刚毛柽柳ThDREB基因在酵母中的表达及抗逆能力分析

DREB蛋白能特异地与DRE（dehydration responsive element）顺式作用元件结合,从而调控下游多个与逆境相关基因的表达,在植物对多种逆境胁迫的应答反应中起重要调节作用。为了研究刚毛柽柳ThDREB基因是否具有抗逆功能,将ThDREB基因插入到酵母表达载体pYES2中构建成重组载体,转入酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中获得重组型酵母。分别比较转ThDREB基因酵母和转空载体对照酵母在山梨醇、H₂O₂、CdCl₂、NaCl、Na₂CO₃、MgCl₂、-20℃胁迫处理之后的存活能力。结果显示,ThDREB基因能有效提高转基因酵母的抗干旱、盐、碱、氧化、重金属及低温胁迫的能力,表明ThDREB基因可能参与了柽柳多种抗逆调控过程。     

紫杆柽柳MnSOD基因在非生物胁迫中的作用

构建了酵母表达载体pYES2-MnSOD,并将其转入酿酒酵母INVSc1,以转空载体pYES2的酵母INVSc1为对照,检测其抗NaCl、Na2CO3、NaHCO3和紫外线胁迫能力。结果表明,转MnSOD基因酵母在以上逆境因素胁迫下的存活率有明显提高,说明MnSOD基因具有较强的抗NaCl、Na2CO3、NaHCO3和紫外线胁迫能力。     

二色补血草LbDREB基因在酵母中的抗逆性分析

利用酵母表达系统研究了二色补血草的DREB基因（LbDREB）对不同胁迫的抗性。将LbDREB构建到酵母表达载体pYES2中,转化到酿酒酵母INVSc1菌株中,并以转空pYES2质粒的酵母INVSc1（pYES2）作为对照,通过比较两种酵母在不同胁迫下的存活率来研究LbDREB基因对NaCl、KH_2PO_4、Na_2CO_3、NaHCO_3、低温、干旱、CuSO_4和CdCl_2胁迫的抗性。结果表明,LbDREB转化的酵母在各种胁迫下的存活率均明显高于转空pYES2的对照酵母,说明LbDREB基因除了具有传统认为的抗旱、耐盐、抗寒的作用外,还具有抗KH_2PO_4、Na_2CO_3、NaHCO_3、CuSO_4和CdCl_2等胁迫的能力。     

盐碱胁迫对平欧杂种榛枝条电阻抗图谱参数及离子含量的影响

为探讨平欧杂种榛枝条对盐碱胁迫的适应性,测定‘辽榛3号’当年生枝条在中性盐(NaCl)、碱性盐(Na₂CO₃)及混合盐3种盐碱胁迫下各项电阻抗图谱(EIS)参数的变化及主要矿质元素含量,分析各电阻抗参数及矿质离子含量的相关性.结果表明： 随着NaCl浓度的增加,电阻抗参数高频电阻率(r)、低频电阻率(r₁)、胞内电阻率(r_i)和胞外电阻率(r_e)均表现出先降低后增加再降低的变化趋势;Na₂CO₃胁迫下,各参数则呈现持续上升的变化规律;混合盐碱胁迫下,r₁、r_e随盐浓度增加持续降低,Na⁺含量在3种类型盐碱胁迫下均随浓度的增加而上升,且NaCl胁迫>混合盐碱胁迫> Na₂CO₃胁迫;Na₂CO₃胁迫导致了Zn、B、Ca 3种元素含量的降低.5种阳离子总量与r₁、r_e、弛豫时间(τ)、弛豫时间分布系数(Ψ)呈显著负相关.平欧杂种榛枝条能耐200 mmol·L^-1碱性盐胁迫,而对中性盐的忍耐能力介于100～150 mmol·L^-1.     

橡胶树HbMC2在酵母中的表达和抗逆性分析

Metacaspase介导的程序性细胞死亡在植物生长发育、抵御生物和非生物胁迫过程中发挥重要作用。前期研究发现橡胶树metacaspase基因HbMC2的表达受干旱和高盐等非生物胁迫调控。为明确HbMC2的功能,采用RT-PCR从橡胶树中扩增HbMC2编码区序列并将其插入到pYES2载体中,构建酵母表达载体pYES2-HbMC2。将pYES2-HbMC2质粒转化到酿酒酵母INVSc1菌株中,获得重组酵母INVSc1(pYES2-HbMC2)。PCR及RT-PCR检测结果表明,HbMC2已成功转入重组酵母并能在半乳糖诱导下表达。与对照酵母INVSc1(pYES2)相比,重组酵母INVSc1(pYES2-HbMC2)在氧化、干旱和盐胁迫下的生长受到抑制、细胞死亡率增加。结果表明酵母中表达HbMC2降低了对非生物胁迫的抗性,HbMC2是非生物胁迫抗性的负调节因子。     

混合盐碱胁迫对小白菜种子萌发的影响

用不同浓度的NaCl、Na₂SO₄、NaHCO₃和Na₂CO₃混合液对小白菜(Brassica chinensis L.)种子进行种子萌发试验,观察小白菜种子在不同浓度盐碱胁迫下的发芽率和发芽指数。结果表明,在混合盐碱胁迫下,小白菜种子的发芽率、发芽势、发芽指数和活力指数均随pH值增大和盐浓度的升高呈下降趋势,且各萌发指标与盐浓度的相关系数明显大于pH值,可见小白菜种子发芽受盐浓度的影响更大。低浓度(50mmol·L^-1)盐碱胁迫对小白菜种子萌发影响不大,高浓度(200mmol·L^-1)盐碱胁迫下小白菜的种子萌发受到严重影响。     

碱茅(puccinellia tenuifolra)Put-Cu/Zn-SOD基因的克隆及在酵母中的表达

从碱茅根cDNA文库分离得到Put-Cu/Zn-SOD全长cDNA,其序列全长为2 700 bp,该基因的开放读码框为长615 bp,所编码的蛋白由204个氨基酸组成,其预测分子量约为20.6 kD、理论等电点约为5.63.Put-Cu/Zn-SOD氨基酸序列与水稻Cu/Zn-SOD序列有较高的同源性为87%.将Put-Cu/Zn-SOD基因构建到酵母表达载体pYES2,并转化至酵母(INVSc1).对pYES2-Put-Cu/Zn-SOD转化酵母进行盐碱、氧化胁迫实验.结果表明:重组酵母的抗盐碱、氧化能力明显高于对照(pYES2转化酵母),结果显示了碱茅的Cu/Zn-SOD基因在酵母表达中,具有提高酵母抗盐碱和耐氧化能力.     

盐碱胁迫下碱地肤Na+/H+逆向转运蛋白基因KsNHX1表达分析

利用RACE技术得到碱地肤KsNHX1的3’cDNA序列.分子系统进化分析显示,KsNHX1为液泡膜Na⁺/H⁺逆向转运蛋白编码基因.通过半定量RT-PCR检测了该基因在盐碱胁迫下的表达,结果表明: 200 mmol·L^-1 NaCl胁迫2~24 h,KsNHX1在叶片中表达量持续增加;200 mmol·L^-1 NaCl处理10 h,KsNHX1在根、茎、叶和花中的表达都上调;不同浓度NaCl处理下,叶片中KsNHX1表达上调,160 mmol·L^-1时达到最高;低于400 mmol·L^-1浓度下,根中该基因的表达也都上调.经不同浓度Na₂CO₃胁迫,根中KsNHX1的表达变化趋势与相应浓度NaCl胁迫下的变化相同;但叶片中除160 mmol·L^-1 Na₂CO₃处理下KsNHX1表达略有上调外,其他浓度下KsNHX1的表达都低于对照.KsNHX1的表达模式暗示,在不同盐碱胁迫下,碱地肤能够维持体内相对稳定的K⁺/Na⁺,其耐盐特性可能与Na⁺/H⁺逆向转运蛋白的作用密切相关.     

紫薇响应盐胁迫和碱胁迫的代谢组分析

为探究‘红叶’紫薇(Lagerstroemia indica ‘Pink Velour’)对盐胁迫和碱胁迫的代谢响应机制,对‘红叶’紫薇1年生无性扦插苗分别进行盐胁迫(NaCl,pH=7.02)和碱胁迫(NaHCO₃和Na₂CO₃的Na⁺摩尔比为2:1,pH=9.52)处理,采用液相色谱质谱(LC-MS)分析叶片代谢组学变化,并比较2个处理组与对照(CK)之间的代谢差异。结果表明：与CK相比,盐处理组共筛选出156个差异代谢物,碱处理组共筛选出176个差异代谢物,2个对比组共有23个差异代谢物,其余均为特有差异代谢物。KEGG富集分析表明,次生代谢产物生物合成、氨基酸代谢、糖类代谢、脂肪酸代谢和植物激素合成是响应盐胁迫和碱胁迫的主要代谢通路;甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸合成代谢、ABC转运蛋白和维生素B₆合成代谢是盐胁迫组的特有代谢通路;缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、精氨酸和脯氨酸生物合成代谢、叶酸合成代谢,以及戊糖和葡萄糖醛酸相互转化和抗坏血酸合成代谢是碱胁迫组的特有代谢通路。这些差异...     

西伯利亚蓼甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因的cDNA克隆与序列分析

根据NaHCO3胁迫下西伯利亚蓼茎部消减库中甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(GAPDH)表达序列标签序列设计引物,采用cDNA末端快速扩增技术,从西伯利亚蓼茎中扩增出GAPDH的全长cDNA序列。该cDNA序列全长1331bp,完整阅读框1014bp,编码337个氨基酸。属于稳定蛋白,具有GAPDH保守功能域。氨基酸组成与其他已知高等植物来自细胞质中的GAPDH基因cDNA序列具有很高的同源性,最高可以达到96%。通过转酿酒酵母INVSC1的NaHCO3和NaCl胁迫试验表明,转基因INVSC1(pYES2-GAPDH)有明显的抗盐胁迫特性。在10%NaHCO3和4mol·L-1 NaCl胁迫下,转基因INVSC1(pYES2-GAPDH)菌株存活率明显比INVSC1(pYES2)高,可以推测GAPDH基因赋予INVSC1(pYES2-GAPDH)抗NaHCO3和NaCl的能力。该基因的cDNA序列在GenBank中登录号为DQ922680。     

核桃JrGRAS2基因响应热胁迫的表达及功能分析

GRAS转录因子在植物响应逆境中起重要作用。为更好的了解核桃（Juglans regia）在逆境胁迫下的适应机制,本研究从‘香玲’核桃转录组中克隆获得一条GRAS基因（命名为JrGRAS2）,对其在不同高温胁迫下的表达进行分析,并将该基因插入酵母表达载体pYES2中构建重组载体pYES2-JrGRAS2,将pYES2-JrGRAS2转入酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）INVSCI,同时以转化pYES2的重组酵母作为阴性对照,在酵母表达系统中研究该基因的抗热胁迫功能。结果显示,该基因开放读码框（ORF）全长1296bp,拟推导的蛋白分子量为47405.83Da,含有氨基酸数为431,理论等电点为5.66。在热胁迫下,JrGRAS2基因被显著诱导,特别是在36℃胁迫0.5h的茎内,其表达相对于对照被上调了335.5倍。对两种酵母进行热胁迫,发现转JrGRAS2基因酵母表现出较对照更高的生存活性。表明JrGRAS2基因具有响应热胁迫的能力,且能提高酵母的抗性,JrGRAS2基因可作为核桃逆境应答的重要候选基因。     

Expression of the HSP24 gene from Trichoderma harzianum in Saccharomyces cerevisiae

Hsp24 is a small heat-shock protein (sHSP). Such proteins are important endogenous cytoprotection factors involved in defense. A 1116-bp full-length cDNA of the Hsp24, with a 645-bp open reading frame nucleotide encoding a 24-kDa polypeptide consisting of 214 amino acid residues, was isolated from Trichoderma harzianum. Sequence analysis revealed that Hsp24 gene has more than 42–58% amino acid sequence homology with those of other fungi. The Hsp24 gene was integrated into pYES2 by inserting into a single site for recombination, yielding the recombinant of pYES2/Hsp24. Hsp24 expressed by pYES2/Hsp24 was induced by galactose. We tested whether Hsp24 could confer abiotic stress resistance when it was introduced into yeast cells. A transgenic yeast harboring T. harzianum Hsp24 was generated under the control of a constitutively expressed GAL promoter. The results indicated that Hsp24 yeast transformants had significantly higher resistance to salt, drought and heat stresses.     

PGA基因在酿酒酵母中的表达研究

本文根据GenBank 中巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）的PGA基因序列设计了上下游引物,通过PCR扩增出巨大芽孢杆菌1.1741中的PGA基因。将该基因连接到T7lac启动子控制下的表达载体pYES2(amp+,ura+)上,构建了重组质粒pYES2-PGA。用LiAc/SSDNA/PEG方法将其转化进酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)H158中表达,在不需要苯乙酸诱导的重组菌株发酵液中检测到了青霉素酰化酶活性,最高酶活达到0.75 U/ml。将该PGA基因测序结果与GenBank中巨大芽孢杆菌L04471.1、U07682.1和Z37542三株的PGA基因序列比对,表现出很高的同源性,分别达到97.1%、99.8% 和99.8%。     

转新疆雪莲去饱和酶基因sikSAD重组酵母低温和酒精耐受性分析

根据GenBank收录的sikSAD基因序列, 采用反转录PCR技术从新疆雪莲(Sasussured involucrata Kar. et Kir)中克隆了sikSAD基因, 并构建了pYES2-sikSAD大肠杆菌/酵母穿梭表达载体, 通过电击法转化酿酒酵母288C菌株, 并利用PCR和SDS-PAGE对转化酿酒酵母进行鉴定, 最后通过低温胁迫和酒精胁迫进行抗性初步分析及方差分析。结果表明: 低温胁迫实验中, 转sikSAD基因酿酒酵母在低温条件下仍能存活, 并且在温度恢复到28 °C时能迅速生长, 生长状态良好, 不饱和脂肪酸油酸的含量有明显的变化。酒精胁迫实验中, 其能耐受一定浓度的酒精, 并且耐受能力比非转基因酿酒酵母提高了十几个百分点。可见, 在低温胁迫和高浓度酒精条件下, 转新疆雪莲sikSAD基因酿酒酵母表现出了优良的活性和生长优势, 显示出较强的抗性特征, 用分子手段改造酿酒酵母, 为工业生产提供高质量的酿酒酵母奠定实验基础。     

金发草LEA 3 基因两个剪接体转化酿酒酵母的抗非生物胁迫功能分析

对金发草(Pogonatherum paniceum)第3组LEA蛋白(PpLEA3)基因两个剪接体进行分析,并利用酿酒酵母表达系统分析两个剪接体在不同非生物胁迫的响应差异.以PpLEA3基因两个剪接体(PpLEA3.a和PpLEA3.b)的重组载体pMD19-T-PpLEA3.a和pMD19-T-PpLEA3.b为模板,PCR法构建酵母表达载体pYES2-PpLEA3.a和pYES2-PpLEA3.b,并转化酿酒酵母细胞得到重组菌INV-PpLEA3.a和INV-PpLEA3.b.通过比较重组菌和对照菌(转空载体pYES2)在NaCl、NaHCO3、低温、干旱、UV胁迫下的恢复生长状况,结果表明两种重组菌胁迫后的生长情况明显好于对照菌,两个剪接体对非生物胁迫抵抗力的大小为:PpLEA3.a＞PpLEA3.b.两个剪接体在核酸序列上的差异导致了在蛋白亲水性和结构上的差异,最终导致了在抗逆能力方面的差异.