Tra2β1蛋白在神经特异性的基因剪接中的功能

体外(in vitro)生化研究已证明哺乳动物Tra2蛋白是前体mRNA剪接的重要调控因子,但是,对该蛋白在in vivo条件下的剪接功能,尤其是在神经特异性基因剪接中的功能及其细胞特异性,目前所知甚少。本文采用in vivo分析模型,在COS-l和PFSK两种不同类型的细胞中,研究了两个神经特异性基因(GluR-B,SMN2)剪接的细胞特异性,同时分析了Tra2β1在这两个基因剪接中的功能及其细胞特异性。结果表明,在研究的两种细胞中,GluR-B和SMN2“小基因”的剪接均具有明显的细胞特异性;而Tra2β1蛋白的过量表达在这两种不同的细胞中对“小基因”的剪接有显著的相同倾向的调节作用,提示Tra2β1蛋白对该两个基因剪接的调节作用可能没有细胞特异性。     

前体mRNA剪接蛋白Tra2β1的抗体制备及鉴定

Tra2 β1是Tra2 β前体mRNA剪接调节蛋白家族中的一个组织分布最广、表达量最多的成员 ,它在选择性前体mRNA剪接中有调节功能 ,而在基础性剪接中不是必需的 .为便于对该蛋白功能的进一步研究 ,需要制备能特异地检测Tra2 β1蛋白的抗体 .选择包含Tra2 β1的N端 12个氨基酸的特异编码序列的Tra2 β2全长编码序列 (共 117个核苷酸 ) ,将其克隆至pGEX 3X表达载体形成GST融合基因 ,并以诱导表达和纯化的该融合蛋白为抗原免疫新西兰兔 ,获得了相应的抗体 .Western印迹和免疫细胞化学分析结果显示 ,获得的抗体能特异地检测Tra2 β1蛋白     

用于前体mRNA剪接机制研究的小基因模型的建立和研究应用

建立可用于选择性前体mRNA剪接分析的小基因模型. 以人或小鼠基因组DNA为模板, 通过PCR扩增获得GluR-B, FGF-2R和Zis小基因片段, 并将其克隆至真核表达载体中, 构建了小基因的质粒. 在此基础上, 将上述3个小基因模型和剪接因子Tra2β1或Zis2表达质粒共转染HeLa细胞, 并用RT-PCR进行了被剪接的小基因产物的半定量检测. 结果表明, 这些小基因可用于细胞水平的基因剪接分析, 利用该技术平台, 发现了Zis2亚型可以促进Zis小基因选择性剪接.     

SRp38基因在小鼠视网膜细胞中的表达以及对GluR-B小基因可变剪接的调控

SR蛋白在前体mRNA可变剪接调控中发挥重要作用.SRp38作为一种新近发现的具有神经及生殖组织特异性的SR蛋白,能够调控一些在神经组织中起重要作用的基因(如GluR-B,Trk-C,NCAML1等)的前体mRNA可变剪接,同时还可以在有丝分裂M期及热休克时抑制前体mRNA剪接的发生.利用Western blot以及免疫组织化学方法研究了SRp38蛋白在小鼠视网膜中的表达以及分布情况,结果显示,SRp38蛋白在视网膜中的表达具有区域特异性,在外网层、内核层、内网层以及节细胞层中均有表达,而在外核层无表达.对分离培养的小鼠视网膜细胞进行免疫双标记分析的结果表明,SRp38蛋白在视杆-双极细胞的胞体、轴突、树突中表达.通过瞬时共转染以及RT_PCR分析,发现在R28细胞中,SRp38过表达可以促进GluR-B小基囚Flip亚型的剪接.结果提示SRp38蛋白可能通过调控小鼠视网膜内前体mRNA可变剪接、进而在小鼠视网膜功能中发挥重要作用.     

U2AF65蛋白表达水平影响基因UBQLN1的可变剪接

目的:研究U2AF65蛋白的表达水平对基因UBQLN1可变剪接的影响。方法:应用pSR-GFP/Neo载体构建2个U2AF65-siRNA干扰载体,转染293T细胞,通过Western印迹、QRT-PCR检测干扰效果,RT-PCR验证基因UBQLN1的可变剪接。结果:利用设计的U2AF65-siRNA能够干扰细胞中U2AF65的表达;RT-PCR结果显示U2AF65表达水平的下降促使UBQLN1第8外显子的跳跃增加。结论:U2AF65可以通过表达水平的变化参与调控基因UBQLN1的可变剪接。     

山羊β—酪蛋白基因启动子指导人血清白蛋白基因在小鼠组织中的特异性表达

对本所构建的pcDNA3.1-β6.7hALBm表达载体行尾静脉注射直接转染哺乳期母鼠的活体组织。通过RT－PCR检测hALBm基因在小鼠几种组织中的表达来研究该构建体的组织特异性。结果：构建体在受试鼠组织中的表达显示了较好的乳腺组织特异性。说明构建具有较长5'端上游乳蛋白调控区的乳腺特异性表达载体对组织特异性表达是必需的。     

C型产气荚膜梭菌β1、β2毒素基因的融合

利用PCR技术 ,从C型产气荚膜梭菌染色体DNA中扩增出 β1 和 β2 毒素基因 ,构建了含 β1 - β2 融合基因表达质粒的重组菌株BL2 1(DE3) (pETXB1_2 )。经酶切鉴定和序列测定证实 ,构建的重组质粒pETXB1_2含有 β1 - β2 融合基因 ,且基因序列和阅读框架正确。经ELISA检测 ,重组菌株表达的 β1 - β2 融合蛋白能够被 β1 、β2 毒素抗体识别。免疫实验结果表明 ,用β1 - β2 融合蛋白免疫的小鼠可以抵抗 1MLD的C型产气荚膜梭菌C5 9_4 4毒素攻击 ,表明构建的重组菌株可以作为预防仔猪红痢基因工程亚单位苗的候选菌株。     

脊髓性肌萎缩症SMN1基因2+0基因型携带者的家系研究

脊髓性肌萎缩症(spinal muscular atrophy, SMA)是一种儿童时期较为常见的神经肌肉病,属于常染色体隐性遗传。绝大多数SMA由运动神经元存活基因1 (survival motor neuron 1, SMN1)的纯合缺失突变所致。而SMN1的2+0基因型个体作为一种特殊的SMA携带者,给携带者筛查以及家系的遗传咨询带来了巨大的挑战。已有研究表明,g.27134T>G和g.27706₂7707delAT多态位点变异对于Ashkenazi犹太人群中的2+0基因型个体具有提示作用。为进一步探究这两个多态位点是否在中国人群也具有特异性,本研究纳入了44例家系成员和204例已知SMN1基因拷贝数的对照样本。44例家系成员来自于9个无关的SMN1基因纯合缺失的SMA家系,先证者双亲之一疑似为2+0基因型携带者。利用多重连接探针扩增(multiplex ligation-dependent probe amplification,MLPA)和短串联重复(short tandem repeat, STR)连锁分析进行基因型的鉴定以及多态位点的筛查,最终...     

Smad2 与TGF-β1 基因在胰腺癌中的表达及临床意义

目的:通过检测Smad2与TGF-β1基因在胰腺癌中的表达,初步探讨它们与胰腺癌临床病理的关系。方法:采用免疫组织化学pv-9000法检测50例胰腺癌组织和10例正常胰腺组织中Smad2与TGF-β1的表达情况,并分析其与胰腺癌临床病理的相关性。结果:Smad2与TGF-β1在胰腺癌组织中的表达水平显著高于正常胰腺组织,两组之间存在显著差异(P<0.05)。在胰腺癌组织中,Smad2与TGF-β1的表达在胰腺癌不同分期中存在显著差异(P<0.05)。结论:Smad2与TGF-β1在胰腺癌中高表达,二者联合可作为反映胰腺癌临床分期的生物学指标。     

E2F-1基因在肺癌中的表达及意义

目的：探讨E2F-1基因在肺癌中的表达及意义。方法：采用免疫组化S-P法,检测60例肺癌及20例正常肺组织中E2F-1基因蛋白的表达情况。结果：E2F-1在肺癌组织中的阳性率为91.7%,显著高于正常肺组织的10%,两组间差异有显著性（P〈0.05）;E2F-1与肺癌患者的性别、年龄、组织学类型、分化程度及淋巴结转移等无相关性（P〉0.05）。结论：E2F-1的异常高表达在肺癌的发生发展中起重要作用,可作为肺癌基因诊断和治疗的靶点。     

E2F-1基因在肺癌中的表达及意义

目的:探讨E2F-1基因在肺癌中的表达及意义。方法:采用免疫组化S-P法,检测60例肺癌及20例正常肺组织中E2F-1基因蛋白的表达情况。结果:E2F-1在肺癌组织中的阳性率为91.7%,显著高于正常肺组织的10%,两组间差异有显著性(P<0.05);E2F-1与肺癌患者的性别、年龄、组织学类型、分化程度及淋巴结转移等无相关性(P>0.05)。结论:E2F-1的异常高表达在肺癌的发生发展中起重要作用,可作为肺癌基因诊断和治疗的靶点。     

外源TGF—β1基因在小鼠ES细胞中的表达及其对细胞分化的影响

本文利用逆转录病毒载体Ｄｏｌ,在其ＢａｍＨＩ酶切位点插入猪ＴＧＦ－β１ １．７ｋｂｃＫＮＡ,构建成表达质粒,并用磷酸钙沉淀法将该质粒ＤＮＡ转染到小鼠ＥＳ－５细胞,经Ｇ４１８筛选获得抗Ｇ４１８的ＥＳ－５细胞克隆（ＥＳ－Ｔ）,经ＲＮＡ点杂交,Ｎｏｒｔｈｅｒｎ印迹杂交证明有６个细胞克隆能表达外源猪ＴＧＦ－β１的ｍＲＮＡ,其中两个杂交信号较强的克隆进一步用Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹杂交,也证明猪ＴＧＦ－μ     

二化螟β1微管蛋白基因cDNA序列的克隆与序列分析

微管是真核生物体内分布最为广泛的一类蛋白,是由a-和β-两种不同的微管蛋白组成的异源二聚体.微管参与许多细胞功能,如细胞形态发生、细胞生长和分裂等.以二化螟3龄幼虫为材料提取总RNA,利用RT-PCR和cDNA末端快速扩增技术(RACE),扩增得到该虫的β微管蛋白基因的cDNA序列一条.cDNA序列含1 862个碱基,开放读码框1 344个碱基,编码氨基酸447个,分子量约为50.2kD,等电点4.82.氨基酸序列中1～4个氨基酸MREI为β微管蛋白转录后调控信号,是微管蛋白特异片段;氨基酸序列的140～146GGGTGSG位存在一个微管蛋白标志信号片段.序列比对表明,克隆的β微管蛋白基因与其他昆虫的β微管蛋白基因在核苷酸和氨基酸水平上都是高度同源的,与家蚕Bombyx moriβ1微管蛋白的氨基酸序列同源性达到99.1%,与烟草天蛾β1微管蛋白的氨基酸序列同源性达到98.7%,与果蝇Drosophila melanogasterβ1微管蛋白的氨基酸序列同源性达到96.9%.该基因cDNA序列已经登录Genbank并获得登录号为EU429675.     

TGF-β1基因真核表达载体的构建及在BMSCs中的表达

目的研究真核表达载体pCDNA3.1( )-TGF-β1在骨髓间充质干细胞(BMSCs)中的表达.方法基因克隆构建pCDNA3.1( )-TGF-β1真核表达载体,转染大鼠BMSCs,G418筛选获得稳定转染的细胞,RT-PCR、ELISA和免疫细胞化学检测其表达,MTT法检测其增殖活性.结果成功构建含TGF-β1基因的真核表达载体;RT-PCR、ELISA、免疫细胞化学证实了TGF-β1基因在BMSCs中至少可以表达一个月;MTT法提示转染TGF-β1基因可以促进BMSCs增殖.结论 pCDNA3.1( )-TGF-β1转染BMSCs可获得稳定表达.     

CSN1S2、CSN3和β-Lg基因对西农萨能奶山羊产奶性能的影响

利用PCRRFLP技术对69只西农萨能奶山羊群体的CSN1S2基因、CSN3基因和βlg基因多态性与产奶性状的相关性进行了研究。结果表明,CSN1S2基因的不同基因型与产奶性能间存在相关性:FF基因型个体前4胎平均产奶量显著低于NN基因型个体(P<0.05),FF基因型个体第2胎产奶量比NN基因型个体低90kg以上(P<0.01),提示CSN1S2基因座F等位基因可能与低产奶量有关。在CSN3HindⅢ基因座中,DE和EE基因型个体在第1、2、3、4胎产奶量和平均产奶量上差异不显著(P>0.05);在CSN3TaqⅠ基因座中,TT、TC和CC3种基因型个体在第1、2、3、4胎产奶量和平均产奶量上差异不显著(P>0.05);CSN3基因经HaeⅢ酶切没有发现多态性。对βlg基因5′侧翼区的分析发现,AA基因型个体各胎次产奶量均比AB型高,其中在第2、3胎产奶量和平均产奶量3项指标上都达到显著水平(P<0.05),提示βlg基因的A等位基因可能与高产奶性能有关。     

PNRC1剪接变异体的鉴定及其在辅激活核受体介导基因转录功能上的比较

为分析富含脯氨酸核受体辅调节蛋白1(PNRC1)选择性剪接, 及比较PNRC1剪接变异体在辅激活核受体介导基因转录功能上的差异,在生物信息学方法分析PNRC1剪接变异体的基础上,设计一定的特异性引物,采用RT-PCR结合克隆测序的方法对这些剪接变异体进行验证. 利用酵母双杂交和荧光素酶报告系统实验,分析它们与核受体的相互作用及比较它们在辅激活核受体介导基因转录功能上的差异.结果显示,生物信息学预测的几个剪接变异体真实存在于人的组织和细胞系中,这些剪接变异体在与雌激素受体α(ERα)、类固醇衍生因子1(SF1)等核受体的相互作用的强度及辅激活核受体介导基因转录功能上存在较大的差异. 研究提示,PNRC1这些剪接变异体在体内可能发挥不同的功能.     

Bmi-1和EZH2基因在小细胞肺癌中的表达及其意义

目的探讨Bmi-1和EZH2基因在小细胞肺癌中的表达及其意义。方法收集武汉大学人民医院病理科2006-2009年非小细胞肺癌存档蜡块40例,采用免疫组织化学S-P法检测40例非小细胞肺癌及癌旁组织中Bmi-1和EZH2基因的表达水平,并采用HPIAS-1000高清晰度彩色病理图文报告管理系统对Bmi-1和EZH2基因的表达进行定量分析,用SPSS11.5软件对各组免疫组织化学反应阳性颗粒的平均光密度、阳性面积率做单因素方差分析和SNK(q)检验。结果 1.Bmi-1在非小细胞肺癌中呈高表达,癌旁组织中呈低表达。非小细胞肺癌组织Bm i-1的表达明显高于癌旁组织,差异有显著性(P<0.05)。2.EZH2基因的表达EZH2基因在非小细胞肺癌中呈高表达,癌旁组织中呈低表达。非小细胞肺癌组织中EZH2基因的表达明显高于癌旁组织(P<0.05)。结论 EZH2和Bmi-1基因对肺癌的生长有着不同的调节作用,在肺癌的发生、发展中发挥重要的作用。     

BAI1及其相关蛋白BAIAP2的中枢调控机制

脑血管结构和功能异常与脑功能和脑疾病发生关系密切。脑特异性血管生成抑制因子1(brain-specific angiogenesis inhibitor 1, BAI1)是在正常脑组织中高度表达的跨膜蛋白,具有抑制血管生成、吞噬凋亡细胞和抑制肿瘤形成的功能。BAI1及脑特异性血管生成抑制因子1相关蛋白2(BAI1-associated protein 2, BAIAP2)可以调节神经元的信息传递,影响脑发育和脑功能,参与神经可塑性调节和多种神经精神疾病的发生发展。本文主要综述了BAI1与BAIAP2的结构特征及其与突触可塑性、学习记忆、神经精神疾病发生发展的关系和调控机制,旨在为系统阐明BAI1与BAIAP2的中枢调控功能拓宽思路。     

共济失调蛋白2结合蛋白1基因多态性与奥氮平所致体重增加的关联研究

目的:既往研究表明,共济失调蛋白2结合蛋白1(A2BP1)基因多态性可能与精神分裂症、孤独症及肥胖等复杂疾病关联,但目前尚无相关文献提示A2BP1基因多态性与抗精神病药所致体重增加的关联.本研究拟探讨A2BP1基因多态性与奥氮平治疗精神分裂症所致体重增加的关联.方法:本研究共入组350例精神分裂症患者,其中完成奥氮平(治疗剂量5～20 mg/d)治疗8周者为328例.采用阳性与阴性症状量表(PANSS)减分率评估药物疗效;分别于治疗前和治疗8周后测量并记录患者的清晨空腹体重并计算治疗前后体重增加率(％).提取患者外周血DNA,采用DNA测序基因分析方法,在328例汉族精神分裂症患者中,检测A2BP1基因4个单核苷酸多态性(SNP)位点(rs8048076,rs1478697,rs10500331,rs4786847)的基因型,并采用数量性状位点分析方法(QTL)探索A2BP1基因多态性与奥氮平治疗所致体重增加率的关联.结果:A2BP1基因rs8048076 (T=3.237;P=0.0012)及rs1478697 (T=2.956;P=0.0032)位点与奥氮平治疗精神分裂症8周后所致体重增加率关联(P＜0.05),经多重检验Bonferroni校正后仍有统计学意义;而rs10500331 (T=-0.293;P=0.769)与rs4786847(T=0.666; P=-0.505)在本样本中与奥氮平所致体重增加的关联无统计学意义(P＞0.05).结论:本研究结果提示在中国汉族人群中,A2BP1基因多态性可能与奥氮平治疗精神分裂症患者所致体重增加副反应关联,如能进一步验证及机制探索,则有望在精神科个体化治疗方面对药物所致体重增加的预测与防治提供线索依据.