假单胞菌M18 relA 突变株的构建及其对吩嗪-1-羧酸合成的调控

假单胞菌M18是一株能同时合成吩嗪-1-羧酸(PCA)和藤黄绿菌素两种抗生素的植物根际分离细菌。RelA催化合成的效应分子ppGpp能介导细菌因营养饥饿引起的应激反应。以M18菌株染色体DNA为模板,PCR扩增获得relA基因,通过庆大霉素抗性片段插入失活与同源重组技术,构建假单胞菌M18的relA突变菌株M18RAG。在PPM培养基中进行PCA发酵分析,发现突变菌株M18RAG的PCA产量显著升高,约为野生型菌株的1.5-2倍。relA基因反式互补实验以及phzA′-′lacZ翻译融合测定结果,均进一步证明了RelA对PCA生物合成及其基因表达具有抑制作用。     

假单胞菌M-18qscR突变株的构建及其对抗生素合成的调控

在革兰氏阴性菌中,全局性调控因子QscR参与菌群传感调节系统,调节多种毒素因子、次生代谢产物、稳定期基因以及参与生物膜形成的基因的表达,它通过与靶基因DNA启动子的调节元件结合,调节基因转录。假单胞菌株(Pseudomonas sp.)M-18是促进植物生长的根际细菌,能同时分泌藤黄绿菌素(pyoluterion,Plt)和吩嗪-1-羧酸(phenazine-1-carboxylicacid,PCA)。运用同源重组技术,构建了假单胞菌(Pseudomonas sp.)M-18株的qscR突变菌株M-18Q。比较野生株M-18和突变株M-18Q生物合成PCA和Plt的产量,在28℃恒温条件下,在PPM和KMB培养基中M-18Q菌株合成PCA的量分别约为野生型M-18菌株的4～6倍和3～5倍,分别达到480μg/mL和140μg/mL。在PPM培养基中,野生株M-18和突变株M-18Q几乎都没有Plt的合成,而在KMB培养基中,突变菌株和野生型M-18合成Plt的量基本一致。反式互补实验表明,在qscR突变株M-18Q中,PCA生物合成受到抑制而Plt的生物合成却不受影响。phzA基因是吩嗪合成基因簇中第一个基因,phzA‘-’lacZ翻译融合实验表明,qscR基因产物通过抑制PCA合成基因簇的表达,实施负调控作用。结果表明qscR基因是作为一个全局调控基因区别性地调控PCA和Plt的生物合成。     

rpoS基因插入突变对铜绿假单胞菌两个吩嗪合成基因簇的调控

【目的】为了研究铜绿假单胞菌rpoS基因对吩嗪(Phenazine)合成基因簇phz1和phz2的调控方式与机制。【方法】采用抗庆大霉素基因(gentamycin resistance cassette,aacC1)插入失活的策略构建了rpoS基因突变株PA-SG;同时利用lacZ的翻译融合表达载体pME6015,构建了phz1′-′lacZ和phz2′-′lacZ翻译融合表达载体pMEZ1和pMEZ2。采用电转化法分别将pMEZ1、pMEZ2和pME6015导入铜绿假单胞菌突变株PA-SG和野生株PAO1,用Miller法检测融合β-半乳糖苷酶活性。【结果】在KMB或PPM培养基中,pMEZ1在突变株PA-SG中的表达均增强,为野生株的4-5倍;而pMEZ2在突变株PA-SG中的表达均降低,野生株是突变株的2-3倍。【结论】由此推测,铜绿假单胞菌rpoS基因对两个不同吩嗪合成基因簇的调控作用具有特异性,在一定程度上,rpoS负调控phz1,正调控phz2。     

假单胞菌株M18 psrA突变株的构建及其对吩嗪-1-羧酸和藤黄绿菌素合成的调控

【目的】假单胞菌M18是一株能同时合成吩嗪-1-羧酸(PCA)和藤黄绿菌素(Plt)两种抗生素的植物根际促生细菌。PsrA为细菌TetR家族转录调控因子。为了研究PsrA对PCA与Plt生物合成的影响,从M18菌株基因组中扩增psrA基因。【方法】通过同源重组技术,构建庆大霉素抗性片段置换psrA的突变菌株M18psrA。利用基因互补、lacZ报告基因融合分析实验,验证PsrA对抗生素合成基因的调控作用。【结果】在PPM和KMB培养基中,分别比较野生型菌株M18和突变菌株M18psrA的PCA与Plt产量,突变菌株M18psrA的PCA产量显著下降;Plt产量显著升高,为野生型菌株的10-15倍。基因互补、lacZ报告基因融合分析,进一步证明了psrA正调控PCA的phz2合成基因簇,负调控Plt的合成基因簇。【结论】PsrA区别性调控抗生素PCA与Plt的生物合成。     

MvaT调控铜绿假单胞菌吩嗪的合成机制

【背景】属于H-NS家族的MvaT转录因子参与了铜绿假单胞菌的许多重要代谢过程,如吩嗪合成代谢,但其调控方式仍不十分明确。【目的】确定转录调控因子MvaT是否直接调控铜绿假单胞菌的吩嗪合成过程,即该蛋白是否可以直接结合2个吩嗪-1-羧酸合成基因簇(phzA1G1和phzA2G2)与3个分支转化基因(phzH、phzS和phzM)的上游启动子区域。【方法】以铜绿假单胞菌SJTD-1和其mvaT基因敲除突变株SJTD-1(ΔmvaT)为研究对象,检测其在不同培养基条件下吩嗪化合物的合成量差异。通过体外异源表达与亲和纯化,获得重组蛋白MvaT。利用凝胶阻滞实验,确定MvaT重组蛋白对5个吩嗪代谢基因簇/基因上游启动子的结合情况。【结果】mvaT基因敲除突变株SJTD-1(ΔmvaT)的吩嗪产量较野生型显著提升。MvaT重组蛋白被有效表达与纯化,体外凝胶阻滞实验结果显示,该重组蛋白可与phzA1G1、phzA2G2、phzM、phzS和phzH的上游启动子区域均发生特异性结合。其中,重组蛋白MvaT与phzA1G1和phzA2G2的结合区域位于其上游启动子的200 bp以内,而该蛋白与phzM、phzS和phzH的结合区域则位于其上游启动子的100 bp以内。【结论】MvaT蛋白通过直接结合吩嗪合成代谢基因的上游启动子区域来直接调控假单胞菌的吩嗪类化合物合成。     

假单胞菌M18rsmA-突变株的构建及其对Plt和PCA合成的区别性调控作用

假单胞菌(Pseudomonas sp．)M18是促进植物生长的根际细菌,能产生吩嗪-1-羧酸(PCA)和藤黄绿菌素(Plt)两种不同的抗生素抑制植物病原菌,保护植物免受病害。运用PCR方法,从M18基因组中,扩增出rsmA基因部分片段,并以该片段为探针,从M18的基因组柯斯文库中筛出阳性克隆,切取带有rsmA基因及两侧序列的1．5kb片段,中间插入编码Km‘的DNA片段,获得rsmA^-体外突变体。运用同源重组剔除技术,构建了M18菌株的rsmA突变株M18R^-。突变株M18R^-生物合成Plt的能力比野生型M18提高4倍,但是,PCA产量仅为野生型的20％。研究结果表明,全局性调控基因rsmA可能通过不同的机制区别性地影响Plt和PCA的生物合成。     

绿针假单胞菌GP72中aurI/aurR系统调控功能

【背景】绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis) GP72是一株可生产吩嗪类抗生素吩嗪-1-羧酸(PCA)和2-羟基吩嗪(2-OH-PHZ)的生防根际促生菌。基因组比对发现GP72菌中存在aurI/aurR双元调控系统。【目的】研究该系统对GP72中吩嗪类物质的调控作用。【方法】将aurI基因在大肠杆菌中异源表达,用紫色杆菌CV026和根癌农杆菌NTL4做显色实验。构建基因敲除菌株和回补菌株,发酵测量突变株的生长曲线与总吩嗪产量。构建转录融合质粒,测定吩嗪合成基因启动子的转录水平。【结果】显色实验显示,aurI能产生多种信号分子,使CV026显紫色、NTL4显蓝色。分别单独敲除aurI和aurR基因,同时敲除aurI/aurR基因,吩嗪产量均会升高,而回补菌株吩嗪产量降为野生型水平。β-半乳糖苷酶活性测定结果显示,突变株的酶活比野生型高。【结论】aurI/aurR负调控GP72的吩嗪合成,通过抑制吩嗪合成启动子的转录而影响吩嗪类物质的产量。     

铜绿假单胞菌M18 rsmY突变株的构建及其对PCA和Plt的区别性调控

【目的】在假单胞菌中,小RNA(sRNA)参与初级和次级代谢产物、多种毒素因子以及菌群传感系统的调控,通过在植物根际促生铜绿假单胞菌M18中研究RsmY对吩嗪-1-羧酸(PCA)和藤黄绿菌素(Plt)两种抗生素的调控作用,深入了解假单胞菌中次级代谢的途径并为构建高产抗生素工程菌株提供了一定的理论基础。【方法】运用同源重组技术,构建了铜绿假单胞菌M18株的rsmY突变菌株M18RY,通过基因过表达、lacZ报告基因融合分析实验,进一步验证了RsmY对抗生素合成基因的调控作用。【结果】比较野生型M18和突变株M18RY中PCA和Plt在同一培养条件下的生物合成量,突变菌株M18RY中PCA的产量显著增加,为野生型菌株的5倍左右,而Plt的产量降为野生型的1/8。LacZ报告基因融合分析进一步证明了RsmY对PCA的负调控作用主要是通过phz2基因簇来实现的。【结论】结果表明,rsmY基因区别性调控PCA和Plt的生物合成。     

温度对假单胞rsmA突变株M-18R合成Plt和PCA的区别性影响

次生代谢物阻遏蛋白(Repressor of secondary metabolite,Rsm)A是一种全局性调控因子,与mRNA的RBS结合,转录后水平上抑制基因翻译。运用同源重组技术,构建了假单胞茵(Pseudomonas sp．)M-18的rsmA突变菌株M-18R。在37℃、28℃恒温和短期升温(37℃、4h培养,转28℃继续培养)条件下,比较野生株M-18和突变株M-18R生物合成藤黄绿菌素(Plt)和吩嗪-1-羧酸(PCA)的量。在37℃条件下,M-18和M-18R合成这两种抗生物质的能力几乎受到完全抑制。在28℃条件下,M-18R合成P11的量约为野生型M-18的10倍,达到270μg／mL,但是合成PCA的量仅为野生型的50％。经短期升温培养,M-18的Plt合成量明显下降,PCA产量降低不显;相反,M-18R合成Plt的量达到400μg／mL,但PCA产量的变化仍不明显。推测,M-18菌株细胞内存在着某种与RsmA相关联的温度敏感因子,在RsmA缺失条件下,作为专一性激活剂促进Plt的生物合成,但是,并不参与对PCA合成的调控。     

假单胞菌M18rsmA-突变株的构建及其对Plt和PCA合成的区别性调控作用

假单胞菌(Pseudomonas sp.)M18是促进植物生长的根际细菌,能产生吩嗪1羧酸（PCA）和藤黄绿菌素（Plt）两种不同的抗生素抑制植物病原菌,保护植物免受病害。运用PCR方法,从M18基因组中,扩增出rsmA基因部分片段,并以该片段为探针,从M18的基因组柯斯文库中筛出阳性克隆,切取带有rsmA基因及两侧序列的15kb片段,中间插入编码Kmr的DNA片段,获得rsmA-体外突变体。运用同源重组剔除技术,构建了M18菌株的rsmA突变株M18R-。突变株M18R-生物合成Plt的能力比野生型M18提高4倍,但是,PCA产量仅为野生型的20%。研究结果表明,全局性调控基因rsmA可能通过不同的机制区别性地影响Plt和PCA的生物合成。     

Synthesis of cinnabarinic acid by metabolically engineered Pseudomonas chlororaphis GP72

Cinnabarinic acid is a valuable phenoxazinone that has broad applications in the pharmaceutical, chemical, and dyeing industries. However, few studies have investigated the production of cinnabarinic acid or its derivatives using genetically engineered microorganisms. Herein, an efficient synthetic pathway of cinnabarinic acid was designed and constructed in Pseudomonas chlororaphis GP72 for the first tim, which was more straightforward and robust than the known eukaryotic biosynthetic pathways. First, we screened and identified trans-2,3-dihydro-3-hydroxyanthranilic acid (DHHA) dehydrogenases from Escherichia coli MG1655 (encoded by entA), Streptomyces sp. NRRL12068 (encoded by bomO) and Streptomyces chartreusis NRRL3882 (encoded by calB₃) based on the structural similarity of the substrate and product, and the DHHA dehydrogenase encoded by calB₃ was selected for the synthesis of cinnabarinic acid due to its high DHHA conversion rate. Subsequently, cinnabarinic acid was synthesized by the expression of the DHHA dehydrogenase CalB₃ and the phenoxazinone synthase CotA in the DHHA-producing strain P. chlororaphis GP72, resulting in a cinnabarinic acid titer of 20.3 mg/L at 48 hr. Further fermentation optimization by the addition of Cu²⁺, H₂O₂, and with adding glycerol increased cinnabarinic acid titer to 136.2 mg/L in shake flasks. The results indicate that P. chlororaphis GP72 may be engineered as a microbial cell factory to produce cinnabarinic acid or its derivatives from renewable bioresources.     

Phenazine-1-carboxylic acid biosynthesis in <Emphasis Type="Italic">Pseudomonas Chlororaphis</Emphasis> GP72 is positively regulated by the sigma factor RpoN

The production of phenazine-1-carboxylic acid (PCA) and 2-hydroxyphenazine (2-OH-PHZ) makes Pseudomonas chlororaphis GP72 an effective biocontrol agent. In order to understand how production of PCA is regulated by RpoN, an insertional mutation in rpoN has been made in P. chlororaphis GP72. Production of PCA in the rpoN mutant strain GP72N decreased both in King’s B medium and in Pigment Producing Medium. Moreover, the expression of the translational fusion phzA′–′lacZ was reduced about 2-fold in GP72N compared to wild type strain, whatever the growth medium is. Complementation of rpoN gene in mutant GP72N restored its motility and its PCA biosynthesis ability. However, overexpression of RpoN had no major effects on the expression of the RpoN-dependent phenotypes described in this study for P. chlororaphis GP72. These results suggest that RpoN is involved as a positive regulator in the regulation of PCA biosynthesis in P. chlororaphis GP72.     

假单胞菌株M18gacA基因对BHL和HHL合成正调控及对PCA合成负调控无相关性

经初步鉴定,假单胞菌株(Pseudomonassp.)M18至少能产生5种N-酰基高丝氨酸内酯类(N-acyl-homoserinelactones,AHLs)信号分子,它们是:N-丁酰高丝氨酸内酯(N-butyryl-L-homoserine lactone,C4-HSL,BHL)、N-己酰高丝氨酸内酯(N-hexanoyl-L-homoserine lactone,C6-HSL,HHL)、N-3-氧-己酰高丝氨酸内酯[N-(3-oxohexanoyl)-L-homoserinelactone,3-Oxo-C6-HSL,OHHL]、N-3-氧-辛酰高丝氨酸内酯[N-(3-oxooctanoyl)-L-homoserine lactone,3-Oxo-C8-HSL,OOHL]和N-3-氧-癸酰高丝氨酸内酯[N-(3-oxodecanoyl)-L-homoserine lactone,3-Oxo-C10-HSL,ODHL)。在gacA突变菌株M18G中,信号分子的积累量明显减少,且只能检测出其中的4种;同时,吩嗪-1-羧酸(Phenazine-1-carboxylic acid,PCA)的合成量比野生株M18提高了2倍左右。在M18菌株中,基因rhlⅠ的编码产物参与BHL和HHL的合成。构建rhlI’-’lacZ翻译融合表达质粒pMEIZ,分别导入野生株M18和突变株M18G,突变株M18G的半乳糖苷酶活性比野生株M18下降约40%,表明GacA对基因rhlI的表达具有正调控作用。但是,在野生株M18和突变株M18G的发酵液中,分别或同时添加过量的外源BHL和HHL,对PCA合成的影响不显著,表明在突变株M18G中,PCA合成量的增加与BHL和HHL合成量的减少没有明显的相关性。     

基于ARTP诱变和高通量筛选的绿针假单胞菌GP72育种方法

【目的】绿针假单胞菌GP72是一种植物根围促生细菌,其分泌的次级代谢产物2-羟基-吩嗪(2-OH-PHZ)具有广谱抗真菌活性,但其产量较低,不能满足农业生产的应用需求,因此需对GP72进行改造,从而提高产量。【方法】从GP72的野生株出发,首次将2-OH-PHZ合成途径的限制性因子Phz O用绿色荧光蛋白(GFP)替换,以一种新型的常压室温等离子体技术(Atmospheric and room temperature plasma,ARTP)进行诱变,通过酶标仪测定96孔板中突变株的荧光强度进行高通量筛选;最后将荧光强度高的菌株中绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein,GFP)替换为Phz O以获得2-OH-PHZ高产突变株。【结果】经过五轮诱变后,获得一株荧光强度增加1.62倍的突变株,用phz O基因回替后,该突变株在KB培养基中摇瓶培养时2-OH-PHZ的产量为野生型的4.62倍。【结论】基于安全、高效ARTP诱变技术,并以GFP替换限制性因子作为标记进行高通量筛选,可以快速获得高产2-OH-PHZ的GP72突变株,克服了传统诱变育种方法筛选难度大、费时费力的不足,为其它微生物的育种提供了参考。     

假单胞菌M18调控基因ppbR的克隆及功能研究

假单胞菌 (Pseudomonas sp.) M18 是促进植物生长的根际细菌, 能产生吩嗪-1-羧酸 (PCA) 和藤黄绿菌素 (Plt) 两种不同的抗生素。根据生物信息学分析, 铜绿假单胞菌PA2572基因编码蛋白可能是一个双元调控系统的应答调节子。本研究从假单胞菌M18基因组中扩增出PA2572同源基因片段ppbR, 利用体外定点插入突变和同源重组技术构建了M18 的ppbR突变株M18P。研究结果表明, 突变株M18P在泳动能力和群集运动能力上有显著的下降。突变株合成PCA 的能力比野生型有显著的下降, 在发酵液中PCA积累量仅为野生型的50%。在KMB培养基中, 突变株Plt的积累量和野生型没有显著的差异。     

假单胞菌株M18中pqsA突变株的构建及其对plt的调控

【目的】根际铜绿假单胞菌M18能产生藤黄绿菌素(Plt)和吩嗪-1-羧酸(PCA)两种主要的抗生素。其PqsR/PQS群体感应系统由应答调控蛋白PqsR与信号分子PQS组成。前期研究已经表明pqsR负调控Plt生物合成及基因簇表达。本论文旨在研究PQS分子对Plt合成及基因表达的调控作用。【方法】从M18基因组中扩增PQS合成基因pqsA,通过同源重组技术构建假单胞菌M18的pqsA突变菌株M18pqsA。利用lacZ报告基因分析、信号分子添加实验等,研究PQS对Plt合成及基因表达的调控作用。【结果】在KMB培养基中,分别比较野生型菌株M18和突变菌株M18pqsA的Plt产量,突变菌株的Plt产量存在较小幅度的升高,约为野生型菌株的1.53倍。添加PQS对plt表达存在一定程度但不是很显著的负调控作用。【结论】PQS分子对Plt生物合成及基因表达存在部分负调控作用。