多头绒泡菌核仁骨架的研究

从多头绒泡菌（Ｐｈｙｓａｒｕｍ　ｐｏｌｙｃｅｐｈａｌｕｍ　Ｓｃｈｗ）间期细胞核中分离出核仁,用ＤＮａｓｅ　Ｉ、０．２５ｍｏｌ／Ｌ（ＮＨ４）２ＳＯ４和２ｍｏｌ／ＬＮａＣｌ去除核仁ＤＮＡ和大部分蛋白质,得到核仁骨架。核仁骨架是直径１０３０ｎｍ的纤维组成的网络结构,含有约２０种多肽,其中包括与肌动蛋白电泳迁移率相当的４３ｋＤ左右的多肽。免疫荧光检测结果表明,核仁骨架能与肌动蛋白抗体结合而发出明亮的荧光。免疫斑点印迹结果进一步证实,核仁骨架的蛋白质成分中存在肌动蛋白。免疫电镜结果指出,代表肌动蛋白的金颗粒分布在整个核仁中。     

多头绒泡菌核仁及其骨架中原肌球蛋白的免疫细胞化学鉴定

分离多头绒泡菌(physarum polycephalum)细胞的核仁,先用Dnase I消化,去除核仁内的DNA;然后用025mol/L (NH4)2ＳＯ４和2mol/L NaCl相继抽提去掉大部分蛋白质,制备成核仁骨架。SDSPAGE分析结果表明,核仁骨架中含有约20种多肽,其中包括37kD左右与原肌球蛋白分子量相当的多肽。以兔抗原肌球蛋白抗体为一抗,FITC标记的羊抗兔IgG抗体为二抗的间接免疫荧光检测结果表明,核仁和核仁骨架样品都能发出明亮的荧光,而对照样品未见明亮的荧光。间接免疫斑点印迹检测结果进一步证明,在核仁骨架的蛋白质成分中存在原肌球蛋白。胶体金免疫电镜检测结果显示,标记原肌球蛋白抗体的标本上有较多的金颗粒,而对照组标本上只有极少的金颗粒。金颗粒在核仁中主要呈散在分布。     

肌动蛋白是多头绒泡菌细胞核骨架和染色体骨架的组成成分

自多头绒泡菌(Physarum polycephalum Schw.)的原质团中分离细胞核和染色体,分别经DNaseⅠ消化和2 mol/L NaCl抽提后制备成细胞核骨架和染色体骨架。以抗肌动蛋白的抗体作一抗、FITC标记的羊抗兔IgG抗体作二抗进行的间接免疫荧光实验结果显示,细胞核骨架和染色体骨架都分别与抗体呈阳性反应。间接免疫斑点印迹实验结果进一步证实,细胞核骨架和染色体骨架的蛋白质成分中存在与肌动蛋白抗体呈阳性显色反应的抗原。以抗肌动蛋白的抗体作一抗、金颗粒标记的蛋白A作二抗的间接免疫电镜实验结果表明,在实验组间期细胞核的核仁、集缩染色质和核基质以及中期染色体上都有很多金颗粒分布。上述结果证明,肌动蛋白是多头绒泡菌细胞核和染色体及其骨架的组成成分。     

多头绒泡菌细胞核周期的电镜研究

多头绒泡菌Ｐｈｙｓａｒｕｍ ｐｏｌｙｃｅｐｈａｌｕｍ Ｓｃｈｗ的营养生长 没有细胞壁的原生质团（合胞体）,内部众多的细胞核进行着同步的核内有丝分裂,本文电镜下研究了细胞核在有丝分裂周期中的结构变化。有丝分裂前期,染色质经松散改组和集缩形成染色体,核仁由中央移向边缘,并在近核膜处解体;中期核膜不消失,在核内形成纺锤体,核仁解体后的物质呈不规则状散在于核内;有丝分裂后核膜的破裂处重新愈合,染色体解集缩     

多头绒泡菌细胞核周期的电镜研究

多头绒泡菌PhysarumpolycophalumSchw的营养生长阶段为没有细胞壁的原生质团（合胞体）,内部众多的细胞核进行着同步的核内有丝分裂,本文电镜下研究了细胞核在有丝分裂周期中的结构变化。有丝分裂前期,染色质经松散改组和集缩形成染色体,核仁由中央移向边缘,并在近核膜处解体;中期核膜不消失,在核内形成纺锤体,核仁解体后的物质是不规则状散在于核内;有丝分裂后核膜的破裂处重新愈合,染色体解集缩成染色质,分散的核仁物质逐渐合并形成新的核仁。     

多头绒泡菌染色体构建过程的形态学研究

以同步核内有丝分裂的多头绒泡菌(Physarum polycephalum)原质团为材料,在有丝分裂周期中连续取材,按常规方法制备超薄切片,在电镜下研究了染色体形态构建的整个过程。有丝分裂前期,首先是G_2期凝集的染色质块逐渐解集缩成为松散状,染色质在松散的同时逐渐改组成直径为80～150nm的松散染色线结构。接着是在松散的染色线上形成一些电子密度高的集缩区,随着集缩区的增多和扩展,染色线缩短变粗,最后形成直径300～350nm的染色体。上述两个过程各需30min左右。与上述过程同时发生的是,核仁由中央位置逐渐移向边缘,前期50min左右时在近核膜处呈团块状解体。染色体形态构建的整个过程约需1h,可分为染色质的松散改组和集缩两个连续的步骤,25～30nm染色质纤维是这一过程中能分辨的最细的形态单位。     

多头绒泡菌中动蛋白的免疫化学鉴定

动蛋白(kinesin)是一种微管系统的运动蛋白(motor protein),它能通过水解ATP将化学能转化为机械能,推动微管产生运动.微管系统作为一种主要的细胞骨架存在于所有真核细胞中,它们对于维持细胞形态,细胞的分裂,染色体的运动及细胞内的物质运输起着重要作用.细胞质力蛋白(dynein)和动蛋白是公认的推动这类运动的运动蛋白.自从1985年Vole首次在鱿鱼大轴突(squidgiant axon)中发现动蛋白以来,人们先后在许多种动物细胞中发现有动蛋白存在,甚至在低等真核生物棘状变形虫,盘基网柄茵和高等植物烟草花粉管中发现有动蛋白的存在.研究结果表明,动蛋白参与了真核细胞中的许多重要生命活动,如细胞中的细胞器及囊泡的运动,染色体排裂和分离等运动.动蛋白很可能是普通存在于所有真核细胞中的一种运动蛋白.多头绒泡菌(Physarum poly-cephalum)属于粘菌纲(Myxomycetes)的一种低等真核生物,它表现出许多显著的细胞运动特征如原生质团迁移,细胞质的穿梭运动(shuttle streaming)等,是研究非肌细胞运动和收缩蛋白的经典材料.在多头绒泡菌胞质中也具有微管系统,它们构成其纺锤丝等,参与染色体的运动及其它胞质运动,但至今国内外尚无人证明其中有与微管作用的运动蛋白——动蛋白的存在,作者利用抗牛脑动蛋白的单克隆抗体,     

多头绒泡菌肌球蛋白的纯化及性质的研究

从多头绒泡菌中纯化了肌球蛋白，并对其亚基组成及ＡＴＰ酶性质进行了研究。该肌球蛋白是由一种重链（２２５ｋＤ）和两种轻链（２０ｋＤ，１７．５ｋＤ）组成的大分子，其亚基之比为ＨＣ：ＬＣ１：ＬＣ２＝２：４：２。兔肌Ｆ－肌动蛋白能较大激活粘菌肌球蛋白ＡＴＰ酶活性，Ｃａ＾２＋离子也能提高其活性，Ｍｇ＾２＋离子无明显影响，钒酸盐，碘乙酸，对氯汞苯甲酸对其ＡＴＰ酶活性有显著抑制作用。     

多头绒泡菌肌球蛋白的纯化及性质的研究

从多头绒泡菌中纯化了肌球蛋白,并对其亚基组成及ＡＴＰ酶性质进行了研究。该肌球蛋白是由一种重链（２２５ｋＤ）和两种轻链（２０ｋＤ,１７．５ｋＤ）组成的大分子,其亚基之比为ＨＣ：ＬＣ１：ＬＣ２＝２：４：２。兔肌Ｆ－肌动蛋白能较大激活粘菌肌球蛋白ＡＴＰ酶活性,Ｃａ~（２＋）离子也能提高其活性,Ｍｇ~（２＋）离子无明显影响。钒酸盐,碘乙酸,对氯汞苯甲酸对其ＡＴＰ酶活性有显著抑制作用。     

多头绒泡菌银染核仁周期的电镜研究

以同步化培养的多头绒泡菌（Physarum poldycephalum Schw.)原生质团为材料,应用整体银染技术,电镜下研究了核仁在细胞周期中的超微结构变化。结果变化：核仁成熟时比较大,位于细胞核中央,核仁内可区分出纤维中心、密集纤维成分和颗粒成分等。前期时,核仁向边缘移动,前期末在近核膜处解体,解体的核仁物质主要呈团块状散开。中期时,解体的核仁物质位于细胞核中央染色体区域的周围,染色体上没有特异的银染区域,染色体周边也看不到银染的“鞘”状结构,但在染色体中可见一些散在的银染大颗粒。末期时,核仁物质与染色体一起到达两极,在子细胞核中与正在解集缩的染色质共存一起,以后核仁物质逐渐汇合并与染色质分开。大约在有丝分裂结束120min后,在细胞核中形成一候 中央位置的大核仁,结果提示,低等真核生物的核仁结构和周期变化与高等真核生物的不完全相同。     

多头绒泡菌SC35类蛋白的免疫电镜研究

经抗SC35单克隆抗体标记后,在电子显微镜下观察到多头绒泡菌S、G2、前期、中期和后末期细胞核中存在大量金颗粒,说明多头绒泡菌细胞核含有SC35类蛋白。在G2期和前期时,SC35类蛋白主要分布在细胞核的核仁区域和非核仁区域的染色质间区域;中期和后-末期时,SC35类蛋白主要分布在细胞核内染色体间区域;说明染色质(体)间区域和核仁区域是富含SC35类蛋白的区域。对核仁的进一步观察指出,在核仁中金颗粒主要分布在DFC,FC中的金颗粒很少,说明在核仁中SC35类蛋白主要存在于DFC组分中。     

多头绒泡菌类p34cdc2蛋白的定位研究

目前关于动物和酵母细胞中p34cdc2的定位研究结果尚存在分歧,而关于该蛋白在植物细胞中的定位尚不清楚.以多头绒泡菌( Physarum polycephalum )S期、G2早期、G2中期、G2晚期、前期、中期和后末期的原质团和细胞核为材料进行免疫印迹,发现原质团和细胞核都含有一种分子量约34 kD的类p34cdc2蛋白,该蛋白在原质团和细胞核中的含量在整个细胞周期进程中基本保持稳定.以抗p34cdc2单克隆抗体为探针的免疫电镜结果显示,类p34cdc2蛋白既分布于细胞核也分布于细胞质中,在细胞核中主要与染色体和核仁结合.经抗p34cdc2单克隆抗体处理后,多头绒泡菌的有丝分裂启始迟滞约2 h.结果表明,多头绒泡菌类p34cdc2蛋白存在于细胞核和细胞质中,与细胞有丝分裂密切相关,其含量在细胞周期进程中基本保持稳定.     

多头绒泡菌有丝分裂后细胞核重建过程的形态学研究

以进行自然同步核内有丝分裂的多头绒泡菌(Physarum polycephalum)原生质团为材料,应用常规制片和整体银染后制片的电镜技术研究了有丝分裂后细胞核的形态构建过程。形成新核仁的前体物质在有丝分裂中期时散在染色体区域的周围,末期时与染色体组一起到达两极。子细胞核刚形成时核仁物质与染色质混合,以后核仁物质相互汇合并同染色质逐渐分开,最后形成一个大核仁。染色质在有丝分裂后期开始解集缩,到两极后在新形成的子核中进一步松解。染色质在充分松解后又开始集缩活动,形成一些集缩比较紧密的染色质小块。随着细胞核的进一步发育在核膜和核仁之间形成许多大小不等,形状不规则的染色质团块。     

多头绒泡菌类p34^cdc2蛋白的定位研究

目前关于动物和酵母细胞中p34cdc2 的定位研究结果尚存在分歧 ,而关于该蛋白在植物细胞中的定位尚不清楚。以多头绒泡菌 (Physarumpolycephalum)S期、G2早期、G2中期、G2晚期、前期、中期和后末期的原质团和细胞核为材料进行免疫印迹 ,发现原质团和细胞核都含有一种分子量约 34kD的类p34cdc2 蛋白 ,该蛋白在原质团和细胞核中的含量在整个细胞周期进程中基本保持稳定。以抗p34cdc2 单克隆抗体为探针的免疫电镜结果显示 ,类p34cdc2 蛋白既分布于细胞核也分布于细胞质中 ,在细胞核中主要与染色体和核仁结合。经抗p34cdc2 单克隆抗体处理后 ,多头绒泡菌的有丝分裂启始迟滞约 2h。结果表明 ,多头绒泡菌类p34cdc2 蛋白存在于细胞核和细胞质中 ,与细胞有丝分裂密切相关 ,其含量在细胞周期进程中基本保持稳定。     

多头绒泡菌有丝分裂后细胞核重建过程的形态学研究

以进行自然同步核内有丝分裂的多头绒孢菌（Ｐｈｙｓａｒｕｍｐｏｌｙｃｅｐｈａｌｍ）原生质团为材料,应用常规制片和整体银染后制片的电镜技术研究了有丝分裂后细胞核的形态构建过程,形成新核仁的前体物质在有丝分裂中期时莠在染色体区域的周围,末期时与染色体组一起到达两极,子细胞核刚形成时核仁物质与染色质混合,以后核仁物质相互汇合并同染色质逐渐分开,最后形成一个大核仁,染色质在有丝分裂后期开始解集缩,到两极后在     

多头绒泡菌微原质团瞬时表达系统的构建

真核生物多头绒泡菌的原质团是研究细胞周期的好材料。但尚无合适的表达体系可供选择。本研究用多头绒泡菌ardC actin基因启动子和终止子分别替换哺乳动物细胞表达质粒pDsRed1-N1的CMVIE和SV40 polyA片段,构建了多头绒泡菌红色荧光蛋白(RFP)表达质粒pXM1;用PardC-MCS-DsRed1-TardC替换pTB38表达盒PardC-hph-TardC,构建了多头绒泡菌RFP表达质粒pXM2。将多头绒泡菌转录延伸因子类似蛋白(PELF1)基因与质粒pXM2重组,构建了PELF1红色荧光融合蛋白(PELF1-RFP)表达质粒pXM2-pelf1。通过荧光显微镜和激光扫描共聚焦显微镜观察RFP表达发现,电转参数为4kV/cm(电场)、1A(电流)、70μs(电击时间)时,质粒pXM1和pXM2电转多头绒泡菌微原质团(≤500μm)后24～48h内,RFP荧光最显著;而PELF1-RFP则主要聚集在多头绒泡菌细胞核,说明本试验建立的表达系统可以用于研究特定蛋白在多头绒泡菌内的瞬时表达。     

多头绒泡菌间期细胞核中RNA的转录状况

利用BrUTP免疫标记技术,研究了多头绒泡菌（Physarum polycephalum Sclhw.）间期细胞核中RNA的转录状况。结果表明：在整修间期核仁中的rRNA都在活跃转录;核质中hnRNA的转录呈逐渐上升趋势,早S期转录水平很低,晚S期转录活性升高1倍,G2期转录达到最高水平;整修间期核质中RNA的转录水平增加了5－6倍。     

多头绒泡菌类cyclinB1蛋白在细胞周期中的变化

以自然同步化的多头绒泡菌（Physarum polycephalumL.)为材料,经抗cyclinB1抗体的免疫印迹和免疫电镜实验观察结果表明,多头绒泡菌中含有类cyclinB1蛋白,该蛋白的含量和细胞内位置在细胞周期进程中存在着动态变化。类cyclinB1蛋白在S期开始合成并在细胞质中积累,G2晚期开始进入细胞核,该蛋白在细胞质和细胞核中含量逐渐增加。有丝分裂中期时达最大值。后末期时骤然消失,在G2晚期到有丝分裂中期期间,类cyclinB1蛋白既是细胞核蛋白又是细胞质蛋白,细胞质是类cyclinB1蛋白的主要存在区域,细胞核中的类cyclinB1蛋白主要结合于染色体和核仁区域。     

类Cyclin A蛋白在多头绒泡菌细胞周期中的定位研究

采用免疫电镜技术对多头绒泡菌(Physarum polycephalum)是否含有类CyclinA蛋白以及该蛋白在有丝分裂周期各时相的定位进行了研究;并以抗CyclinA抗体封闭细胞内源类CyclinA蛋白的方法,探讨类CyclinA蛋白在多头绒泡菌细胞周期中的作用。免疫电镜结果表明,经抗CyclinA抗体标记的实验组细胞中的金颗粒密度明显高于对照组,说明多头绒泡菌细胞中含有类CyclinA蛋白。实验组样品中,细胞核的金颗粒密度很高,而细胞质的金颗粒密度与对照组的相仿,说明多头绒泡菌细胞中的类CyclinA蛋白是核蛋白。细胞核的金颗粒密度在S期最高,G2期的次之,早中期时明显降低,中期和中期以后与对照组的相近。这种金颗粒密度的变化反映了类CyclinA蛋白在细胞周期中的含量变化。以抗CyclinA抗体分别处理S期和G2期的多头绒泡菌细胞,处理后的细胞分别停滞在原来的时相,细胞核形态变得不规则,核内有空洞现象。处于有丝分裂前期的多头绒泡菌细胞经抗CyclinA抗体处理后,细胞核出现畸变。抗体处理结果说明类CyclinA蛋白是参与多头绒泡菌细胞周期多个转换过程调控的种重要蛋白,主要在S期／G2期和G2期／M期的转换以及走出有丝分裂期的进程中发挥作用。