用单链噬菌体载体克隆DNA

丝状单链DNA大肠杆菌型噬菌体M 13、fd及f1,近来被作为一类新的DNA克隆载体而发展起来了,它的优点显著超过其它载体,包括其它两类大肠杆菌寄主的克隆载体:质粒和噬菌体λ。本综述描述单链噬菌体载体的生物学及应用方法以及测量插入DNA大小和排列方向的快速方法,特别是单链载体对DNA定序和离体位点定向诱变     

一种快速简便的噬菌体DNA的抽提方法

噬菌体DNA的制备和纯化是分子生物学研究中极为重要的一环,在基因库和eDNA库的建立,以及DNA克隆和筛选等方面都是不可缺少的。噬菌体DNA的制备可以通过噬菌体感染细菌在琼脂板上繁殖(称为平板法),也可以在液体培养液中繁殖(称为液体法)。平板法多用     

用单链DNA噬菌体作基因克隆载体

近年来,含有单链DNA的大肠杆菌噬菌体M13,fd和fl迅速发展为一类新的DNA克隆载体,由于它们具有某些其他载体所没有的优点,因而正在得到广泛应用。 一、基本性质 单链DNA噬菌体按其形态可分为两类:1)多面体单链DNA噬菌体,如G4,φX174,S13等。2)丝状单链DNA噬菌体,包括M13,fd和fl。M13和fd的全序列已     

噬菌体重组酶介导的DNA同源重组工程

来源于噬菌体的遗传操作工具在基因工程中具有非常重要的地位,例如位点特异性重组酶、柯斯质粒DNA文库及同源重组酶等。其中,来源于Lambda噬菌体的同源重组酶Redα/Redβ和来源于Rac原噬菌体的同源重组酶RecE/RecT能够高效地介导35–50bp短同源臂之间的重组。基于噬菌体同源重组酶Redα/Redβ和RecE/RecT开发的DNA同源重组工程(Recombineering)能够对靶标DNA分子进行快速、精准、高效的修饰,不受限制性内切酶识别位点和DNA分子大小限制,已发展成为一种新型的基因工程技术。本文主要综述了噬菌体同源重组酶及其作用机制、在大肠杆菌及其他细菌中的应用和开发,以及在微生物次级代谢产物的挖掘、动植物转基因、病毒基因组克隆和修饰等方面的应用。原位激活沉默基因簇需要宿主特异性的DNA同源重组工程进行启动子和调控元件的修饰;异源表达次级代谢产物的首要步骤一般是通过RecET直接克隆大的DNA片段;动植物转基因复杂载体的构建效率在有了Red同源重组系统以后有了革命性的发展;RecET直接克隆和Red同源重组介导的感染性克隆构建和修饰方法,不仅有利于病毒基因组功能研究...     

《重组DNA实验室手册》

《重组DNA实验室手册》(Recombinant DNA laboratory manual)修订版,由Judith W.Zyskind和Sanford I.Bernstein著,1992年出版,224页。该书著者J.W.Z.精通细菌遗传学和分子生物学,而s.I.B.在真核基因操作上是专家。每个DNA分子生物学家都需要有能力操作大肠杆菌及其噬菌体。该书包括的技术有:基本微生物操作;染色体、质粒、M13和入噬菌体DNA提取;凝胶电泳;活体诱变;限制性绘图;限制性片段离析和克隆;DNA测序;探针标记;DNA凝胶印迹法、噬菌斑迹法和分子杂交。修订版还包括了新的实验室技术即聚合酶链反应,它对基因分析是场革命。读者对象为具有分子生物学背景,但在操作DNA分子上经验有限的科研人     

用硫酸铵沉淀法从液体培养物中纯化噬菌体λDNA

噬菌体是近年来DNA克隆最常用的载体之一。因此高质量的λDNA的制备是DNA重组的一项关键性技术。所谓高质量的λDNA制品应不被宿主菌的DNA所污染,DNA链必需完整而不被折断成碎片,并能被工具酶所加工。迄今制备λDNA的方法的主要差别在于对噬菌体颗粒的纯化步骤并存在一些缺点:PEG沉淀结合CsCI梯度离心法费用大。得率低,而且费时,不适合于多个样品DNA的快速提纯。纤维素酶DE-52层析法的缺点是大量的溶菌物过柱后,DE-52会结块,而且要有多套层析设备。直接从PEG沉淀的噬菌体颗粒提取的DNA往往纯度不高,需要有亚精胺存在时才能被限制性内切酶所切割。1989年,Ziai等首先用(NH_4)_2SO_4从平板培养法制备的噬菌体溶菌物中沉淀λgtll颗粒。用RNase处理去除污染的宿主菌RNA后,先用蛋白酶K,再用NaOH处理使λ噬菌体颗粒裂解,再用酚抽     

噬菌体DNA的快速抽提

介绍一种噬菌体DNA的快速抽提方法.用聚乙二醇沉淀噬菌体颗粒,然后经DEAE纤维素纯化处理和酚抽提.与传统的噬菌体DNA纯化方法相比,改进后的方法方便、快速、经济,可获得高纯度的噬菌体DNA.     

高效率提取λ噬菌体DNA离体包装抽提物

λ噬菌体DNA在与被克隆的DNA片段结合成重组体后,需进行体外包装才能形成侵染性的噬菌体颗粒。这里仅就如何提取高效能人噬菌体DNA包装抽提物（包装蛋白）谈谈体会。（1）菌落的选择从BHB2688和BHB2690的不同菌落中提取的包装抽提物的包装效率（讨U小g／＊＊A）可相差10倍以上。因此在大量制备以前,有必要先挑选多个菌范小批量制备抽提物并测定其包装效率,取优良者进行制备。（2）热诱导后的培养时间文献所载,在热诱导后培养至细菌可被氛仿裂解时即可停止。但我们的经验是12”IX10’养一段时间可明显提高抽提物的效价（见图1）…     

一株新分离的肠杆菌噬菌体的快速遗传鉴定及其宿主识别基因的快速克隆

以大肠杆菌8099为宿主自医院污水中分离出一株肠杆菌噬菌体IME08,其遗传物质经RNA酶、DNA酶处理证实其为DNA,用限制性内切酶处理该DNA证实其为双链DNA。利用随机引物PCR技术扩增并克隆该噬菌体基因组的随机片段,经测序后同源比对,判断该噬菌体是一株新的T4-like噬菌体。根据4株T4-like噬菌体 (T4,JS98,T2及K3) 宿主识别基因 (g37) 5'端的高度保守序列,采用随机PCR与巢式PCR结合的“基因组跳跃”策略快速克隆出了该噬菌体的宿主识别基因g37和g38。     

一种改进的快煮制备质粒DNA和噬菌体DNA的方法

质粒DNA和噬菌体DNA的提取,是基因操作过程中最基本的、也是比较重要的一个步骤。而制备纯度高的制品,缩短操作时间,又是人们普遍感兴趣的。提取闭合环状共价DNA(cccDNA)(包括质粒DNA和噬菌体DNA)的基本原理是利用大分子染色体DNA片段与环状共价DNA的理化性质差别来进行的,方法多种:SDS法,酸酚法,PEG法,煮     

重组DNA技术导论《基因控制基础实验》

本书系美国Minnesota大学生物系高年级学生和研究生实验课教材,着重介绍了重组DNA的基本原理,并阐明了大肠杆菌的生长,培养、保存方法,以及入噬菌体质粒和M13为载体的分子克隆实验技术。     

YAC克隆系统

目前,利用质粒和噬菌体作为载体,已完成了许多基因与基因组DNA片段的克隆及作图.但是,质粒和噬菌体所能携带的外源DNA片段的大小是很有限的.一般来说,入噬菌体能携带的DNA片段不超过25kb;Cosmid质粒所能携带的DNA片段不超过45kb.而现在发现的一些大基因,如人类的Factor VIII基因(180kb)和Dystrophin基因(1800kb)都已远远超过上述载体的克隆容量.这些容量较小的克隆载体,在克隆真核基因组的染色体时,遇到了巨大的困难.为了克服这一难题,80     

在枯草杆菌中有启动子功能的噬菌体T5 DNA片段的克隆

用启动子探针质粒pTG 402为载体,用鸟枪射击法克隆了噬菌体T5 DNA的片段。克隆中的2％含有具启动子功能的插入片段,其中pTG 402-20含有启动功能最强的插入片段。DNA-DNA分子杂交实验结果表明,pTG 402-20的插入片段能与T5 DNA Hind Ⅲ酶切的G和B片段杂交。这个插入片段的大小约为0.84kb。     

噬菌体φ297切除酶(xis)基因的克隆和序列分析

目的:克隆噬菌体φ297 切除酶(xis)基因,并对其进行遗传与变异研究。方法:提取埃希氏大肠杆菌O157:H7 菌株EH297染色体DNA,采用步移PCR方法寻找目的基因,并通过克隆、亚克隆、DNA测序等分子生物学方法获得切除酶基因,通过序列分析软件对此基因进行分析。结果:克隆获得噬菌体φ297编码的切除酶基因(xis)的完整序列,它的长度是255 bp,编码了一个84个氨基酸组成的蛋白质(Xis),将它们的序列与λ噬菌体的切除酶家族的其它成员进行了比较。其结果是噬菌体φ297的切除酶基因(xis)与噬菌体VT1-Sakai的切除酶基因(xis)只有4个核苷酸的不同,而Xis蛋白与噬菌体VT1-Sakai的Xis蛋白是一样的,与噬菌体933W的Xis蛋白只有47.2%的相似性。结论:噬菌体φ297编码的切除酶基因(xis)与λ噬菌体的切除酶基因同源。     

噬菌体Ψ297切除酶(xis)基因的克隆和序列分析

目的：克隆噬菌体ψ297切除酶(xis)基因,并对其进行遗传与变异研究。方法：提取埃希氏大肠杆菌O157：H7菌株EH297染色体DNA,采用步移PCR方法寻找目的基因,并通过克隆、亚克隆、DNA测序等分子生物学方法获得切除酶基因,通过序列分析软件对此基因进行分析。结果：克隆获得噬菌体ψ97编码的切除酶基因(xis)的完整序列,它的长度是255bp,编码了一个84个氨基酸组成的蛋白质(xis),将它们的序列与λ噬菌体的切除酶家族的其它成员进行了比较。其结果是噬菌体ψ297的切除酶基因(xis)与噬菌体VT1-Sakai的切除酶基因(xis)只有4个核苷酸的不同,而Xis蛋白与噬菌体VT1-Sakai的Xis蛋白是一样的,与噬菌体933W的Xis蛋白只有47．2％的相似性。结论：噬菌体ψ297编码的切除酶基因(xis)与λ噬菌体的切除酶基因同源。     

金黄色葡萄球菌中PVL基因与噬菌体DNA的同源性

为了探讨金黄色葡萄球菌PVL基因与噬菌体的相关性,从4株含有PVL基因的菌株中分离出DNA,用HindⅢ或EcoRI酶切后,分别与PVL和Lukm-lukF-PV探针进行Southern印迹杂交,以及对含有PVL基因及其下游区域的片段克隆、测序和同源性分析。结果表明3株菌的PVL基因及其下游区域的序列与V8菌株噬菌体ΦPVL的PVL基因及其下游噬菌体stt site的序列一致。另一菌株的LukM-lukF-PV基因与ΦPVL,的PVL基因有78％的同源性,并且在LukM-lukF-PV基因的下游区域发现与金黄色葡萄球菌噬菌体Φ11整合位点有98％同源性的序列,根据PVL基因存在于噬菌体的基因组上,推测可通过噬菌体转导在金黄色葡萄球菌中传播。     

损伤DNA 的“SOS”修复

活体细胞内的DNA会受到许多外界因素,诸如射线、带电离子、化学药物等的损伤。在活细胞中,有一系列原有的或由损伤因素诱导产生的酶,能对DNA的各种损伤进行不同形式的修复。易错修复(error-prone DNA repair),即修复时容易发生错误。它是M.Radman首先发现的。他用紫外线照射λ噬菌体和ΦX174噬菌体,然后用这种噬菌体去感染经紫外线轻度照射过的大肠杆菌,结果是被照射过的λ噬菌     

一种改良的快速筛选重组DNA噬菌体噬斑的原位杂交技术

报道了一种从表达型噬菌体载体——λgt11构建的基因文库中筛选重组DNA噬菌体噬斑的改良蛋白质-蛋白质原位杂交枝术。此法可使噬菌体在硝酸纤维素薄膜上增殖至原噬斑大小,经适当处理后,即可用特异性抗体探针进行原位筛选,以 获得含目的基因编码的特异抗原蛋白的阳性克隆株。与己报道的筛选方法相比,此法具有简便快速、灵敏可靠的特点;也可试用于由表达型质粒载体构建的基因文库之菌落原位筛选。     

产生志贺样毒素的噬菌体ψ297整合酶基因(int) 的克隆和序列分析

目的克隆并分析细菌性噬菌体ψ297的整合酶基因(int).方法采用加接头的基因DNA片断为模板进行步移PCR,根据溶源性噬菌体ψ297的染色体DNA上类似于噬菌体933W的整合酶基因的一个40个核苷酸设计引物,进行扩增、克隆、亚克隆、测序和序列分析.结果得到了噬菌体ψ297编码的整合酶基因(int)的完整序列,它的长度是1287bp,编码了428个氨基酸的Int蛋白质.将它们的序列与λ噬菌体的整合酶家族其它成员进行了比较,发现噬菌体ψ297的整合酶基因(int)与噬菌体VT1-Sakai的整合酶基因有79%的同源性,噬菌体ψ297的Int蛋白与噬菌体VT1-Sakai的Int蛋白在氨基酸序列上有82%的同源性.N-末端的氨基酸区域是完全保守的,而中心区和C-末端则显示出较大差异.结论噬菌体ψ297与λ噬菌体的int基因来源于同一基因库,噬菌体ψ297可能属于λ噬菌体家族.     

产生志贺样毒素的噬菌体φ297整合酶基因（int）的克隆和序列分析

目的：克隆并分析细菌性噬菌体φ97的整合酶基因(int)。方法：采用加接头的基因DNA片断为模板进行步移PCR,根据溶源性噬菌体φ297的染色体DNA上类似于噬菌体933W的整合酶基因的一个40个核苷酸设计引物,进行扩增、克隆、亚克隆、测序和序列分析。结果：得到了噬菌体φ297编码的整合酶基因(int)的完整序列,它的长度是1287bp,编码了428个氨基酸的Int蛋白质。将它们的序列与λ噬菌体的整合酶家族其它成员进行了比较,发现噬菌体φ297的整合酶基因(int)与噬菌体VT1-Sakai的整合酶基因有79％的同源性,噬菌体φ297的Int蛋白与噬菌体VT1-Sakai的Int蛋白在氨基酸序列上有82％的同源性。N-末端的氨基酸区域是完全保守的,而中心区和C-末端则显示出较大差异。结论：噬菌体φ297与λ噬菌体的int基因来源于同一基因库,噬菌体φ297可能属于λ噬菌体家族。