Gaussia分泌型萤光素酶的研究进展及其应用

Gaussia分泌型萤光素酶是近年发现的一种来源于海洋桡脚类动物Gaussia princeps的新型分泌型萤光素酶,是目前已知的可自然分泌的最小萤光素酶,因其分子小、灵敏度高、半衰期短和可高效分泌,而成为一种理想的报告基因,广泛应用于体内外研究。我们就Gaussia分泌型萤光素酶的发光原理、荧光特性及其应用等进行简要综述。     

膜锚定Gaussia萤光素酶的细胞标记及生物荧光成像

目的:制备表达膜锚定Gaussia萤光素酶(extGluc)报告基因的慢病毒,用于标记细胞。方法:将报告基因extGluc克隆至慢病毒载体pCCsin.PPT.SFFV.IRES.eGFP.Wpre(VeGFP)中,以聚乙烯亚胺(PEI)介导,将慢病毒包装所需4种质粒(pVeGFP-extGLuc、pMDL、pRev、pVSVG),转染293FT细胞,72 h后收集病毒上清进行浓缩,感染293FT细胞,并用流式细胞仪检测病毒滴度,生物荧光成像和化学发光分析extGluc的表达;之后,用收集的慢病毒感染人单核细胞白血病细胞株U937。结果:对经PCR筛选出的阳性克隆所含质粒进行酶切鉴定,表明extGlu报告基因插入载体中;重组慢病毒包装成功且病毒滴度为5×106 TU/mL;用包装的病毒颗粒感染293FT细胞,生物荧光成像和化学发光证实extGluc的膜定位,且酶活性与细胞数目呈线性相关;病毒颗粒能够感染悬浮细胞U937。结论:包装了extGluc标记的重组慢病毒,可用于标记细胞,为体内监测细胞迁移、聚集和变化提供了一种方法。     

双萤光素酶共表达载体构建及特性研究

利用来源于TaV的自剪切多肽2A的编码序列构建一种分泌型萤光素酶Gluc和非分泌型萤光素酶Fluc共表达的载体,对其体内外表达及活体成像特点进行研究。采用重叠PCR技术获得Gluc-2A-Fluc片段,克隆入表达质粒pAAV2neoCAG中,获得重组质粒pAAV2neoCAG-Gluc-2A-Fluc。将重组质粒瞬时转染BHK-21细胞,24h后在细胞上清液和细胞裂解液中均能检测到Gluc和Fluc的表达,其中Gluc98%以上分布在上清液中,而Fluc98%以上存在于细胞中,随时间延长Gluc活性在上清液中逐步增加,而细胞内Fluc活性则保持相对平稳。用水动力法经小鼠尾静脉注射pAAV2neoCAG-Gluc-2A-Fluc质粒DNA,通过尾静脉微量采血(2.5μl/次)即可实时地监测体内Gluc的表达情况。活体成像结果显示,注射Gluc的底物腔肠素时小鼠明显表现为全身显像,显像在10min内迅速衰减;而注射Fluc的底物D-Luciferin时显像主要集中在肝脏,显像在30min内都比较稳定。本研究设计和构建的pAAV2neoCAG-Gluc-2A-Fluc质粒实现了分泌型和非分泌型萤光素酶的共表达,既可以在不裂解细胞或处死动物的情况下直接在细胞培养上清或血液中动态检测Gluc的活性,又可以利用活体成像技术准确定位Fluc表达部位,比单一的萤光素酶报告载体在细胞标记和体内示踪研究方面更具优越性。     

利用萤光素酶标记的肿瘤细胞建立肝癌原位移植模型及其活体成像

目的：利用生物发光成像技术非侵入性地监测活体裸鼠原位肝癌发展过程。方法：将包含有萤火虫萤光素酶基因的pCI-neo-Luc载体转染人肝癌HepG2细胞系,筛选获得具有高萤光素酶活性的细胞克隆;利用流式细胞仪对萤光素酶表达的稳定性进行初步研究,并分析细胞的生物发光情况;持续表达萤光素酶的肿瘤细胞培养扩增后被植入裸鼠皮下,2周后以形成的异体瘤作为供体瘤,进行肝脏原位移植手术;对建立的肝癌原位移植模型,用影像学资料显示肿瘤部位,用IVIS成像系统动态监测肿瘤生长情况。结果：体外影像的结果显示,表达萤光素酶细胞的数量与发光强度呈正相关;活体成像的结果显示。成功地建立了萤光素酶标记的原位肝癌动物模型。结论：生物发光成像可以监测活体内肝癌演进过程,为抗肿瘤药物的筛选和评价提供了新的手段和工具。     

萤光素酶报告基因在病毒学研究中的应用

萤光素酶是一类在氧气存在下能催化其底物特异性发光的酶,检出灵敏度高、特异性强。萤光素酶催化底物发光因无须外源光的激发,避免了非特异性干扰,具有其他报告基因不可替代的优势。萤光素酶基因作为报告基因已成为医学科学研究领域的重要标记工具,具有良好的应用前景。我们简要综述了萤光素酶报告基因在病毒学研究中的应用进展。     

萤光素酶表达质粒pEE14.1-luc的构建及表达

目的:为研究10 kb以上DNA疫苗质粒的体内电穿孔递送,构建萤光素酶报告基因表达质粒p EE14.1-luc,并验证其表达。方法:从质粒p GL3-CMV中通过酶切、补平和纯化的方法获得萤光素酶基因luc,克隆入p EE14.1载体,构建重组表达质粒p EE14.1-luc,瞬时转染293T细胞,采用Western印迹、流式细胞术和免疫荧光等方法对萤光素酶基因在体外的表达情况进行验证,并运用活体成像仪检测萤光素酶基因在小鼠活体内的表达。结果:经菌液PCR鉴定和测序验证,p EE14.1-luc与预期设计完全一致;流式细胞术检测luc阳性表达率为22.41%,免疫荧光检测可见绿色荧光表达,Western印迹检测在相对分子质量为62×103处显现目的蛋白条带;同时,利用活体成像技术也检测到萤光素酶基因在小鼠活体内的表达。结论:p EE14.1-luc表达质粒构建成功,为研究DNA疫苗体内表达机制和体内电穿孔递送条件优化奠定了基础。     

人p53启动子萤光素酶报告基因的构建及其活性测定

目的：克隆p53基因的启动子,插入萤光素酶报告基因载体,并检测启动子活性。方法：采用PCR技术从人肝癌细胞系HepG2基因组中扩增人p53启动子,插入萤光素酶报告基因载体pGL4．0-empty,将重组质粒转染293T、ZR75-1、HepG2、A549细胞,测定p53启动子的转录活性。结果：构建了p53启动子的萤光素酶报告基因;通过测序及质粒酶切鉴定,所构建的p53启动子正确;活性实验表明,报告基因在多种细胞中显示构建的p53启动子活性,并呈现一定的剂量效应;转录因子USF能以剂量效应方式提高p53报告基因的转录活性。结论：克隆了人p53启动子,为进一步研究调控p53的转录因子奠定了基础。     

血管内皮细胞生长因子启动子突变体萤光素酶报告基因载体的构建

目的：构建含有不同片段血管内皮细胞生长因子（VEGF）基因的启动子的萤光素酶报告基因载体,并定位缺氧诱导因子1a（HIF-1d）结合VEGF启动子的区域。方法：以VEGF全长启动子为模板,PCR扩增VEGF启动子的不同片段,插入萤光素酶报告基因载体pGL4-basic,确定所扩增的DNA序列后,将其与HIF-1a表达载体共转染293T细胞,定位HIF-1a结合VEGF启动子的区域。结果：测序结果表明扩增的不同片段的VEGF启动子序列正确;萤光素酶活性实验表明,-1128～-728bp片段是HIF-1a与VEGF相互作用激活VEGF启动子转录活性的区域。结论：克隆了VEGF启动子5’端缺失突变体报告基因表达载体,为调控VEGF表达的转录因子的筛选及功能研究打下了良好基础。     

人乳腺癌MDA-MB-231细胞裸鼠移植瘤模型的建立及生物学特性研究

目的-建立人乳腺癌MDA-MB-231细胞株裸小鼠模型,研究其生物学特性,观察MDA-MB-231乳腺癌细胞在移植前后的形态学变化。方法-将人乳腺癌细胞MDA-MB-231接种于裸鼠腋窝处皮下,每3天测量肿瘤大小,第30天处死小鼠。肿瘤组织及相关脏器送病理切片。皮下肿瘤组织细胞及细胞株培养HE染色。结果-肿瘤生长较快,成功率为72%,病理检查符合人乳腺癌细胞特征。肿瘤组织细胞及培养细胞形态学未见显著差异。结论-人乳腺癌细胞株MDA-MB-231裸小鼠模型建立方法较简便,细胞形态无明显差异,且保持了人乳腺癌的生物学特性。     

动物模型BLUP法评定内蒙古白绒山羊的遗传趋势

本研究应用动物模型BLUP法估计了1989～1998年内蒙古鄂托克旗阿尔巴斯白绒山羊种羊场抓绒量和抓绒后体重的遗传进展。结果为抓绒量的遗传进展呈上升趋势,抓绒后体重的遗传进展基本平稳。研究表明,内蒙古白绒山羊根据个体表型值选种,存在准确性较差和难以同时兼顾两个性状的缺点。本文认为今后内蒙古白绒山羊选种方法应该采用动物模型BLUP法。 Abstract:In this study,animal model BLUP method was used to estimate genetic trend for cashmere yield and bodyweight during 1989～1998 at Albas goats farm,Etuoke Banner,Inner Mongolia.The results were that genetic trend for cashmere yield had a rising trend and for bodyweight showed smooth.The study indicated selecting Inner Mongolia cashmere goats based on phenotypic value had a low accuracy and was difficult to give consideration to the two traits at the same time.The article raised animal model BLUP method should be used to select Inner Mongolia white cashmere goats in future.     

两种人乳腺癌裸鼠移植模型的建立

目的建立简便的人乳腺癌裸鼠移植模型,并探讨其部分生物学特性。方法采用雌激素受体阴性的MDA-MB-231和SK-BR-3人乳腺癌细胞株,分别接种于10只裸鼠左侧腋窝皮下,移植细胞总数为1×107/只。观察肿块生长情况,第42天处死荷瘤鼠,切除肿块作病理切片。结果 MDA-MB-231接种后第5d在接种部位可见结节,成瘤率为90%（9/10）,接种42 d肿瘤体积426.6±333.8,瘤重0.417±0.276,病理学检查为浸润性导管癌;SK-BR-3接种后第11天在接种部位可见结节,成瘤率为80%（8/10）,接种42 d肿瘤体积357.5±246,瘤重0.325±0.167,病理学检查为浸润性导管癌。结论该方法建立的人乳腺癌裸鼠移植模型,皮下移植方法简单,易于操作,成功率较高,肿瘤可部分保持人乳腺癌生物学特性,为研究人乳腺癌提供了重要工具。     

动物模型BLUP法估计内蒙古白绒山羊育种值的研究

应用动物模型ＢＬＵＰ法估计了阿尔巴斯白绒山羊种羊场１９８９－１９９８年共１０个年度３９８１只个体的抓绒量和体重的单性状育种值,以及这两个性状的综合育种值。在模型中考虑的固定效应有年龄效应和性别－群体－年度效应、随机效应有个体的加性效应和个体永久性环境效应。比较育种值选择与表型值选择的结果表明：⑴公羔依据断乳重选择与依据育咱值选择的结果差异较大;⑵育成母羊依据表型值选择与依据综合育种值选择的结果差异     

动脉粥样硬化动物模型研究进展

动脉粥样硬化是严重危害人类健康的常见病、多发病之一.动脉粥样硬化动物模型的研制对研究其发病机制、病理变化及其防治起着重要作用.近年来,对动脉粥样硬化模型的研究颇多.本文从模型动物的选择、造模方法及模型的评价指标方面对动脉粥样硬化动物模型的研究进行综述,为今后动脉粥样硬化的研究提供一定的线索.     

Hedgehog信号通路与乳腺癌

近年来的研究表明,Hedgehog信号通路在肿瘤的发生发展中具有重要的作用,该通路基因突变或异常表达将导致多种器官肿瘤的发生,并与Wnt、MAPK等信号通路相互作用,共同调节肿瘤的发生发展。我们简要综述了Hedgehog信号通路在乳腺癌发生发展中的重要作用,旨在了解乳腺癌发生、发展的分子机制.     

乳腺癌转移相关基因表达调控网络的线性微分方程模型的初步研究

初步构建乳腺癌转移相关基因表达调控网络的线性微分方程模型,并分析模型的可靠性和生物学意义. 采用基因芯片技术,分别对30例伴有淋巴结转移的乳腺癌组织及其相应淋巴结转移癌组织进行基因表达谱的比较,选择差异基因通过线性微分数学方法构建表达调控网络模型. 差异表达基因共27个,其中Ratio > 3的明显上调基因14个,而Ratio < 0.33的明显下调基因13个. 比较伴有淋巴结转移的乳腺癌组织和其相应淋巴结转移癌组织,分析筛选了27个表达差异基因,应用数学线性微分方程方法初步构建乳腺癌转移相关基因表达调控网络的线性微分方程模型,通过分析模型中重要节点、通路的生物学意义,判定网络的数学特性,初步表明,调控网络的可靠性和乳腺癌转移的形成是与多基因、多通路异常引起的细胞恶性转化相关.     

药物诱导乳腺癌细胞凋亡作用机理的研究

乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤,乳腺癌的诊断、治疗及预后与其细胞凋亡密切相关。本文对国内外有关药物诱导乳腺癌细胞凋亡的作用机制如药物对细胞周期、线粒体膜电位、细胞内钙离子浓度及caspase家族的影响等内容进行概述,试图为抗乳腺癌新药物的研发找到新的途径。     

乳腺癌与MICA基因多态性的相关性研究

目的:研究海南汉族人群MICA等位基因的多态性与乳腺癌的相关性。方法:采用PCR-SSP和PCRSBT方法对样本MICA等位基因的多态性进行检测分析。结果:乳腺癌患者中有检测出10种MICA等位基因,其中MICA*002/019基因型频率较对照组显著偏低(OR=0.32,Pc0.05)。结论:MICA*002/019基因型可能与乳腺癌的保护相关。