多核苷酸合成的研究 Ⅱ.CpUpCp、GpUp和CpUpCpGpUp的合成

本文报道了酵母丙氨酸转移核糖核酸3’-端茎区顺序中CpUpCpGpUp五核苷五磷酸的合成。_(HO)U(OBz)-p-NHC_6H_5同_(MMT)GA~(AC)(OAc)-p或_(MMT)G~(iBu)(OiBu)-p用DCC缩合再脱去5’-MMT后可分别得到_(HO)G~(Ac)(OAc)-p-U(OBz)-p-NHC_6H_5和_(HO)G~(iBu)(OiBu)-U(OBz)-p-NHC_6H_(50) _(HO)U(OBz)-p-NHC_6H_5同_(Bz)C~(Bz)(OBz)-p用DCC缩合再脱去3’-末端磷酸的苯胺保护基得到_(Bz)C~(Bz)(OBz)-pU(OBz)-p,此保护二核苷酸再同_(Ho)C~(Bz)(OBz)-p-NHC_6H_5用DCC缩合,然后再脱去3’-末端磷酸的苯胺保护基得到_(Bz)C~(Bz)(OBz)-p-U(OBz)-p-C~(Bz)(OBz)-p。此保护的三核苷酸同_(Ho)G~(Ac)(OAC)-p-U(OBz)-p-NHC_6H_5用DCC缩合,然后脱去3’-末端磷酸的苯胺保护基和全部酰基保护基并经7M尿素柱层析纯化,最后得到自由的五核苷酸CpUpCpGpUp。产物经纸电泳、薄板层析鉴定为均一,用牛胰核糖核酸酶水解后得到预期的核苷酸组成比例。     

多核苷酸合成的研究——Ⅲ.CpUpCpG>p的合成

本文报道用PNPase和RNase N_1相结合的方法合成了CpUpCpG>p。选择适当的反应条件,包括1.CpUpC:GDP=1:5(克分子比),2.RNase N_1:PNPase=4:1(活力单位比),3.反应pH为7.6,4.37°反应10小时,CpUpCpG>p产率可达64%。另有18%开环产物CpUpCpGp。后者又可用氯甲酸乙酯进行环化得到60%产率的CpUpCpG>p。     

多核苷酸合成的研究——Ⅳ.UpCpCpA的合成

用化学合成或化学与酶促合成相结合的方法均能制备得到UpCpCpA(图1)。化学合成包括“2 2”和“1 3”两条路线。参考Mackey和Gilham方法,在PNPase催化下,引物UpCpC与2′(3′)-O-甲氧乙基ADP反应进行单一加成可产生30%的UpCpCpA。为了获得纯的产品,采用了二次柱层析法(图2)。文中讨论了PNPase连接的转核苷酸作用问题。     

多核苷酸合成的研究 Ⅲ.CpUpCpG>p的合成

本文报道用PNPase和RNase N_1相结合的方法合成了CpUpCpG>p。选择适当的反应条件,包括1.CpUpC∶GDP=1∶5(克分子比),2.RNase N_1:PNPase=4∶1(活力单位比),3.反应pH为7.6,4.37°反应10小时,CpUpCp@>p产率可达64%。另有18%开环产物CpUpCpGp。后者又可用氯甲酸乙酯进行环化得到60%产率的CpUpCpG>p。     

多核苷酸合成的研究 Ⅳ.UpCpCpA的合成

用化学合成或化学与酶促合成相结合的方法均能制备得到UpCpCpA(图1)。化学合成包括“2+2”和“1+3”两条路线。参考Mackey和Gilham方法,在PNPase催化下,引物UpCpC与2’(3’)-O-甲氧乙基ADP反应进行单一加成可产生30%的UpCpCpA。为了获得纯的产品,采用了二次柱层析法(图2)。文中讨论了PNPase连接的转核苷酸作用问题。     

多核苷酸合成的研究 Ⅹ.GpCpm~1Ⅰ和pGpCpm~1Ⅰ的合成

本文报导了GpCpm~1Ⅰ和pGpCpm~1Ⅰ的化学合成和酶促合成。同用DCC缩合并脱去3′-磷酸上的苯胺保护基后得到,后者再同缩合,然后脱去全部保护基经DEAE-葡聚糖凝胶A-25柱层析和电泳分离纯化而得到GpCpm~1Ⅰ纯品。而同用DCC缩合并脱去全部保护基后可得到Cpm~1Ⅰ,然后在核糖核酸酶N_1作用下同pG>p联结并经DEAE-葡聚糖凝胶A-25柱层析和电泳分离纯化则得到pGpCpm~1Ⅰ。GpCpm~1Ⅰ和pGpCpm~1Ⅰ均经酶解后得到预期的核苷酸组成比例。     

多核苷酸合成的研究——Ⅶ.RNA连接酶合成十六核苷酸(CpUpCpGpUpCpCpApCpUpCpGpUpCpCpA)

~(32)pCUCGUCCA(作为供体),CUCGUCCA(作为受体),其比例为1:50,在RNA连接酶催化下,进行连接反应,形成16核苷酸片段即CUCGUCCA~(22)pCUCGUCCA。反应后产物经Sephadex G-75柱分离,分离后得到的产物通过下列鉴定:抗碱性磷酸单酯酶;同系层析;毗邻分析等。证明是我们所希望的产物,其产率经过重复在50～70%之间。这种RNA连接酶对合成具有一定排列顺序的RNA片段,可以认为将是一种很好的工具酶。     

固定化多核苷酸磷酸化酶的研究——Ⅱ.用固定化酶制备Poly I和Poly C

固定化PNP酶柱反应器在pH9,37℃,含有6微克分子/毫升MgCl_2,0.04%NaN_3,11～12微克分子/毫升CDP(IDP)的条件下,连续聚合反应1.5～2个月,转化率基本不变。所得的Poly I,Poly C用Lowry法测不出蛋白,紫外吸收光谱符合标准。按人体用量放大350～400倍进行急性动物毒性试验证明无毒害作用。可以省去自然酶制备Poly I,Poly C过程中酚脱蛋白的工艺。     

多核苷酸合成的研究——ⅩⅣ.EcoRI 接头片段脱氧八核苷七磷酸的合成

本文采用化学方法和化学与酶促相结合的方法分别合成了自身互补的EcoRI 接头片段脱氧八核苷酸d-GpGpApApTpTpCpC。化学方法使用二酯法(4 4)的路线,各中间片段和最终产物用DEAE-葡聚糖凝胶A-25柱层析纯化。酶促合成是用化学合成的两个片段d-GGAA和d-TTCC,借RNA 连接酶连接成脱氧八核苷酸。两种方法合成的八核苷酸都能被限制性内切酶EcoRI 识别并水解得到预期的产物,同时双向指纹图谱分析证明合成的产物具有正确的核苷酸排列顺序。     

多核苷酸合成的研究 Ⅶ.RNA连接酶合成十六核苷酸 (CpUpCpGpUpCpCpApCpUpCpGpUpCpCpA)

~(32)pCUCGUCCA(作为供体),CUCGUCCA(作为受体),其比例为1∶50,在RNA连接酶催化下,进行连接反应,形成16核苷酸片段即CUCGUCCA~(32)pCUCGUCCA。反应后产物经Sephadex G-75柱分离,分离后得到的产物通过下列鉴定:抗碱性磷酸单酯酶;同系层析;毗邻分析等。证明是我们所希望的产物,其产率经过重复在50～70%之间。这种RNA连接酶对合成具有一定排列顺序的RNA片段,可以认为将是一种很好的工具酶。     

固定化多核苷酸磷酸化酶的研究——Ⅰ.固定化多核苷酸磷酸化酶的制备及其基本性质

对-重氮基苯磺酰乙基琼脂糖是制备固定化多核苷酸磷酸化酶的较好材料,与具有同样活性基团的纤维素和葡聚糖凝胶G200相比,活力回收高、稳定性好。固定化酶的最适pH 向偏碱的方向转移,最适温度较自然酶为宽,表观米氏常数与自然酶基本一致。57℃保温30分钟尚保留70%以上的活力,而自然酶仅剩余22%的活力,说明稳定性有所提高。     

固定化多核苷酸磷酸化酶的研究——Ⅰ.固定化多核苷酸磷酸化酶的制备及其基本性质

对-重氮基苯磺酰乙基琼脂糖是制备固定化多核苷酸磷酸化酶的较好材料,与具有同样活性基团的纤维素和葡聚糖凝胶G200相比,活力回收高、稳定性好。固定化酶的最适pH向偏碱的方向转移,最适温度较自然酶为宽,表观米氏常数与自然酶基本一致。57℃保温30分钟尚保留70%以上的活力,而自然酶仅剩余22%的活力,说明稳定性有所提高。     

多核苷酸合成的研究 ⅩⅣ.EcoRI接头片段脱氧八核苷七磷酸的合成

本文采用化学方法和化学与酶促相结合的方法分别合成了自身互补的EcoRI接头片段脱氧八核苷酸d-GpGpApApTpTpCpC。化学方法使用二酯法(4 4)的路线,各中间片段和最终产物用DEAE-葡聚糖凝胶A-25柱层析纯化。酶促合成是用化学合成的两个片段d-GGAA和d-TTCC,借RNA连接酶连接成脱氧八核苷酸。两种方法合成的八核苷酸都能被限制性内切酶EcoRI识别并水解得到预期的产物,同时双向指纹图谱分析证明合成的产物具有正确的核苷酸排列顺序。     

脑啡肽基因的合成——Ⅱ.d-GGAAACCA的合成

本文报道了脑啡肽基因下链26核苷酸中八核苷酸片段d-GGAAACCA(10～17)的合成。合成系采用改良的三酯法,先合成和,再用对氯苯基磷酰二氯在1,2,4-三氮唑存在下磷酰化得到和,然后由bzAobz开始,依次同和缩合得到。在所有的缩合反应中,缩合剂均采用2,4,6-三甲基苯磺酰硝基咪唑。所得的全保护八核苷酸用浓氨水和80%醋酸脱去保护基后再经DEAE-葡聚糖凝胶A-25(7M尿素)柱层析分离纯化并去盐后,即得到d-GGAAACCA。产物经5'-~(32)P标记后,同系层析均一,蛇毒磷酸二酯酶部分酶解后的电泳-同系层析双向图谱能够得到预期的核苷酸排列顺序。     

多核苷酸合成的研究——Ⅵ.酵母丙氨酸转移核糖核酸5′-半分子反密码区中CpUpCpC和CpUpUpI的合成

本文报道用化学方法合成了酵母丙氯酸转移核糖核酸5′-半分子中反密码区的CUCC和cuuI两个四核苷酸片段。CUUI的合成路线是由(HO)I~(Bz)(OBz)_2开始,先同_(MMT)U(OBz)-p缩合并脱去5′-MMT后得到_(HO)U(OBz)-p-I_(Bz)(OBz)_2,然后与_(Bz)C~(Bz)(OBz)-p-U(OBz)-p缩合或者与_(MMT)U(OBz)-p和_(Bz)C_(Bz)(OBz)-p依次缩合得到全保护的四核苷三磷酸,最后用NH_3-甲醇溶液脱去保护基并分离纯化得到CUUI。而用_(Bz)C~(Bz)(OBz)-p-U(OBz)-p同_(HO)C_(Bz)(OBz)-p-C_(Bz)(OBz)_2缩合然后脱去保护基并分离纯化则可得到CUCC。反应缩合剂均采用DCC。合成的CUCC和CUUI均能为牛胰核糖核酸酶完全水解得到预期的碱基组成比例。     

多核苷酸合成的研究——Ⅸ 在多核苷酸磷酸化酶(PNPase)的单一加成反应中引物和保护底物的特异性问题

在PNPase利用2′(3′)-o-α甲氧乙基保护的NDP作为底物的单一加成反应中,CpUpC+ppU~(Me),37℃,7小时,CpUpCpU~(Me)的产率在50%以上,而CpUpC+ppG~(Me)在同一反应条件下,CpUpCpG~(Me)的产率仅10%以下。若提高反应温度、pH和底物的浓度等,可增加CpUpCpG~(Me)的产率至50～70%。GpCpm′I+ppψ~(Me)在上述反应条件下,没有获得所希望的反应产物(GpCpm′Ipψ~(Me)),而UpCpC+ppψ~(Me)时,则有UpCpCpψ~(Me)的生成。GpCpm′I+ppψ时,有少量GpCpm′Ipψ合成。这些结果说明,在PNPase的单一加成反应中,存在着底物和引物的特异性问题,因而对不同的底物或引物的最适反应条件是有差别的。     

大腸杆菌多核苷酸磷酸化酶的研究 Ⅱ.核酸的結构与磷酸解作用

(1) 利用磷酸单酯酶切除商品酵母RNA末端磷酸,可以提高大腸杆菌多核苷酸磷酸化酶对其磷酸解速度达5—7倍之多,說明大分子核酸和寡核苷酸一样,3′-磷酸末端是妨碍磷酸解的重要因素。(2) 商品酵母RNA,經过脫氨后,磷酸解速度有所提高;說明RNA二級結构的破坏,有利于磷酸解反应的进行。(3) 磷酸解脫氨RNA时,要求較高濃度的Mg~(++)其最适濃度由5×10~(-3)M提高到8×10~(-2)M。(4) 3′-单核甘酸对RNA的磷酸解无影响。     

多核苷酸合成的研究 Ⅷ.用T_4RNA联结酶酶促合成 GpCpmIpΨpGpGp

本文报导了酵母丙氨酸转移核糖核酸3′-半分子反密码区中GpCpm~1IppGpGp的酶促合成。作者发现,当以~(32)pGpGp(2′,3′)为供体,GpCpm~1Ip为受体,用T_4RNA 联结酶在一般条件下联结时(37℃,2小时),产率只有10%左右;但在10℃条件下,供体与受体比为1:5时,可以得到50～60%的较高产率。将~(32)pGpGp(2′,3′)与GpCpm~1lp用T_4RNA 联结酶在pH8.3,10℃下反应48小时后,再经DEAE-葡聚糖凝胶A-25柱层析分离纯化,即可得到GpCpm~1Ip~(32)pGpGp(2′,3′)。产物经双向电泳层析图谱分析,抗单酯酶测定,毗邻分析,用牛胰核糖核酸酶水解然后5′端用~(32)p 标记,再经双向图谱和核苷酸组成比例等鉴定,证明产物的纯度和排列顺序符合预定要求。     

多核苷酸合成的研究 Ⅵ.酵母丙氨酸转移核糖核酸5′-半分子反密码区中CpUpCpC和CpUpUpI的合成

本文报道用化学方法合成了酵母丙氨酸转移核糖核酸5'-半分子中反密码区的CUCC和CUUI两个四核苷酸片段。CUUI的合成路线是由_(HO)I~(OBz)_2开始,先同_(MMT)U(OBz)-p缩合并脱去5'-MMT后得到_(HO)U(0Bz)-p-I~(Bz)(OBz)_2,然后与_(B(?))C~(Bz)(OBz)-p-U(OBz)一p缩合或者与_(MMT)U(OBz)-p和_(Bz)C~(Bz)(OBz)-p依次缩合得至4全保护的四核苷三磷酸,最后用NH_3-甲醇溶液脱去保护基并分离纯化得到CUUI。而用_(Bz)C~(Bz)(OBz)-p-U(0Bz)-p同_(HO)C~(Bz)(OBz)-p-C~(Bz)(OBz)_2缩合然后脱去保护基并分离纯化则可得到CUCC。反应缩合剂均采用DCC。合成的CUCC和CUUI均能为牛胰核糖核酸酶完全水解得到预期的碱基组成比例。