1 211bp,开放阅读框编码259个氨基酸。氨基酸序列分析表明,CsCBF1具有CBF家族典型的保守结构域,与其他植物的CBF具有较高的相似性;与拟南芥、辣椒和橡胶树编码的CBF相似性分别为56%、63%和56%。亚细胞定位结果表明,CsCBF1位于细胞核内。分别将10个CsCBF1缺失突变体与GAL4DNA结合域融合的结果显示,CsCBF1的羧基末端酸性结构域(第137位氨基酸至259位氨基酸)在酵母中具有转录激活活性。实时定量RT-PCR分析表明,CsCBF1基因受低温的快速诱导表达。     

Leucine zipper-mediated homodimerization of the p21-activated kinase-interacting factor, beta Pix. Implication for a role in cytoskeletal reorganization

Pix, a p21-activated kinase-interacting exchange factor, is known to be involved in the regulation of Cdc42/Rac GTPases. The 85-kDa betaPix-a protein contains an Src homology 3 domain, the tandem Dbl homology and Pleckstrin homology domains, a proline-rich region, and a GIT1-binding domain. In addition to those domains, betaPix-a also contains a putative leucine zipper domain at the C-terminal end. In this study, we demonstrate that the previously identified putative leucine zipper domain mediates the formation of betaPix-a homodimers. Using in vitro and in vivo methodologies, we show that deletion of the leucine zipper domain is sufficient to abolish betaPix-a homodimerization. In NIH3T3 fibroblast cells, expression of wild type betaPix-a induces the formation of membrane ruffles. However, cells expressing the leucine zipper domain deletion mutant could not form membrane ruffle structures. Moreover, platelet-derived growth factor-mediated cytoskeletal changes were completely blocked by the leucine zipper domain deletion mutant. The results suggest that the leucine zipper domain enables betaPix-a to homodimerize, and homodimerization is essential for betaPix-a signaling functions leading to the cytoskeletal reorganization.     

The divergent domains of the NEFA and nucleobindin proteins are derived from an EF-hand ancestor

The human protein NEFA (DNA binding, EF-hand, Acidic region) has previously been isolated from a KM3 cell line and immunolocalized on the plasma membrane, in the cytoplasma, and in the culture medium. Sequence analysis of a cDNA clone encoding NEFA identified a hydrophilic domain, two EF-hands, and a leucine zipper at the C- terminus. These characters are shared with nucleobindin (Nuc). In this paper we have further characterized NEFA and probed its evolutionary origins. Circular dichroism (CD) spectra of recombinant NEFA indicated a helical content of 51% and showed that the EF-hands are capable of binding Ca2+. Experiments with recombinant NEFA and synthesized peptides revealed that the leucine zipper cannot form a homodimer. The leucine zipper may allow heterodimer formation of NEFA and an unknown protein. Phylogenetic analyses suggest that this protein is derived from a four-domain EF-hand ancestor with subsequent duplications and fusions. The leucine zipper and putative DNA-binding domains of NEFA have evolved secondarily from existing EF-hand sequences. These analyses provide insights into how complex proteins may originate and trace the precursor of NEFA to the common ancestor of eukaryotes.      

Identification of structural and functional domains in mixed lineage kinase dual leucine zipper-bearing kinase required for complex formation and stress-activated protein kinase activation

Accumulating evidence suggests that mitogen-activated protein kinase signaling pathways form modular signaling complexes. Because the mixed lineage kinase dual leucine zipper-bearing kinase (DLK) is a large modular protein, structure-function analysis was undertaken to examine the role of DLK domains in macromolecular complex formation. DLK mutants were used to demonstrate that a DLK leucine zipper-leucine zipper interaction is necessary for DLK dimerization and to show that DLK dimerization mediated by the leucine zipper domain is prerequisite for DLK activity and subsequent activation of stress-activated protein kinase (SAPK). Heterologous mixed lineage kinase family members can be co-immunoprecipitated. However, the DLK leucine zipper domain interacted specifically only with the DLK leucine zipper domain; in contrast, DLK NH(2)-terminal region was sufficient to co-immunoprecipitate leucine zipper kinase and DLK. DLK has been shown to associate with the putative scaffold protein JIP1. This association occurred through the DLK NH(2)-terminal region and occurred independently of DLK catalytic activity. Although the DLK NH(2)-terminal region associated directly with JIP-1, this region did not interact directly with either DLK or leucine zipper kinase. Therefore, DLK may interact with heterologous mixed lineage kinase proteins via intermediary proteins. The NH(2)-terminal region of overexpressed DLK was required for activation of SAPK. These results provide evidence that protein complex formation is required for signal transduction from DLK to SAPK.