粉尘螨1类变应原Der f1 T细胞表位疫苗对哮喘小鼠特异性免疫治疗的实验研究

目的探讨粉尘螨1类变应原Der f1T细胞表位疫苗对哮喘小鼠特异性免疫治疗的效果。方法30只小鼠按每组10只随机分为三组,PBS组、哮喘组和免疫治疗组。哮喘组和免疫治疗组分别在第0、7、14天经小鼠腹腔注射100μL含100μg/mL Der f1的致敏液[含2%Al(OH)3的PBS液],PBS组以PBS液[含2%Al(OH)3]代替。哮喘组和免疫治疗组自第21天起,雾化吸入上述致敏液,PBS组雾化吸入上述PBS液,每天雾化30min,连续雾化7d。免疫治疗组在第25~27天雾化前30min,经腹腔注射100μg/mL的Der f1T细胞表位蛋白200μL,进行特异性免疫治疗,PBS组以PBS液代替。最后一次雾化吸入24h后处死小鼠,收集每组小鼠的支气管肺泡灌洗液(BALF)和血清并计数BALF中嗜酸性粒细胞,取肺组织制作肺组织病理切片,取脾脏分离脾细胞加入Der f1共培养制成脾细胞培养上清。ELISA检测BALF和脾细胞培养上清中IL-13和IFN-γ含量及血清中特异性IgE(sIgE)和IgG2a水平。结果肺组织病理切片镜检说明,免疫治疗组比哮喘组炎症明显好转,炎症细胞浸润减少。小鼠BALF中嗜酸性粒细胞数结果为免疫治疗组嗜酸性粒细胞数明显低于哮喘组(P0.01)。BALF中IL-13含量免疫治疗组明显低于哮喘组(P0.01),而IFN-γ含量与IL-13含量变化相反,免疫治疗组明显高于哮喘组(P0.01)。各组脾细胞培养上清中IL-13,免疫治疗组明显低于哮喘组(P0.01),而IFN-γ含量与IL-13含量变化相反,免疫治疗组明显高于哮喘组(P0.01)。血清中特异性IgE含量结果为免疫治疗组明显低于哮喘组(P0.01),IgG2a变化水平与IgE变化正好相反,免疫治疗组明显高于哮喘组(P0.01)。结论 Der f1T细胞表位疫苗能有效缓解哮喘小鼠的炎症反应并纠正Th1/Th2失衡。     

尘螨变应原Der f1全序列的原核表达及生物信息学分析

目的 构建尘螨变应原Der f1原核表达体系,并了解其分子特征.方法 提取粉尘螨总RNA,用RT-PCR合成Der f1编码基因,将其克隆至pMD19-T载体,亚克隆至表达载体pET-28a( ),转化至大肠杆菌并用IPTG诱导表达.用生物信息学软件对测序结果进行分析并预测其空间结构.结果 从粉尘螨总RNA中扩增获得Der f1 cDNA片段,成功构建了表达质粒pET-28a( )-Der f1,Western blotting显示原核表达获得成功.测序结果提交GenBank,登陆号为EU095368,该基因长966 bp,与参考序列同源性达99.9%,推测其编码氨基酸321个,属疏水蛋白,位于细胞外,信号肽位于1～18氨基酸处.同源性分析提示Der f1和Eur m1相似率为88%,而Der f1和Der p1的相似率为77%,分子进化树中粉尘螨和梅氏嗜霉螨聚成一簇.Der f1的二级结构由α-螺旋(109 aa,33.96%)、延伸链(55 aa,17.13%)、β-转角(18 aa,5.61%) 和随机卷曲(139 aa,43.30%)组成.结论 尘螨变应原Der f1原核表达获得成功,为进一步生产重组变应原奠定了基础.生物信息学分析表明粉尘螨和梅氏嗜霉螨的亲缘关系可能更近,而与屋尘螨关系稍远,此与现行的形态学分类系统并不符合.     

屋尘螨Ⅰ类变应原Der p1的体内定位

对过敏性疾病主要过敏原屋尘螨Dermatophagoides pteronyssinusⅠ类变应原（Der p1）进行了抗原定位研究。选用经表达和纯化的Der p1抗原蛋白,按常规方法免疫小鼠,分离血清获抗重组Der p1的抗体（Ⅰ抗）,用抗鼠IgG荧光抗体为Ⅱ抗,屋尘螨经石蜡切片,在荧光显微镜下对其特异性变应原的定位进行观察。HE染色显示屋尘螨消化系统占据大部分体腔。组织免疫荧光发现屋尘螨Ⅰ类变应原主要定位于螨的中肠组织及肠内容物,而螨的生殖系统、排泄系统等脏器以及几丁质甲壳均呈阴性反应。据此认为屋尘螨Ⅰ类变应原存在于螨的肠内容物和中肠组织中。     

特异性免疫治疗对屋尘螨致敏哮喘小鼠NKT细胞的影响

目的:研究特异性免疫治疗(SIT)对哮喘小鼠自然杀伤T(NKT)细胞的影响。方法:24只BALB/C小鼠随机分为对照组(A组)、哮喘模型组(B组)、哮喘免疫治疗(SIT)组(C组),各8只。通过屋尘螨提取液(HDM)诱导建立哮喘小鼠模型并进行SIT治疗。检测各组小鼠的气道反应性、支气管肺泡灌洗液(BAlF)细胞计数及分类、ELISA检测IL-4、IFN-γ以及应用流式细胞仪检测NKT细胞数目,通过RT-PCR方法检测T-bet和GATA-3mRNA表达水平;HE染色观察小鼠肺组织的改变。结果:与B组相比,C组气道反应性明显下降(P0.01);BALF中细胞总数及嗜酸性粒细胞(EOS)数显著减少(P0.01);血清IL-4分泌显著降低(P0.01),IFN-γ显著升高(P0.01);NKT细胞数及其成熟型比例明显升高(P0.05);T-betmRNA表达水平明显升高(P0.01),且与NKT细胞数及其成熟型比例呈正相关性,GATA-3mRNA表达水平明显降低(P0.05),且与NKT细胞数及其成熟型比例呈负相关性。B组肺部管腔周围炎性细胞聚集,组织上皮损伤,组织水肿,而C组肺部变应性炎症明显减轻。C组其他各项指标接近A组。结论:哮喘的发生可能与NKT细胞失调相关,通过改变NKT细胞数目及其成熟型比例来调节GATA-3/T-bet的表达可能是SIT治疗哮喘的作用机制之一。     

尘螨变应原Der f 1核酸序列测定及其分子进化分析

目的：对尘螨主要变应原Der f 1进行核酸序列测定,探讨其系统进化信息。方法：根据Genbank公布的Der f 1基因序列设计引物,巢式PCR扩增Der f 1的cDNA,纯化、回收、克隆至pMD19-T simple后进行序列测定,序列比对后用Clustal W1.83构建分子进化树。结果：成功扩增出Der f 1的cDNA片段,测序表明该基因含ORF1个,长度966bp,与参考序列同源性达99．9％。该变应原具半胱氨酸蛋白酶活性,与果蝇进化关系最远,与梅氏嗜霉螨进化关系最近。结论：成功获得了尘螨变应原Der f 1基因片段．根据其编码的氨基酸序列构建出的系统进化树与形态学分类不一致。     

尘螨变应原Derf1核酸序列测定及其分子进化分析

目的:对尘螨主要变应原Der f1进行核酸序列测定,探讨其系统进化信息。方法:根据Genbank公布的Der f1基因序列设计引物,巢式PCR扩增Der f1的cDNA,纯化、回收、克隆至pMD19-T simple后进行序列测定,序列比对后用Clustal W 1.83构建分子进化树。结果:成功扩增出Der f1的cDNA片段,测序表明该基因含ORF1个,长度966bp,与参考序列同源性达99.9%。该变应原具半胱氨酸蛋白酶活性,与果蝇进化关系最远,与梅氏嗜霉螨进化关系最近。结论:成功获得了尘螨变应原Der f1基因片段,根据其编码的氨基酸序列构建出的系统进化树与形态学分类不一致。     

小青龙汤对小鼠支气管哮喘模型气道炎症及细胞因子的影响

目的:探讨中药方剂小青龙汤对小鼠哮喘模型气道炎症及细胞因子的影响。方法:40只BALB/c小鼠随机分为正常对照组(A组)、哮喘模型组(B组)、小青龙汤低剂量组(C组)和小青龙汤高剂量组(D组)。B、C、D组采用卵蛋白(OVA)腹腔注射致敏与雾化吸入激发制作哮喘模型。于OVA激发结束后24h收集支气管肺泡灌洗液(BALF)计数炎性细胞总数及嗜酸性粒细胞(EOS)数目,并测定BALF上清液中白细胞介素-4(IL-4)和干扰素-γ(IFN-γ)水平变化。结果:小青龙汤的干预治疗能显著降低小鼠BALF中炎性细胞总数及EOS数量;BALF上清液中IFN-γ水平明显升高,IL-4水平显著下降。D、C组与A组、B组有显著性差异(P<0.05),C组与D组结果亦存在显著性差异(P<0.05)。结论:小青龙汤能明显降低哮喘小鼠BALF中炎性细胞数量,影响细胞因子水平变化,从而改善哮喘气道炎症。     

尘螨变应原Der fl全序列的原核表达及生物信息学分析

目的 构建尘螨变应原Der fl原核表达体系,并了解其分子特征。方法 提取粉尘螨总RNA,用RT—PCR合成Der fl编码基因,将其克隆至pMD19-T载体,亚克隆至表达载体pET-28a（＋）,转化至大肠杆菌并刚IPTG诱导表达。用生物信息学软件对测序结果进行分析并预测其空间结构。结果从粉尘螨总RNA中扩增获得Der fl cDNA片段,成功构建了表达质粒pET-28a（＋）-Der fl,Western blotting显示原核表达获得成功。测序结果提交GenBank,臀陆号为EU095368,该基因长966bp,与参考序列同源性达99．9％,推测其编码氩基酸321个,属疏水蛋白,位于细胞外,信号肽位于1～18氨基酸处。同源性分析提示Der fl和Eur ml相似率为88％,而Der fl和Derpl的相似率为77％,分子进化树中粉尘螨和梅氏嗜霉螨聚成一簇。Derfl的二级结构由α-螺旋（109aa,33．96％）、延伸链（55aa,17．13％）、β-转角（18aa,5．61％）和随机卷曲（139aa,43．30％）组成：结论 尘螨变麻原Der fl原核表达获得成功,为进一步生产重组变麻原奠定了基础。生物信息学分析表明粉尘螨和梅氏嗜霉螨的亲缘关系可能更近,而与屋尘螨关系稍远,此与现行的形态学分类系统并不符合。     

粉尘螨1类变应原T细胞表位重组蛋白的构建及鉴定

目的构建Der f1的T细胞表位融合肽基因的原核表达载体并表达鉴定。方法利用基因工程方法构建Der f1的T细胞表位融合肽嵌合基因,命名为Der f1T,并插入到原核表达载体p ET28a(+)中,形成重组原核表达载体p ET28a(+)-Der f1T,进行双酶切和测序验证后的阳性克隆转化到E.coli BL21(DE3)诱导其表达。制样进行SDS-PAGE分析表达产物,再进行纯化,并Western bloting鉴定表达的蛋白。ELISA法测定重组蛋白对粉尘螨过敏的患者血清Ig E抗体的结合能力。结果双酶切和测序结果说明原核表达载体p ET28a(+)-Der f1T构建成功;SDS-PAGE说明Der f1T诱导且纯化成功;Western bloting进一步说明Der f1T蛋白纯化成功;ELISA试验结果说明Der f1T对粉尘螨过敏的患者血清中Ig E结合能力与Der f1相比明显下降(P0.05)。结论成功表达Der f1的T细胞表位重组蛋白,为后续粉尘螨过敏患者提供特异性免疫治疗奠定基础。     

尘螨变应原Derf1真核表达载体的构建及转染CHO细胞

目的：构建尘螨变应原Der f1真核表达载体,转染真核细胞并进行蛋白表达。方法：根据Genebank中Der f1基因的核酸序列（AB034946）,设计引物,采用PCR法,从保存的JM109工程菌中扩增Der f1编码基因,克隆到真核表达质粒pcDNA3.1/myc-his A上,以脂质体法转染CHO细胞,经G418筛选,进行稳定表达细胞株的筛选和鉴定。结果：将目的基因Der f1成功连接到pcDNA3.1/myc-hisA-Derf1并转染CHO细胞,获得稳定表达的CHO细胞株。结论：成功构建了尘螨变应原Der f1真核表达载体,并转染CHO细胞表达蛋白质。     

Investigation of the mechanism of temperature sensitivity of the electroreceptors of ampullae of lorenzini

In experiments on Black Sea skates (Raja clavata), the potential of the receptor epithelium of the ampullae of Lorenzini and spike activity of single nerve fibers connected to them were investigated during electrical and temperature stimulation. Usually the potential within the canal was between 0 and –2 mV, and the input resistance of the ampulla 250–400 k. Heating of the region of the receptor epithelium was accompanied by a negative wave of potential, an increase in input resistance, and inhibition of spike activity. With worsening of the animal's condition the transepithelial potential became positive (up to +10 mV) but the input resistance of the ampulla during stimulation with a positive current was nonlinear in some cases: a regenerative spike of positive polarity appeared in the channel. During heating, the spike response was sometimes reversed in sign. It is suggested that fluctuations of the transepithelial potential and spike responses to temperature stimulation reflect changes in the potential difference on the basal membrane of the receptor cells, which is described by a relationship of the Nernst's or Goldman's equation type.I. P. Pavlov Institute of Physiology, Academy of Sciences of the USSR, Leningrad. I. M. Sechenov, Institute of Evolutionary Physiology and Biochemistry, Academy of Sciences of the USSR, Leningrad. Pacific Institute of Oceanology, Far Eastern Scientific Center, Academy of Sciences of the USSR, Vladivostok. Translated from Neirofiziologiya, Vol. 12, No. 1, pp. 67–74, January–February, 1980.     

Principles of organization and evolution of systems of regulation of functions

Evolution of living organisms is closely connected with evolution of structure of the system of regulations and its mechanisms. The functional ground of regulations is chemical signalization. As early as in unicellular organisms there is a set of signal mechanisms providing their life activity and orientation in space and time. Subsequent evolution of ways of chemical signalization followed the way of development of delivery pathways of chemical signal and development of mechanisms of its regulation. The mechanism of chemical regulation of the signal interaction is discussed by the example of the specialized system of transduction of signal from neuron to neuron, of effect of hormone on the epithelial cell and modulation of this effect. These mechanisms are considered as the most important ways of the fine and precise adaptation of chemical signalization underlying functioning of physiological systems and organs of the living organism