苏云金芽胞杆菌rocE基因的转录调控

【目的】rocE基因编码精氨酸降解途径中的精氨酸通透酶,通过分析苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt) rocE基因的转录活性,明确rocE基因的转录调控机制。【方法】通过RT-PCR确定rocE基因所在基因簇的转录单元;β-半乳糖苷酶活性测定分析rocE基因启动子(ProcE)的转录活性;采用同源重组技术敲除BtHD73菌株的rocE基因;通过融合His标签的方法在大肠杆菌中表达纯化RocR蛋白的HTH结构域;通过凝胶阻滞实验明确RocR与rocE基因启动子的结合作用。【结果】在M9培养基中,精氨酸可诱导ProcE的转录活性;在SSM培养基和精氨酸诱导培养基中,与出发菌株HD73相比,ProcE在sigL (编码Sigma54因子)突变体和rocR突变体中的转录活性显著下降。RocR-HTH蛋白与ProcE有结合作用。rocE基因的缺失对菌体生长和Cry1Ac蛋白产量无显著影响。rocE缺失突变体的芽胞形成率为65.5%,HD73出发菌株为85.7%,显著性分析结果表明差异显著(P0.05)。【结论】rocE基因的转录活性受Sigma54的控制,并受RocR正调控。rocE基因的缺失影响菌株的芽胞形成率。     

SigmaK和GerE对芽胞外壁基质结构基因exsB的转录调控

[目的]明确SigmaK和GerE对苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt)芽胞外壁(exosporium)基质结构基因exsB的转录调控.[方法]序列比较蜡样芽胞杆菌群exsB及启动区序列,利用启动子融合lacZ技术检测exsB启动子的转录活性;通过凝胶阻滞方法检测GerE与exsB启动子的结合.[结果]在蜡样芽胞杆菌群中,exsB及其启动区具有较高的相似性,exsB启动子在芽胞形成期的晚期大量转录;sigK和gerE的突变影响了exsB启动子的转录活性,凝胶阻滞结果显示GerE蛋白与exsB启动子可以结合.[结论]本研究证明exsB在芽胞形成晚期受到SigmaK转录调控,并直接受到GerE的正调控.     

苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白Cry1Ba结构域Ⅱ中Loops结构与功能关系研究

为了明确杀虫晶体蛋白中各个Loop的结构与功能的关系,以及Loop突变对Cry1Ba蛋白杀虫活性的影响,首先通过三维结构模拟以及同源序列分析的方法,找到Cry1Ba蛋白三个结构域及三个Loop相对应的氨基酸片段:然后通过重叠引物PCR将编码Cry1Ba蛋白结构域Ⅱ中的三个Loop进行了相应的突变,共获得了5个突变体M1(Loop1:340WSNTR344-缺失(Cry1A))、M2(Loop2:402Y-G)、M3(Loop2:400GIYLEP405-PSAV(Cry3A)),M4(400GIYLEPIH407-ILGS(Cry1A)),M5(Loop3:472LQSRV476-AGAVYTL(Cry1A)).将这些突变体在大肠杆菌BL21中进行了诱导表达,提取蛋白,分别对小菜蛾进行了生物活性测定.生测结果表明,Loop1的缺失突变M1的毒力,与Cry1Ba(LC50 0.96μg/mL)相比,显著降低,LC50为35.51 μg/mL;在Loop2的突变中,单个氨基酸的突变M2(Y/G)的毒力略有下降(LC50为1.31 μg/mL);而另两种突变(M3和M4)时小菜蛾的毒力明显下降,LC50值分别为11.56 μg/mL、34.81 μg/mL;Loop3的突变M5对小菜蛾的毒力略有提高(LC50 0.81 μg/mL),但差异不显著.对Cry1Ba蛋白突变前后结构与功能之间关系的分析结果表明,Loop区突变对Cry1Ba蛋白的结构和功能影响非常显著;Loop1和Loop2在决定Cry1Ba对小菜蛾的毒性方面起着重要作用.     

苏云金芽胞杆菌转录调控因子CodY的体外靶基因的筛选

【目的】利用Avi-tag和Pulldown技术建立体外靶基因筛选的新方法,在苏云金芽胞杆菌YBT-1520基因组范围内进行体外高通量筛选转录调控因子CodY的靶基因,为深入研究CodY在苏云金芽胞杆菌中的功能及调控网络打下基础。【方法】用Avi-tag技术对CodY蛋白进行体外生物素标记,酶切苏云金芽胞杆菌YBT-1520总DNA并在两端加上便于测序的adapter序列,用链霉亲和素树脂筛选与CodY蛋白相互作用的靶基因。【结果】在苏云金芽胞杆菌中得到了46条CodY可以直接作用的靶序列,分析发现CodY在苏云金芽胞杆菌中主要调控氨基酸代谢、糖代谢、脂肪酸代谢、转运、调控、DNA修复、双组份调控等的转录。【结论】本研究采用的Avi-tag技术具有特异性强、操作简单、成本低等优势,为转录因子体外靶序列的高通量筛选提供新的方法;苏云金芽胞杆菌中CodY靶基因的筛选为其他微生物中CodY的功能研究打下基础。     

苏云金芽胞杆菌Sigma54和CcpA共同调控的基因鉴定

【目的】通过综合分析苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)HD73菌株Sigma54缺失突变体的转录组数据和蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)ATCC 14579菌株CcpA缺失突变体的转录组数据,并进行启动子与CcpA蛋白的体外结合验证,明确Bt HD73菌株中Sigma54和CcpA共同调控的基因,丰富了对微生物的代谢调控网络的认识。【方法】以转录组测序结果为基础,通过基因同源性的比对在Bt HD73菌株中寻找受Sigma54和CcpA共同调控的基因,在这些基因中找到具有cre序列的启动子,通过凝胶阻滞验证这些启动子与CcpA蛋白的结合。【结果】Bt HD73菌株中有31个基因受Sigma54和CcpA共同调控,其中14个基因的启动子序列包含cre序列,这些启动子都可以与CcpA蛋白发生体外结合。【结论】Bt HD73菌株中有14个基因直接受CcpA的调控,同时其转录受Sigma54的控制。     

苏云金芽胞杆菌dxr1基因的转录受SigH控制

【目的】萜类化合物广泛分布在生物界,是重要的生命物质。目前发现有两条萜类化合物的生物合成途径,即甲羟戊酸(MVA)途径和2-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸(MEP)途径。MEP代谢途径中的关键酶1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构化酶(DXR,EC1.1.1.267)催化1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸生成MEP。枯草芽胞杆菌中dxr基因编码DXR酶,而在苏云金芽胞杆菌(Bacillusthuringiensis,Bt)中有2个基因(dxr1和dxr2)编码DXR酶。通过分析BtHD73菌株的dxr1基因的转录活性和dxr1突变体表型,明确dxr1基因的转录调控机制和功能。【方法】通过5?RACE分析dxr1的转录起始位点;β-半乳糖苷酶活性测定分析dxr1基因启动子(Pdxr1)的转录活性;采用同源重组技术分别敲除BtHD73菌株的dxr1和dxr2基因;利用总蛋白定量确定Cry1Ac蛋白产量;利用DXR检测试剂盒检测Bt菌株的DXR活性。【结果】dxr1基因的转录起始位点位于起始密码子上游39 bp处的G碱基;与出发菌株HD73相比,Pdxr1在sig H突变体中的转录活性明显降低;dxr1或dxr2基因的缺失对菌体生长、芽胞形成率和Cry1Ac蛋白产量无显著影响,但使DXR活性下降。【结论】Bt中dxr1基因的转录受Sig H控制,dxr1基因的缺失影响DXR的活性。     

晶胞粘连苏云金芽胞杆菌C15杀线虫毒力因子发掘与功能鉴定

苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis,Bt）制剂作为一种高效的微生物杀虫剂,在植物病虫害防控领域有着广泛的应用。Bt制剂的主效成分为杀虫晶体和芽胞,其中,杀虫晶体的环境低持久性是Bt农药应用的重要限制因素之一。自然界中存在着一些Bt菌株,其产生的杀虫晶体位于芽胞外壁和芽胞衣之间,这种特殊的表型被称为晶胞粘连（spore-crystal association, SCA）表型。由于芽胞外壁对晶体的保护作用,SCA表型可以提升晶体抵抗不良环境因素的能力,是开发新型Bt生物囊杀虫剂的有效育种策略。本文选取对线虫具有强毒杀能力的 SCA菌株C15作为研究对象。获得了C15菌株的完整基因组序列,包括一个5 637 049 bp的环状染色体和8个不同大小的环形质粒（240 314 bp到3 188 bp）。C15基因编码了5个杀虫蛋白（Cry蛋白）基因：cry21-99、cry21-67、cry21-66、cry21-46和cry-N。在Bt无晶体突变株BMB171中异源表达cry21-99基因,发现其表达产物形成菱形晶体,且对秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）和南方根结线虫（Meloidogyne incognita）均有毒杀活性。同时,还在全基因组范围内预测了Cry毒素以外的杀线虫毒力因子和次生代谢产物。此外,在C15基因组中预测了本团队已报道的苏云金芽胞杆菌幕虫亚种（B. thuringiensis serovar finitimus）菌株YBT-020 SCA表型决定因子的同源基因,缺失后突变体仍然保留稳定的SCA表型,说明C15菌株的SCA表型形成机制与YBT-020不同,该菌株代表了一种新的SCA表型形成机制。本研究为转基因作物防控线虫提供了新的遗传资源,也为研究SCA表型形成机制,开发新型高效Bt制剂提供了新线索。     

苏云金芽胞杆菌肠毒素基因的PCR检测

采用多重引物PCR进行了 45株苏云金芽胞杆菌、2株蜡状芽胞杆菌和 2株球形芽胞杆菌溶血素BL ,肠毒素T和entS基因的检测 ,结果表明 95 6%苏云金芽胞杆菌含溶血素hblA基因 ,91 1 %含bceT基因 ,93 3%含entS基因。用两种商业化肠毒素检测试剂盒TECRA和RPLA进行所有菌株肠毒素的体外免疫测定 ,大部分苏云金芽胞杆菌和阳性蜡状芽胞杆菌都能产生不同水平的肠毒素活性 ,同hblA基因PCR检测结果基本相符。尽管DBT0 0 7和T2 4 0 0 1含有hblA基因 ,但用TECRA却检测不到肠毒素 ;Dmu39菌株不含肠毒素基因 ,但用TECRA却检测出高的肠毒素活性。苏云金芽胞杆菌BDT2 4 8和球性芽孢杆菌不含肠毒素基因和肠毒素。结果表明昆虫病原菌苏云金芽胞杆菌的安全性有待进一步研究     

Bt群体信号应答因子nprR基因的缺失对cry1Ac基因表达的影响

摘要：【目的】研究群体信号应答蛋白编码基因nprR在苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis,Bt）HD-73菌株晶体蛋白形成过程中的作用。【方法】通过同源重组,构建了HD-73 nprR基因缺失突变菌株HD73（ΔnprR ）。利用启动子-lacZ融合、SDS-PAGE方法,测定不同培养基中nprR基因转录活性及nprR基因缺失对cry1Ac转录及表达的影响。【结果】启动子转录活性分析表明,在LB和SSM培养基中nprR基因从对数期结束（T0）开始表达,稳定期持续表达。在LB培养基中,nprR基因的缺失使cry1Ac基因在生长过渡期和稳定期前期转录活性显著提高,同时HD73（ΔnprR ）菌株Cry蛋白生成量也明显高于出发菌株HD-73,但是在芽胞形成释放后,Cry蛋白的表达没有明显的区别。【结论】在丰富培养基中苏云金芽胞杆菌nprR基因的缺失在生长过渡期和稳定期前期能够提高cry1Ac基因转录和表达,从而缩短了cry基因表达时间,并且Cry蛋白总产量与出发菌株相当。     

香菇HMG-box转录因子lelcrp1基因的功能

【目的】研究香菇(Lentinula edodes) HMG-box转录因子LELCRP1 (Lentinula edodes lignocellulase genes regulation protein 1)在木质纤维素降解相关酶基因表达中的功能与作用。【方法】通过double-joint及同源重组方法构建lelcrp1基因RNAi载体,采用根癌农杆菌介导转化的方法转入香菇异核菌株W1菌丝中,筛选得到RNAi转化子,通过Southern杂交检测插入片段在菌株W1基因组中的拷贝数量。采用荧光定量PCR检测RNAi转化子木质纤维素降解酶基因表达水平变化,并在含有3.5μg/mL潮霉素的MYG平板上测定RNAi转化子的菌丝生长速度。【结果】获得了4个lelcrp1基因表达水平与出发菌株W1相比显著下调6–7倍的RNAi转化子。Southern杂交结果显示,lelcrp1基因RNAi片段已成功整合至香菇菌株W1基因组内,并以单拷贝形式存在。对其中2个RNAi转化子的26个木质纤维素降解酶基因表达水平进行分析,发现其中9个纤维素酶基因、1个半纤维素酶基因、2个辅助酶AA9基因和1个锰过氧化物酶基因的表达水平均表现出明显的下调。平板生长试验表明,RNAi转化子菌丝生长速度均显著慢于出发菌株W1。【结论】通过RNAi技术成功抑制了香菇异核菌株中lelcrp1基因表达水平,并导致部分纤维素及木质素酶基因表达水平相应下调,首次发现HMG-box结构域的转录因子能调控木质纤维素降解相关酶基因表达。     

Cloning and characterization of a novel human TEKTIN1 gene

Tektins comprise a family of filament-forming proteins that are known to be coassembled with tubulins to form ciliary and flagellar microtubules. A new member of the tektin gene family was cloned from the human fetal brain cDNA library. We hence named it the human TEKTIN1 gene. TEKTIN1 cDNA consists of 1375 bp and has a putative open reading frame encoding 418 amino acids. The predicted protein is 48.3 kDa in size, and its amino acid sequence is 82% identical to that of the mouse, rat, and dog. One conserved peptide RPNVELCRD was observed at position number 323–331 of the amino acid sequence, which is a prominent feature of tektins and is likely to represent a functionally important protein domain. TEKTIN1 gene was mapped to the human chromosome 17 by BLAST search, and at least eight exons were found. Northern blot analysis indicated that TEKTIN1 was predominantly expressed in testis. By in-situ hybridization analysis, TEKTIN1 mRNA was localized to spermatocytes and round spermatids in the seminiferous tubules of the mouse testis, indicating that it may play a role in spermatogenesis.     

马铃薯甲虫结节性硬化复合物基因LdTSC1和LdTSC2基因的克隆及功能分析

【目的】通过RNAi技术明确马铃薯甲虫TOR上游的关键信号集成节点及类胰岛素信号通道下游基因结节性硬化复合物TSC1和TSC2的功能。旨在为探明马铃薯甲虫类胰岛素信号转导提供更多理论支持。【方法】在NCBI(美国国家生物技术信息中心)获取马铃薯甲虫LdTSC1/2序列,分别利用多重序列比对和系统发育分析确定该基因的完整性和系统发育关系;采用喂食幼虫dsRNA的方法,观察该基因的调低对马铃薯甲虫幼虫生长发育、糖脂代谢的影响。【结果】克隆得到马铃薯甲虫TSC1编码蛋白的氨基酸序列与鞘翅目白蜡窄吉丁直系同源蛋白的氨基酸序列的自展一致度为100%,聚为一支;TSC2编码蛋白的氨基酸序列与鞘翅目白蜡窄吉丁和赤拟谷盗的同源蛋白氨基酸序列的自展一致度为100%,聚为一支。通过分别喂食2龄幼虫LdTSC1/2的dsRNA能有效降低靶标基因的表达量,幼虫出现体重减轻,化蛹率和羽化率显著下降,葡萄糖的吸收转化效率降低,海藻糖含量升高和甘油三酯均减少。【结论】下调2龄幼虫LdTSC1/2的表达量,导致试虫出现抑制了糖脂代谢、脂肪体减少、体重减轻以及发育延迟;结果表明LdTSC1/2调控了马铃薯甲虫幼虫的糖脂代谢过程,显著影响幼虫化蛹和蜕皮过程。     

苏云金芽胞杆菌BkdR和CcpA对bkd基因簇的转录调控

【目的】通过分析苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)转录调控因子BkdR和多效调控因子CcpA对亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸代谢基因簇bkd的转录调控,明确bkd基因簇的转录调控机制。【方法】通过β-半乳糖苷酶活性测定分析bkd基因簇启动子的诱导转录活性,采用同源重组技术敲除Bt HD73菌株的ccpA基因,通过融合His标签的方法在大肠杆菌中表达纯化BkdR和CcpA蛋白,通过凝胶阻滞实验明确BkdR和CcpA蛋白与bkd基因簇启动子的结合作用。【结果】亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸可诱导bkd基因簇启动子Pptb的转录活性。Pptb的诱导活性在bkdR突变体中明显降低,而在ccpA突变体中明显上升。BkdR和CcpA蛋白与Pptb均有结合作用。【结论】bkd基因簇的转录活性受BkdR正调控,而受CcpA负调控。     

Genome Analysis inNeurospora crassa;Cloning of Four Lociarginine-1(arg-1),methionine-6(met-6),unknown-7(un-7), andribosome production-1(rip-1) and Associated Chromosome Walking

We have cloned fourNeurospora crassagenes by complementation analysis. Cloned genes include thearginine-1(arg-1),methionine-6(met-6),unknown-7(un-7), andribosome production-1(rip-1) loci. Chromosome walks were initiated in ordered cosmid libraries from the cloned loci. A total of about 700 kb of theNeurosporagenome is covered in these walks.     

AtBS14a and AtBS14b, two Bet1/Sft1-like SNAREs from Arabidopsis thaliana that complement mutations in the yeast SFT1 gene

SNAREs are membrane-associated proteins that play a central role in vesicle targeting and intra-cellular membrane fusion reactions in eukaryotic cells. Here we describe the identification of AtBS14a and AtBS14b, putative SNAREs from Arabidopsis thaliana that share 60% amino acid sequence identity. Both AtBS14a and BS14b are dosage suppressors of the temperature-sensitive growth defect in sft1-1 cells and over-expression of either AtBS14a or AtBS14b can support the growth of sft1Δ cells but not bet1Δ cells. These data together with structure–function and biochemical studies presented herein suggest that AtBS14a and AtBS14b share properties that are consistent with them being members of the Bet1/Sft1 SNARE protein family.     

Structure and expression of AtS1, an Arabidopsis thaliana gene homologous to the S-locus related genes of Brassica

Summary Genetic and molecular analysis of the self-incompatibility locus (S-locus) of the crucifer Brassica has led to the characterization of a multigene family involved in pollen-stigma interactions. While the crucifer Arabidopsis thaliana does not have a self-incompatibility system, S-related sequences were detected in this species by cross-hybridization with Brassica DNA probes. In this paper, we show that an A. thaliana S-related sequence, designated AtS1, is expressed specifically in flower buds. Sequence analysis suggests that AtS1 encodes a secreted glycoprotein that is most similar to the Brassica S-locus related protein SLR1. As has been proposed for SLR1, this gene may be involved in determining some fundamental aspect of pollen-stigma interactions during pollination. The molecular and genetic advantages of the Arabidopsis system will provide many avenues for testing this hypothesis.