大腹圆蛛主壶腹腺cDNA文库构建和丝蛋白基因筛选

首次通过反转录-置换法和使用pUC18质粒成功构建大腹圆蛛（Araneus ventricosus)主壶腹腺（major ampullate gland)cDNA基因文库,并以鸟枪法从中筛选出具有典型重复结构的大腹圆蛛主壶腹丝蛋白cDNA基因AvF1,大小为1744bp,编码区为1572bp,编码氨基酸524个,分子量为42489.55Da,典型的重复结构为（GGP）nGGX。与现有已知的蛛丝蛋白基因中三带金蛛（Argiope trifas-ciata)鞭毛样丝基因（AtfF)有最高的同源性69.3%。大腹圆蛛主壶腹腺cDNA文库的构建和蛛丝蛋白新基因的克隆,为提供大腹圆蛛蛛丝蛋白基因背景和进一步研究蛛丝蛋白奠定了基础。     

大腹园蛛主壶腹腺蛛丝蛋白末端结构域的克隆表达

牵引丝(dragline silk)由主壶腹腺蛛丝蛋白(major ampullate spidroin, MaSp)组成,是蜘蛛丝中强度最好的丝,同时具有极佳的生物相容性和可降解性,因此引起研究者的研究热潮。目前关于大腹园蛛MaSp结构和成丝机理方面的研究甚少,限制了其仿生应用。本文以大腹园蛛牵引丝的组成蛋白质之一MaSp1为研究对象,通过锚定PCR的方法首次获取了大腹园蛛MaSp1 NT的完整编码基因,并对其进行了克隆、表达、纯化,产量可达60 mg/L;同时对该MaSp1的CT进行表达纯化,产量可达80 mg/L。另外,通过CD色谱分析了MaSp1 NT和CT的二级结构,结果表明二者的二级结构均以α-螺旋为主。上述结果为大腹园蛛MaSp1的结构和成丝机理研究奠定了基础。     

大腹园蛛鞭毛样丝蛋白cDNA克隆

应用RT-PCR技术,从大腹圆蛛（Araneus ventricosus)壶腹腺中扩增出鞭毛样丝蛋白基因（flagelldid-form silk protein gene),经1.5%琼脂糖凝胶电泳分离,WizardPCR Preps DNA Purification System回收后,将其克隆在pGEM-T载体中,经限制性核酸内切酶鉴定和核苷酸序列分析证实,构建的重组擀粒pSF1中含有蜂蛛鞭毛样丝蛋白基因,且含有3个重复序列。     

不同体重肩斑银鳞蛛和大腹园蛛圆网的结构特征

对在自然条件下不同体重肩斑银鳞蛛Leucauge blanda和大腹园蛛Araneus ventricosus所织圆网的结构特征进行测量研究.结果表明:体重小于35.1 mg的肩斑银鳞蛛所织圆网的捕丝长度、捕食面面积、捕丝间距和半径丝根数均与个体体重呈显著正相关,而体重大于35.1 mg的个体中,这种关系并不显著,但其圆网的上、下部捕丝长度比与体重呈显著负相关,即圆网随个体的体重增加而表现出更强的不对称性;体重小于144.9 mg的大腹园蛛所织圆网的捕丝长度和捕食面面积均与个体体重呈显著正相关,体重小于103.8 mg的大腹园蛛所织圆网的半径丝根数与个体体重呈显著正相关,而大于这一体重分界值的个体中,这种关系同样不显著.大腹园蛛圆网的平均捕丝间距与体重未呈现出相关关系,体重大于85.4 mg的个体中,其网的上、下部捕丝长度比与体重呈显著负相关.两种蜘蛛圆网结构特征的变化及圆网结构特征与个体体重关系变化的不同体重分界值,可能反映了它们在不同生境下不同生长阶段的捕食投入与捕食策略.     

对虾养殖水环境宏基因组Fosmid文库的构建

采用包埋法提取大片段基因组DNA,通过低熔点琼脂糖酶法回收40 kb左右的DNA,经补平磷酸化、与pCC2FOS载体连接、体外包装和转染EP1300-T1R,构建对虾养殖水环境Fosmid文库.对文库进行鉴定,该文库平均插入片段大小约35 kb,共保存8 000个克隆,包括了大概8×108个微生物细胞.用几丁质酶筛选平板对文库进行初步筛选,筛选到4个阳性克隆子.本试验构建Fosmid文库,初步获取了对虾养殖生态系统的微生物遗传信息,对于从虾池原位环境鉴定并筛选具有潜在益生作用的功能微生物意义重大.     

武夷菌素产生菌Fosmid文库的构建及文库探针的获得

以不吸水链霉菌武夷变种CK-15为材料,提取基因组DNA,经Sau 3A Ⅰ部分酶切后回收35-40 kb之间的片段,连接到pCC1FOS载体上,经过包装转染涂布后构建得到了CK-15基因组的Fosmid文库,文库的滴度为8.8×105CFU/mL.随机挑取16个阳性克隆,经EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切电泳分析,样品插入片段平均长度大于35 kb,插入率为100%,符合构建文库的要求.根据多氧霉素、尼克霉素生物合成基因及大环内酯类聚酮合成酶基因(PKS)设计特异性引物,以基因组为模板进行PCR扩增,筛选特异性引物探针.结果用大环内酯类聚酮合成酶基因设计引物扩增出1 693 bp的片段经Blast比对其与大环内酯类抗生素生物合成基因相似性为95%以上.武夷菌素产生菌CK-15 Fosmid文库的构建及文库探针的获得,为武夷菌素生物合成基因的克隆奠定了基础.     

斯氏油脂酵母基因组Fosmid文库的构建及降解百草枯氮次级代谢相关基因的筛选

斯氏油脂酵母在以百草枯作为唯一氮源的培养基中能降解百草枯,但其机制尚不清楚。为分离鉴定斯氏油脂酵母中降解百草枯的相关基因,本研究通过构建斯氏油脂酵母的Fosmid文库,用百草枯作为筛选标记,成功筛选到7个百草枯抗性的大肠杆菌克隆。对阳性克隆插入片段进行了测序分析,并对真核基因进行注释。结果在插入片段中发现了nmrA基因及氮代谢相关基因,nmrA是真菌在限氮的条件下才激活的氮代谢相关基因,能调控激活下游的次级氮代谢基因家族,分解那些不常见的氮源。这提示斯氏油脂酵母可能也具有氮的次级代谢调控机制,在百草枯作为唯一氮源的环境下斯氏油脂酵母能激活次级氮代谢相关基因,分解代谢百草枯。     

虎纹捕鸟蛛毒腺cDNA文库的构建

从 2 5只虎纹捕鸟蛛 (Selenocosmia huwena)中得到约 0 .6g左右的毒腺 ,从中提取出5μg m RNA.以此 m RNA为模板 ,经反转录合成双链 c DNA.再经包装成 c DNA文库 .文库的滴度达到 3.2× 1 0 7pfu/m L     

荷斯坦奶牛瘤胃微生物元基因组Fosmid文库的构建与分析

采用包埋法提取荷斯坦奶牛瘤胃微生物大片段总DNA,纯化后脉冲场电泳回收大小为36～48 kb,与pcc2FOS vector连接,转染至大肠埃希菌EPI 300宿主细胞,构建瘤胃微生物Fosmid基因组文库.对文库进行鉴定,该文库平均插入片段大小约35 kb,共保存30 000个克隆,空载体率小于2%,库容达1 050 Mb.     

rRNA及MaSp1基因证据不支持圆网蛛类(蜘蛛目:妖面蛛总科+园蛛总科)的单系起源

圆网蛛类(妖面蛛总科 园蛛总科)是否为单系,圆网究竟经历一次进化还是多次进化,这是多年来有争论的、悬而未决的蛛形学难题之一。本文测定了包括妖面蛛总科、园蛛总科和非圆网蛛类等类群在内的9科10种蜘蛛线粒体12S rDNA、16S rDNA及核18S rDNA、28S rDNA等4个基因片段序列,并基于4个基因序列的整合数据,分别通过邻接(NJ)法、最大简约(MP)法、最大似然(ML)法和贝叶斯法(Bayesian)分析,对园蛛总科和妖面蛛总科蜘蛛之间的分子系统关系进行了探讨。系统发生结果表明:1)园蛛总科和妖面蛛总科蜘蛛不是姊妹群,从而支持这两个类群的圆网是平行演化而非同源演化的观点;2)筛器类蜘蛛并非单系发生而为多系发生。另外,依据编码大壶状腺丝蛋白-1(MaSp1)C末端非重复氨基酸序列区段的核酸序列重建的系统发生树也证实圆网蛛类并非单系发生。     

大腹园蛛(Araneus ventricosus)粗毒双向电泳及质谱分析

以大腹园蛛粗毒为材料,用固相pH梯度等电聚焦IPG(immobilized pH gradient)和SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis)获得蛋白质组双向电泳图谱,经Bio-Rad公司的PDQUEST软件进行图像分析,检测到500个左右的蛋白质点．对其图谱的部分蛋白质点酶解后使用Micromass公司的ESI-Q-TOF进行了鉴定．得到了质量较好的MS／MS数据．然后将其在MS-Fit中的genepeptide数据库和Mascot的Swissprot中进行搜索从而对蛋白质点进行鉴定．目前初步获得5个组分的鉴定结果．     

大腹园蛛丝腺及其细胞形态的初步观察

运用显微解剖和石蜡切片技术,我们首次对大腹园蛛Araneus ventricosus腹部的5种丝腺的形态进行了分离、拍照和切片观察.研究发现壶状腺腹腔较大,有多根纺管;梨状腺为多细胞腺体、成簇;集合腺有不规则的分支,纺管外附着小结节;葡萄状腺成簇.各类型丝腺腺体细胞明显可见,但未能明显见到不同丝腺腺体细胞的形态区别.同时也发现了几个存疑形态：壶状腺上附着的腺体、壶状腺下导管和壶状腺腺体细胞,它们可能与蜘蛛腺体的退化或发育等相关.     

Fosmid Library Construction and Initial Analysis of End Sequences in Female Half-smooth Tongue Sole (Cynoglossus semilaevis)

Half-smooth tongue sole (Cynoglossus semilaevis: Pleuronectiformes) is a commercially important cultured marine flatfish in China and forms an important fishery resource, but the research of its genome is underdeveloped. In this study, we constructed a female C. semilaevis fosmid library and analyzed the fosmid end sequences to provide a preliminary assessment of the genome. The library consists of 49,920 clones with an average insert size of about 39 kb, amounting to 3.23 genome equivalents. Fosmid stability assays indicate that female C. semilaevis DNA was stable during propagation in the fosmid system. Library screening with eight microsatellite markers yielded between two and five positive clones, and none of those tested was absent from the library. End-sequencing of both 5′ and 3′ ends of 1,152 individual clones generated 2,247 sequences after trimming, with an average sequence length of 855 bp. BLASTN searches of the nr and EST databases of GenBank and BLASTX searches of the nr database resulted in 259 (11.53%) and 287 (12.77%) significant hits (E < e ⁻⁵), respectively. Repetitive sequences analysis resulted in 5.23% of base pairs masked using both the Fugu and Danio databases, repetitive elements were composed of retroelements, DNA transposons, satellites, simple repeats, and low-complexity sequences. The fosmid library, in conjunction with the fosmid end sequences, will serve as a useful resource for large-scale genome sequencing, physical mapping, and positional cloning, and provide a better understanding of female C. semilaevis genome.     

Construction of Genomic Library for Leucaena Leacocephala and Isolation of a Gene Enco ding Seed Storage Protein

Leucaena leucocephala (Mimosaceae), a tropical plant, has been a very important forage for livestock in tropical area. The leaves and seeds contain proteins up to 30% and 33% of the dry weight respectively. We have been interested in studying these proteins and expression of genes encoding these proteins and constructed the genomic library. Total DNA from leaves of L. leucocephala was isolated and digested partially with Sau3A. Bacterophage lambda EMBL3 was used as a cloning vector. Recombinant molecules were packaged into viable phage particles in vitro and the yield of recombinant phages was 3.5×106 pfu. In order to understand the homology between genes encoding seed storage protein from L. leucocephala and soybean, the library was amplified and screened with a gene encoding the α'-subunit of the soybean 7S storage protein. Four positive clones were obtained and three of them were chosen for further analysis. Physical mapping and partial DNA sequence have revealed the homology between genes encoding storage proteins of L. leucocephala and soybean.     

用富集文库克隆人胰岛素基因组基因

通过构建可富集人胰岛素基因的λ噬菌体文库,克隆了人胰岛素基因组基因．首先从中国人血液白细胞中提取到人基因组ＤＮＡ,用ＥｃｏＲⅠ和ＢｇｌⅡ对基因组ＤＮＡ进行全酶切,经０．４％琼脂糖凝胶电泳,特异回收９．５ｋｂ左右的ＤＮＡ片段．将该片段与λＥＭＢＬ３／ＢａｍＨⅠ臂连接,构建成一个特殊的人基因组λ噬菌体文库（富集文库）,效价为２×１０４．同时采用ＰＣＲ方法及用引物Ⅰ：５′ＧＧＡＣＡＧＧＣＴＡＣＡＴＣＡＧＧＡＡＧＡＧＧ３′,引物Ⅱ：５′ＣＴＧＣＧＴＣＴＡＡＴＴＧＣＡＧＴＡＧＴＴＣ３′,从人基因组ＤＮＡ中扩增出一段含胰岛素基因的１．３６ｋｂＤＮＡ片段,做为放射性标记探针,对文库进行了噬菌斑原位杂交筛选,从１×１０４个噬菌斑中筛选到一个含人胰岛素基因组基因的阳性克隆,并进一步完成了亚克隆和该基因１７３２ｂｐＤＮＡ序列的测定．结果该基因的１７３２ｂｐＤＮＡ序列包括部分５′端和３′端与国外发表的人胰岛素α型等位基因的序列相同     

灰树花总DNA的制备及基因组文库的构建A

灰树花是一种珍贵的药用真菌,因为多糖含量较高,较难获得高质量的总DNA,本文提出了一种制备高质量灰树花总DNA及构建灰树花基因组文库的方法。该方法制备的灰树花总DNA,经Sau3AI酶切后,用于构建基因组文库,可得到2×105个转化子/50mg,平均插入片段为14kb。本研究为下一步克隆灰树花中的基因以及进行其他分子生物学研究奠定了基础。Abstract： Grifola frondosa, is a valuable medicinal fungus. High quality total genomic DNA is difficult to prepare due to its high polysaccharide content. A method for the preparation of Grifola frondosa total genomic DNA and construction of Grifola frondosa, genomic library is described. Genomic DNA prepared by this method is digested by Sau3A I restriction enzyme. Constructed genomic library give a titer of 2×105 transformants/50mg , with a average insert size of 14kb. This has paved way for the cloning of other Grifola frondosa genes and molecular biology studies.