基因组细菌人工染色体文库(BAC)的构建及应用

细菌人工染色体 (BAC)是一种承载DNA大片段的克隆载体系统 ,用于人、动物和植物基因组文库构建。BAC具有插入片断大、嵌合率低、遗传稳定性好、易于操作等优点。BAC文库的构建是基因组较大的真核生物基因组学研究的重要基础 ,可用于真核生物重要基因及全基因组物理作图、重要性状基因的图位克隆、基因结构及功能分析。本文主要综述了细菌人工染色体的构建与其鉴定 ,及其在物理图谱构建、图位克隆、转基因技术等研究上的应用。     

一种使用混合PCR筛选技术高效延伸水稻BAC—重叠群的方法

使用“克隆连克隆 (clonebyclone)”战略进行水稻基因组测序需要依赖于构建好的基因组物理图。工作着眼于水稻籼稻广陆矮 4号 (OryzasativaindicaGuangLuAi4)第四号染色体长臂上 5 6 .1～ 6 8cM的区域 ,采用PCR方法筛选BAC全库来延伸重叠群 ,构建物理图。通过参照特异遗传探针定位的BAC克隆 (seedBAC)末端序列设计了 14对引物 ,按特定规则分成 3组 ,分别以代表水稻BAC库 (共 2 2 36 8个BAC )的 2 33个BACpool为模板进行PCR反应 ,一共获得了 6 5个阳性BAC克隆 ,通过末端测序、酶切杂交等方法确定了其中 2 9个BAC克隆作为有效延伸的克隆 ,延伸了 8个重叠群。通过酶切杂交、末端测序等方法还获知阳性BAC的延伸方向、延伸长度以及与seedBAC之间的重叠长度。8个重叠群总的延伸长度达到5 10kb。与实验室原用于作物理图的其他方法如指纹图、点杂交等相比 ,该方法有高效率、高灵敏度、专一性好、可重复使用等优点。创新之处在于通过引物的合理分组和PCR实验条件的改进降低了假阳性和假阴性率     

细菌人工染色体的研究和应用

细菌人工染色体 (Bacterialartificialchromosome ,BAC)是第二代大片段DNA的克隆载体系统。因其嵌合率低 ,遗传稳定性好 ,重组DNA容易分离和制备 ,转化效率高等 ,弥补了YAC的不足 ,很快在基因组研究中处于中心地位。近年来 ,已有多种BAC载体被构建出来 ,这些BAC载体在复杂基因组大片段文库的构建 ,基因的图位克隆 ,基因组物理图谱的构建 ,基因和基因组测序 ,基因组织结构分析 ,染色体组织和进化 ,以及基因的遗传转化和调控研究中得到了广泛的应用。     

水稻基因组重叠群：1998年1月向全球公开重叠群的细节

1997年10月中国科学院国家基因研究中心发表了覆盖率约达92％的水稻基因组（4．3亿核苷酸,12条染色体）第一代BAC指纹物理图。物理图是由重叠群（contigs）构成的。本文极简要地叙述了重叠群的特点、重叠群在寻找基因和大规模基因组DNA测序中的应用、重叠群在染色体上的定位以及向全球公开重叠群的细节等问题。     

用于目标序列染色体定位的镜鲤BAC-FISH体系构建

为了构建用于镜鲤(Cyprinus carpio var. specularis)特定基因组序列染色体定位的实验体系, 在细菌人工染色体(Bacterial Artificial Chromosome, BAC)文库筛选池中对已知短序列基因组片段进行PCR扩增, 筛选出包含目标序列的BAC克隆, 提取BAC质粒进行缺刻平移标记制备探针, 开展荧光原位杂交(Fluorescence in situ hybridization, FISH)实验。通过对染色体片前处理、BAC质粒探针制备、C0t-1 DNA封闭基因组重复序列、预杂交、荧光染料选择、信号放大等一系列实验条件和方法的探索优化, 成功实现了目标序列在镜鲤有丝分裂中期染色体上的定位。定位对象既包括在染色体上有单一位点的序列, 如斑马鱼微卫星标记Z6884和Z4268, 也包括在染色体上有多个位点的重复序列, 如黄河鲤性别相关标记CCmf1。来自斑马鱼同一条染色体上的两个微卫星标记被分别定位于镜鲤不同染色体上, 为鲤鱼染色体数目加倍的进化假设提供了一项直接实验证据, 同时将现有遗传连锁图谱与染色体对应起来, 可作为染色体识别和细胞遗传学图谱构建的依据。黄河鲤性别相关重复序列被定位于不少于四条染色体上, 为性别决定相关基因的筛查提供了研究线索。这一BAC-FISH实验体系将成为鲤细胞遗传学图谱构建、基因组进化和比较基因组学研究中的重要研究工具。       

高粱基因组学研究的新进展

高粱是全球第五大禾谷类作物,在干旱、半干旱地区农业生产中占有极其重要的位置.高粱基因组相对较小(750Mbp),遗传多样性丰富,被认为是禾谷类作物比较基因组学研究的模式基因组之一.近年来,综合运用AFLP等分子标记、BAC文库、EST及cDNA作图和FISH技术,加速了高粱高分辨率基因组图谱的构建.高粱基因测序、基因功能鉴定和克隆,以及遗传转化,亦取得了长足的进展.高粱特有的多种适应逆境胁迫等优异基因资源的发掘及其在作物改良中的应用前景广阔.     

PCR筛选BAC文库和直接BAC末端测序方法的建立

建立了一种用PCR方法筛选富含高度重复序列的大麦BAC DNA 文库和直接对 BAC DNA进行末端测序的方法.用PCR技术进行大麦BAC DNA 文库(含816个平板,每个平板含384个克隆)的筛选分4步进行.在实验中,建立了两个水平的BAC DNA池(一级池和二级池).一个二级池由一个平板(含有384个克隆)的DNA 组成,一个一级池由连续10个稀释100倍的二级池的DNA混合而成(如1～10,11～20等),共82个一级池.BAC DNA 文库筛选的第一步是对82个一级池的筛选.得到阳性一级池后(如2号一级池),对其所含的10个二级池(从11～20)进行第二步筛选.得到阳性二级池后,培养相应的阳性平板的所有克隆(384个),从头开始(左上侧),每相邻的4个克隆为一组,在96孔板上(4 X 96=384) 进行第三轮PCR反应;之后对筛选结果为阳性的4个克隆分别进行菌落 PCR(第四轮)得到单一阳性克隆.根据BAC DNA Hind III 酶切指纹图谱,对同一引物筛选的BACs进行重叠群作图(Contig).对代表contig 的两端的BAC DNA直接进行末端测序并对测序结果Blast,以检测其在大麦中是否属于单拷贝序列.根据测序和Blast结果设计引物,用中国春附加系(附加大麦染色体)对来自BAC克隆的引物进行染色体定位并用分离群体进行遗传学作图,以确定是否可以用作下一步的染色体步行.     

细菌人工染色体文库的构建及应用

细菌人工染色体（BAC）是第二代大片段DNA的克隆载体系统,具有容量大、嵌合率低、遗传特性稳定、转化效率高、插入片段易回收、操作简便等优点,因而被广泛应用于基因组较大的真核生物基因组研究中,并发挥着前所未有的重要作用。本文综述了BAC的发展,利用此载体构建基因组文库的程序和鉴定方法,及其在物理图谱构建、图位克隆、基因组测序、转基因技术等研究中的应用。     

拟南芥细胞死亡突变体mod1突变座位的精细物理图谱构建

拟南芥细胞死亡突变体mod1突变位点位于第2染色体分子标记IGS1和mi421之间. 以这一区域YAC重叠群中的YAC克隆末端DNA片段CIC9A3R, CIC11C7L, CIC2G5R及RFLP分子标记克隆CDs3为探针筛选TAMU BAC文库, 获得31个阳性BAC克隆. 用BAC克隆的末端DNA片段杂交所有阳性BAC克隆, 确立了由T6P5, T7M23, T12A21, T8L6及T18A18等克隆组成的MOD1基因所在区域的BAC重叠群. 同时在这一区域发展出11个CAPS分子标记和12个STS序标, 为MOD1基因的图位克隆与鉴定分析及这一区域的全序列测定奠定了基础.     

重要花卉植物高密度遗传连锁图谱构建研究进展

遗传连锁图谱是以遗传标记间重组频率为基础的染色体或基因组内位点相对位置的线性排列图,高密度遗传图谱构建可实现物理图谱和遗传图谱的整合,对促进基因图位克隆具有重要作用。利用遗传图谱可有效地提高育种效率和改良品种。重要花卉植物高遗传图谱精密度尚无法满足精细定位研究的要求,百合、紫薇、郁金香、向日葵等重要花卉高密度遗传图谱构建研究较少,制约了花卉植物分子育种研究进程。概述了高密度遗传图谱构建流程及作图方法,综述了牡丹、梅花、月季、菊花、兰花、荷花、桂花等重要花卉植物遗传图谱构建研究进展,讨论了重要花卉植物高密度遗传图谱构建存在的主要问题,对今后重要花卉植物遗传图谱构建研究的发展方向及其在育种中的应用前景进行了展望,以期为花卉植物基因定位、辅助基因组组装、比较基因组学、基因克隆、分子标记辅助育种等提供参考。