PI3K信号通路通过Skp2、p27调节肝癌细胞的增殖

探讨磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)信号通路调节肝癌细胞增殖的机制.用LY294002特异性阻断PI3K信号通路后,人肝癌细胞(SMMC-7721)的增殖明显被抑制.RT-PCR及蛋白质印迹结果显示,LY294002增加了p27蛋白的表达,但不影响p27的mRNA表达.在LY294002处理的细胞中转入p27的RNAi质粒以干扰p27蛋白的表达后,肝癌细胞的增殖能力可部分恢复.放线菌酮(Chx)处理实验表明,阻断PI3K信号通路使p27蛋白的半衰期延长,稳定性增加.进一步研究发现,LY294002可抑制介导p27蛋白降解的关键分子Skp2的mRNA表达,还可缩短Skp2蛋白的半衰期,降低Skp2蛋白的稳定性.但在SMMC-7721中分别转染PI3K下游重要靶分子Akt的持续激活和失活突变体,却并不影响p27蛋白的表达.这些结果表明,PI3K信号通路在转录及翻译后水平调节Skp2的表达而影响p27蛋白的降解,从而调节肝癌细胞的增殖,但Akt并没有参与这种调节.     

P13K信号通路通过Skp2、p27调节肝癌细胞的增殖

探讨磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）信号通路调节肝癌细胞增殖的机制．用LY294002特异性阻断P13K信号通路后,人肝癌细胞（SMMC-7721）的增殖明显被抑制．RT-PCR及蛋白质印迹结果显示,LY294002增加了p27蛋白的表达,但不影响p27的mRNA表达．在LY294002处理的细胞中转入p27的RNAi质粒以干扰p27蛋白的表达后,肝癌细胞的增殖能力可部分恢复．放线菌酮（Chx）处理实验表明,阻断P13K信号通路使p27蛋白的半衰期延长,稳定性增加．进一步研究发现,LY294002可抑制介导p27蛋白降解的关键分子Skp2的rnRNA表达,还可缩短Skp2蛋白的半衰期,降低Skp2蛋白的稳定性．但在SMMC-7721中分别转染P13K下游重要靶分子Akt的持续激活和失活突变体,却并不影响p27蛋白的表达．这些结果表明,P13K信号通路在转录及翻译后水平调节Skp2的表达而影响p27蛋白的降解,从而调节肝癌细胞的增殖,但Akt并没有参与这种调节．     

Skp2参与HeLa细胞G_2/M周期检查点的调控

具癌基因特性的Skp2在大多数肿瘤组织和肿瘤细胞中异常高表达,它作为SCFSkp2复合物的底物识别亚基调控p27KIP蛋白的稳定性而促进细胞G1/S期转换.为进一步明确Skp2与G2/M周期检查点的关系,在HeLa细胞中过表达Skp2以及通过反义寡核苷酸抑制Skp2表达.结果发现:Skp2能促进细胞周期运转,表现为S期细胞增多和G2/M期细胞减少,其中F-box结构域具有重要的功能意义;反义寡核苷酸抑制Skp2表达后,HeLa细胞发生显著的G2/M期阻滞;MTT检测结果表明,400nmol/L的Skp2的反义寡核苷酸能明显抑制HeLa细胞的增殖活性;Western印迹结果表明,HeLa细胞中Skp2可能通过负调控p21WAF的稳定性来参与G2/M检查点调控,这在用放线菌素D处理HeLa细胞的实验中得到验证.这些结果初步揭示了Skp2参与HeLa细胞G2/M周期检查点调控的分子机制.     

HeLa细胞中Skp2的表达调控p21WAFCIP1稳定性

泛素 蛋白酶体抑制剂MG 132处理的HeLa和SaoS 2细胞中 ,低表达的p2 1WAF CIP1受泛素 蛋白酶体通路调控 .为探讨肿瘤细胞中高表达的E3连接酶底物结合亚基 Skp2和低表达的p2 1WAF CIP1之间的关系 ,在HeLa细胞中转染Skp2的反义寡核苷酸后 ,p2 1表达水平明显升高 .同时 ,相对于转染空载体和Skp2ΔF(Skp2的F box缺失突变体 )的真核表达载体 ,转染全长Skp2的HeLa细胞中 ,p2 1表达水平显著下降 ,说明肿瘤细胞中Skp2调节p2 1的稳定性 ,并且这种调控作用依赖于Skp2蛋白中的F box结构 .免疫荧光结果表明 ,Skp2和p2 1共定位于细胞核 ,这为两者间的相互作用提供了前提 ;体内相互免疫共沉淀结果表明 ,p2 1和其它SCFSkp2 的底物一样与Skp2直接结合 ,并且它们之间的结合区不在F box结构域 ,这一结果在体外的GST pulldown实验中得到验证     

Skp2和P27在食管鳞状细胞癌中表达及其临床意义

目的:研究S期激酶相关蛋白2(Skp2)与细胞周期素抑制因子P27在人食管鳞状细胞癌中蛋白冰平的表达差异,分析二基因的相互关系及其与食管鳞癌浸润深度、组织学分级、淋巴结转移等临床病理因素间的关系,探讨Skp2和P27在食管鳞癌发生发展过程中的作用及其临床意义.方法:应用免疫组化检测49例食管鳞癌及其切缘正常组织中Skp2和P27的表达,用PearsonX<'2>检验分析二者的表达在两组间是否有差别;用Pearson X<'2>检验和Fisher's确切概率法分析Skp2和P27表达与食管鳞癌患者性别、年龄、临床分期、病理组织学分级、淋巴结转移等临床病理因素间的关系;用Pearson相关系数分析食管鳞癌中Skp2和P27两者表达的相关性;结果:Skp2在食管鳞癌及其切缘正常粘膜组织中的阳性表达率分别为57.1%和20.0%,(P<0.05).P27在食管鳞癌及其切缘正常粘膜组织中的阳性表达率分别为51.0%和85.0%,(P<0.05).Skp2和P27的表达与临床分期、组织学分级、淋巴结转移显著相关,与患者性别、年龄无显著相关,且二者在食管鳞癌中表达呈显著负相关.结论:食管鳞癌中Skp2基因在蛋白水平高表达,在切缘正常粘膜组织中低表达,P27蛋白表达与Skp2蛋白表达之间呈负相关.Skp2和P27表达与食管鳞癌肿瘤临床分期、组织学分级、淋巴结转移等临床病理因素密切相关.     

Skp2蛋白在牙龈癌中的表达及其临床病理学意义

目的:肿瘤细胞的增殖和发展与多种细胞周期调控因子的异常密切相关,Skp-2通过泛素化降解p27,使肿瘤细胞G1-S期调控发生紊乱,从而参与肿瘤细胞的某些生物学性状,本实验探讨牙龈癌发生发展过程中Skp2蛋白的表达以及其与牙龈癌临床病理学之间的意义.方法:收集同期46例牙龈癌及22例正常牙龈组织标本,制备组织切片,应用SP免疫组化法检测正常黏膜及牙龈癌中Skp2蛋白的表达,以及Skp2蛋白在牙龈癌不同病理分级和临床分期中的表达.结果:Skp2蛋白在正常口腔粘膜组织与牙龈癌中的阳性表达率差异有统计学意义,Skp2蛋白在牙龈癌中的阳性率(32.61％,显著高于正常黏膜组织4.55 ％)(x2=6.51P＜0.05).应用阳性表达率表示Skp2与牙龈癌的临床分期、病理分级、性别、年龄之间的关系,结果显示Skp2与牙龈癌的临床分期及病理分级显著相关成正比例关系,差异具有统计学意义(P＜0.05),而与年龄、性别等因素不相关,无统计学差异(P＞0.05).结论:Skp2蛋白在口腔牙龈癌的临床分级和病理分级成正比例相关,与年龄、性别无显著相关,Skp2可能在牙龈癌的发生发展中起着重要的正向调控作用,检测Skp2有助于判断牙龈癌的恶性程度及其预后,为临床判断病变程度及治疗提供更加合理的方案.     

Nucleostemin siRNA对肝癌细胞HepG2增殖的影响

Nucleostemin(NS)作为核仁蛋白,在神经干细胞、胚胎干细胞以及某些肿瘤细胞中均高表达,在多种肿瘤细胞增殖和凋亡调控中具有重要作用.本文通过瞬时转染NS siRNA降低NS的表达,以探究NS对HepG2细胞增殖和凋亡的影响.结果显示,下调NS表达使HepG2细胞增殖加快,G₁期细胞减少,S期及G₂/M期细胞增加,凋亡减少. 激光共聚焦实验表明,NS与S期激酶相关蛋白2 (S-phase kinase associated protein 2,Skp2)在HepG2细胞中存在共定位现象; Co-IP实验证明,NS与Skp2能相互作用|NS下调后,Skp2出核仁的数量增加,p27和p53表达降低. 总之,下调NS可促进HepG2细胞中Skp2从核仁逸出,p27降解增强,同时p53表达下降,或由此促进HepG2细胞增殖,抑制其凋亡.     

Skp2RNA干扰对人结肠癌HCT116细胞p27表达及对5-氟尿嘧啶敏感性影响的研究

目的:细胞S期激酶相关蛋白2(S-phase kinase associated protein,Skp2)作为泛素化降解过程中的一种F-box蛋白,在泛素化降解中起着特异性的底物识别和关键性的速率限制作用.依赖Skp2的泛素化降解途径参与p27、p21等众多细胞周期调控因子的降解,进而通过影响G1-S检测点而调控细胞周期.本研究探讨靶向干扰人结肠癌HCT116细胞中Skp2基因对细胞p27表达的影响及细胞对5-氟尿嘧啶(5-FU)敏感性的变化.方法:将已合成好的特异性的Skp2RNA干扰载体转染人结肠癌HCT116细胞,G418稳定筛选后,通过RT-PCR和Western印迹法分别检测细胞内p27mRNA和蛋白的表达情况,MTT法检测细胞对5-Fu敏感性的变化.结果:在转染干扰载体后,HCT116细胞内的p27mRNA表达无明显变化,蛋白水平却明显上升.MTT显示HCT116细胞对5-FU敏感性较其他组显著提高,IC50值明显下降(P＜0.05).结论:Skp2基因的RNA干扰能够上调结肠癌细胞内源性p27蛋白的表达,并提高5-FU对癌细胞的杀伤作用,为大肠癌的基因治疗提供了新的思路.     

组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA抑制鼻咽癌CNE2细胞生长及对Skp2表达的影响

目的研究曲古抑菌素A（TSA）体外对鼻咽癌细胞CNE2的抑制作用及S期激酶相关蛋白2（Skp2）基因表达的影响,并探讨其作用机制。方法采用MTT法观察不同浓度TSA对CNE2细胞的生长抑制作用;采用RT-PCR分析TSA作用前后及不同TSA浓度下鼻咽癌细胞中细胞周期调控基因Skp2的表达。结果不同浓度的TSA对CNE2细胞有明显的生长抑制作用,并呈现一定的量效关系;同时,TSA可降低CNE2细胞Skp2的基因表达,且这种表达与剂量有一定关系。结论TSA能明显抑制CNE2细胞的增殖．其作用机制与细胞周期调控基因Skp2异常表达有关。     

CyclinE-CDK2相关蛋白与细胞周期调控

细胞周期蛋白(cyclin)E和周期蛋白依赖性激酶(CDK)2的复合物CyclinE-CDK2为细胞从G1期进入S期的关键激酶复合物,在细胞从G1期进入S期过程中起着至关重要的作用.它通过磷酸化其下游一系列底物如Rb、CDC6、NPAT和P107等而使细胞启动DNA合成,从而使细胞不可逆转地进入S期.CyclinE-CDK2除了受到其下游RB/E2F通路的正调控外,同时也受细胞中其他一些因子的调控,如CIP/KIP家族蛋白的负调控作用,以及Skp2-SCF介导的泛素化降解作用等.