流感病毒感染诱导MDCK细胞凋亡的研究

用荧光染色、DNA凝胶电泳等方法检测了A型流感病毒株A1／京防86－1和B型流感病毒株B/沪防93－1诱导狗肾体代细胞(MDCKcells)的凋亡情况,并采用MTT法和流式细胞仪比较了这2株病毒对MMCK细胞的毒力和凋亡诱导能力水平。结果显示：病毒感染6h后,细胞DNA发生断裂,病毒感染12h后,可见明显的染色质凝聚;在一定范围内,细胞凋亡强度表现出明显的时间和剂量依赖关系;并且,A型流感病毒株的毒力和调亡诱导能力均强于B型流感病毒株。实验结果表明：流感病毒感染引起的细胞死亡主要是通过调亡实现的,毒力不同的流感病毒株诱导细胞调亡的能力不同。     

稳定表达人Siat7e基因的MDCK细胞系的建立和全悬浮细胞的驯化

目的:现有的禽流感疫苗生产的方法已经不能适应工业化大生产的需求,有必要开发全悬浮培养的细胞系来满足大生产的需求。方法:我们通过转染稳定表达 Siat7e 基因的真核表达载体对MDCK细胞进行改造,并经过后期的驯化,筛选适应于全悬浮培养的MDCK细胞。结果:成功筛选到能稳定表达 Siat7e 基因并能适应全悬浮生长的细胞系。结论:该细胞系具有潜在的应用价值,为MDCK细胞的培养以及工业化大生产疫苗提供参考。     

流感病毒感染诱导MDCK细胞调亡的研究

用荧光染色、ＤＮＡ凝胶电泳等方法检测了Ａ型流感病毒株Ａ１／京防８６－１和Ｂ型流感病毒株Ｂ／沪防９３－１诱导狗肾传代细胞（ＭＤＣＫｃｅｌｌｓ）的凋亡情况,并采用ＭＴＴ法和流式细胞仪比较了这２株病毒对ＭＤＣＫ细胞毒力和调亡诱导能力水平。结果显示：病毒感染６ｈ后,细胞ＤＮＡ发生断裂,病毒感染１２ｈ后,可见明显的染色质凝聚;在一定范围内,细胞调亡强度表现出明显的时间和剂量依赖关系;并且,Ａ型流感病毒株的毒     

MDCK单克隆细胞库的建立及检定

目的:建立甲型H1N1流感病毒疫苗株高适应MDCK单克隆细胞库,用于培养生产流感病毒疫苗,为细胞代替鸡胚制备流感病毒疫苗提供保证。方法:用有限稀释法将MDCK细胞进行单克隆化,通过血凝和TCID50筛选甲型H1N1流感病毒疫苗株的高适应性单克隆化细胞株,扩大培养建立细胞库并进行检定。结果:共制备了97株单克隆化MDCK细胞,筛选到甲型H1N1流感病毒疫苗株高适应性MDCK单克隆细胞株,扩大培养建立了细胞库,经检定符合《中华人民共和国药典.三部》(2010版)对细胞库的要求。结论:建立了甲型H1N1流感病毒疫苗株高适应性MDCK单克隆细胞库,为细胞培养生产流感病毒疫苗奠定了基础。     

怀牛膝细胞悬浮培养及多糖含量变化的研究

采用正交实验设计研究基本培养基、碳源、2,4-D、6-BA、CH及接种量对怀牛膝悬浮培养细胞生长和细胞中多糖含量的影响。结果表明,(1)6-BA是影响怀牛膝细胞生长的关键因子,其影响效应依次为6-BA>CH>接种量>基本培养基>2,4-D>碳源,细胞生长的适宜培养基为MS 30 g/L葡萄糖 2 mg/L 2,4-D 1 mg/L 6-BA 0.5 g/L CH,适宜接种量为30 g/L。(2)碳源是影响细胞中多糖含量的关键因子,其影响效应依次为:碳源>2,4-D>6-BA>CH>接种量>基本培养基,利于细胞中多糖含量提高的适宜培养基为:LS 30 g/L蔗糖 0.5 mg/L 6-BA 0.5 g/L CH,适宜接种量为30 g/L。     

石竹细胞悬浮培养研究

石竹细胞继代周期为 7d时 ,悬浮细胞培养系生长最快 ,生长率最高 ,而且培养物中胚性细胞较多 ,并能保持较快的分裂和生长 ,能促进已形成的大细胞团的生长和分化。转代时接种物与新鲜培养基的体积比以1∶2较好 ,悬浮系细胞生长最快 ,生长率最高 ,以 1∶2和 1∶3的高倍稀释接种有利于胚性细胞的形成及产生小的胚性细胞团 ,对悬浮系添加椰乳和水解乳蛋白的混合物 ,可较大幅度地提高悬浮细胞系的生长速率 ,单独添加上述两种物质的效果均不如二者的综合效应好。在 6种不同激素组合中 ,配方 2 (2 ,4 D 1 .5mg/L +NAA0 .5mg/L +6 BA 0 .5mg/L)最好 ,生长率最高。配方 5 (2 ,4 D 1 .5mg/L +NAA 0 .5mg/L +6 BA 1 .0mg/L)其次 ;配方 1 (2 ,4 D 1 .0mg/L +NAA 0 .5mg/L +6 BA 0 .5mg/L)次之。     

除虫菊细胞的悬浮培养

除虫菊悬浮细胞从培养后第8天开始迅速生长,14 d达到最大生长量,其最适培养基为:MS 4mg·L-12,4-D 0.1mg·L-1NAA 0.3 mg·L-16-BA 30 g·L-1蔗糖,最适接种量为15 g·L-1,摇瓶装液的体积分数为40%,初始培养的最适pH值为5.8,收获时pH下降为4.6±1,最适培养温度为25℃.     

怀牛膝细胞悬浮培养条件的优化

为进一步优化怀牛膝(Achyranthes bidentata)细胞悬浮培养条件,对接种量、继代周期、pH、光照及Cu2+等多种影响因子的作用效果进行了研究,以提高怀牛膝细胞生长量及牛膝多糖含量。结果显示,接种量50 g·L^–1、继代周期14天,pH5–6和光照培养可以使细胞保持良好的生长状态及多糖合成能力;添加50μmol·L^–1 Cu^2+,细胞的干重最大,可达44.63 g·L^–1,多糖含量也最高,为4.02 mg·g^–1。     

大蒜细胞悬浮培养生产SOD的初步放大

研究了大蒜细胞在发酵罐培养过程中pH变化、细胞生长、SOD合成及培养基中各种基质的消耗规律。结果发现,大蒜细胞发酵罐中悬浮培养的pH变化趋势为先降后升,波动范围为4 25～5 37,获得最大生物量和SOD总酶活分别为16 3gDW/L和7 72×104U/L,相应为摇瓶培养的73 69%和71 35%。同摇瓶培养相比,发酵罐培养基中各种基质消耗出现滞后现象,且利用效率偏低。     

MDCK细胞微载体悬浮培养放大工艺研究

MDCK细胞对各种流感病毒具有高度敏感性,广泛应用于流感病毒的分离和疫苗制备.通过探索培养基中促进细胞贴壁的关键组分,并筛选水解物,开发了适合MDCK细胞生长的低血清培养基.发现钙、镁离子是细胞贴壁不可缺少的物质,麦麸水解物可以部分代替培养基中的血清.利用该低血清培养基,经过消化转移将MDCK细胞从5L反应器放大至25 L反应器,微载体上细胞贴附均匀、生长旺盛,25 L反应器中培养48 h细胞密度可达30.5×105 cells/ml.研究结果为工业规模反应器微载体悬浮培养MDCK细胞生产流感病毒奠定了基础.     

细胞密度和营养供给对H1N1流感病毒产率的影响

探究细胞培养生产流感病毒过程中,高细胞密度引起低单位细胞病毒产率(Svy)的原因及找到解决方法。通过增加微载体浓度以及换液操作获得较高的细胞密度;考察了感染时细胞密度(CCI)和病毒感染用维持培养基对病毒产量和单位细胞病毒产率的影响。在12.6 g/L微载体培养过程中,通过换液操作,可获得高细胞密度,达到1.47×107 cells/m L。在CCI为1×107cells/m L条件时,选择合适的维持培养基,其Svy最高达到5.14×103 virions/cell,比同等条件下用DMEM维持培养基的Svy值提高了近一倍。高密度培养MDCK细胞生产流感病毒时,充分考虑不同阶段的培养条件和营养需求,可以提高细胞密度和单位细胞病毒产率,进而提高流感病毒的产量。该研究结果为工业化生产流感病毒疫苗提供了基础数据。     

Vero 细胞流感病毒的大规模培养和纯化

目的：采用反应器技术以细胞为基质培养流感病毒,并探索其纯化工艺。 方法：采用5L反应器无血清条件下以Vero细胞为基质培养流感病毒,病毒收获后,经灭活、澄清,采用阴离子柱去除宿主DNA,亲和柱浓缩流感病毒,最后采用分子筛三步层析法进行纯化。结果：整个纯化工艺HA回收率达102%,蛋白降低率为95.3%,宿主蛋白降低率为99.77%,DNA的降低率为99.99%。结论 本研究成功建立了一种细胞流感病毒的纯化工艺。     

A型流感病毒H5N1的M2离子通道稳定细胞株的建立

A型流感病毒H5N1的M2离子通道(H5M2)基因经优化后由人工合成,适合于哺乳动物细胞中表达.通过酶切克隆于pcDNA4质粒,并在HEK293细胞中建立稳定细胞株.Western blotting和免疫荧光证实H5M2在稳定细胞中只有在四环素诱导下才能表达,并经膜片钳证实在HEK293细胞中表达的H5M2具有H 通道活性,为M2离子通道功能的研究和M2离子通道阻断剂筛选方法的建立提供了参考.     

昆虫细胞（Sf21）悬浮培养过程中生长限制性基质间歇补加技术的 …

基于ｒ２１昆虫细胞在浮过程中所表现出的生长代谢特征,提出以培养液中残糖浓度作为控制参数,并利用限制性基质（葡萄糖和蛋白水解物）的间歇补加技术调控细胞生长的方案。实际控制表明：与批培养相比,Ｓ１ｆ２１细胞在两种具代表性的昆虫水解物）的间歇补加调控细胞生长的方案。实际控制表明：与批培养相比,Ｓｆ２１细胞在两种具代表性的昆虫细胞培养基（ＩＰＬ－４１和ＴＣ－１００）中的生长期和稳定期部都到有效的延长。ＴＣ     

转谷氨酰胺酶2抑制H1亚型流感病毒在MDCK细胞中的增殖

组织转谷酰胺酶(transglutaminase 2,TGM2)是一种普遍存在的多功能蛋白,与不同细胞的粘附和肿瘤形成有关.有证据表明,TGM2参与了宿主细胞与病毒间的相互作用,但是对于流感病毒在细胞内增殖的影响还未有报道.为了探究MDCK细胞中TGM2对H1N1亚型流感病毒增殖的影响,本研究构建了TGM2过表达和敲除...