噬菌体短肽库的构建及其随机短肽的多样性

噬菌体短肽库是将随机合成的寡核苷酸序列通过与单链噬菌体外壳蛋白基因融合,从而将随机短肽表达于噬菌体的表面。将体外随机化学合成的寡聚核苷酸序列重组到单价噬菌体表达载体,构建了噬菌体短肽库,证明其库容为２×１０￣７集落形成单位（ｃｆｕ）,重组率为９３％。同时将１１个随机克隆进行序列测定,证实其寡聚核苷酸序列和氨基酸的分布几乎是完全随机的,其多样性可以满足特异性短肽筛选的要求。     

噬菌体短肽库的构建及其随机短肽的多样性

噬菌体短肽库是将随机合成的寡核苷酸序列通过与单链噬菌体外壳蛋白基因融合,从而将随机短短肽表达于噬菌体的表面,将体外随机化学合成的寡聚核苷酸序列重组到单价噬菌体表达载体,构建了噬菌体短肽库,证明其库容为２×１０＾７集落形成单位,重组率为９３％。     

人U_1和U_2snRNA基因定位缺失和取代突变

 用寡聚核苷酸诱导的定位突变法,将人U_1和U_2snRNA基因的5'-端调控区域的一段能与SV_(40)T抗原相结合的DNA删去,造成缺失突变,改变这段DNA核苷酸的排列顺序,造成取代突变。突变株用原位杂交法筛选,由限制性内切酶电泳图谱分析和DNA顺序测定得到证实。突变率约为5％。     

人源化鼠抗人纤维蛋白单链抗体的体外分子进化

以人源化鼠抗人纤维蛋白单链抗体的5株CDR3突变体为基础,利用致错PCR和DNA重排方法对其进行了突变和重排,然后克隆重组装的突变单链抗体至载体pHB-1HSCFV而构建了库容为10^5的抗体库,利用噬菌体表面呈现技术对构建的人源化抗体突变库进行了富集,并利用单链抗体-碱性磷酸酶系统进行了阳性克隆的筛选和鉴定。随后以鉴定的5株阳性克隆为基础进行了第二轮的致错PCR、DNA重排、抗体库的构建和富集,并筛选到4株亲和力较亲本鼠抗体All更好的人源化抗体,该研究为研制低免疫原性的导向溶栓制奠定基础。     

应用寡聚核苷酸检测c-Ha-ras癌基因点突变

人工合成的寡聚核苷酸探针能够准确地检测出克隆的c-Ha-ras癌基因第12位密码子是否发生点突变。将多聚酶DNA链延伸反应(PCR)与寡聚核苷酸探针结合起来测定组织或细胞株中的单拷贝基因c-Ha-ras第12位密码子的点突变,获得满意的结果。此方法的建立,有助于肿瘤的早期诊断、分型等方面的研究。     

Gap-Repair方式建立一种基于pBR322-Red的新型重组工程系统

应用Gap—Repair新技术,以pBR322为载体,在λ噬菌体Red重组酶的作用下,通过同源重组直接从大肠杆菌DY330染色体上亚克隆了长度为6．7kb的包含Red重组酶基因的λ噬菌体左向操纵子基因序列。建立了一种能够随意在不同细菌宿主中转移的基于pBR322-Red的重组工程系统。为了验证pBR322-Red的生物功能,以大肠杆菌染色体上的galk基因为靶标,用Red介导的单链DNA重组技术敲入T→G单碱基突变,使galk基因内编码第145位氨基酸的密码子由TAT转变成TAG,产生了一个琥珀突变。确定了pBR322-Red系统的重组功能。     

人神经营养因子4基因的分子克隆及序列分析

以正常人血淋巴细胞染色体DNA为模板,PCR扩增出神经营养因子4(NT4)编码基因.将所得基因片段重组于噬菌体载体M13mp18RF,筛选得到含人NT4基因的克隆.采用Sanger单链末端终止法测出其全部的核苷酸序列,该序列与国外文献所报道的完全一致.     

多耐药临床分离株结核分支杆菌耐药基因rpsL 的克隆表达及功能的初步研究

制备多耐药临床分离株结核分支杆菌基因组DNA,PCR扩增其耐药基因rpsL基因和rrS基因,同时进行测序分析,结果显示该株多耐药临床分离株结核分支杆菌的rpsL基因的93、94bp处的碱基发生了突变,碱基C、C突变为T、T,使得相对应的编码氨基酸由脯氨酸(Pro)突变为亮氨酸(Leu);而rrS基因未发生核苷酸的插入、缺失或取代;进一步构建该株多耐药临床分离株结核分支杆菌耐药基因rpsL高效原核表达重组我体pGEX-λ T／rpsL,所构建的重组质粒pGEX-λ T／rpsL在大肠杆菌中高效表达了38kD的融合蛋白．结果提示,该株多耐药临床分离株结核分支杆菌对链霉素耐药仅仅是由于rpsL基因的个别碱基突变,是单基因型的,在国内外属首次研究发现．     

大肠杆菌nmpC基因与噬菌体lc基因的关系

基因lc首先于大肠杆菌(E．Roli)噬菌体PA2中发现,其产物为蛋白质2。PA2溶源菌的外膜上存在有蛋白质2。E．Coli K-12的突变株nmgC(P+)能够产生新的外膜蛋白质NmpC,与蛋白质2的结构和抗原性非常近似。通过用λ噬菌体分别与野生型的K一12株及一pC(P+)突变株的qsr 缺陷前噬菌体进行置换,获得两种新的带有缺陷前噬菌体qs,’区的重组噬菌体。电子显微镜异源双链分析显示,除了从野生型菌株中置换到的DNA多出一段1,300碱基对的插入序列外,这两段置换DNA完全相同。并且置换DNA的一部分与含有lc基因的那部分PA2 DNA相同,插入序列的位点在这段DNA之内。在置换DNA中,不含插入序列的重组噬菌体可使其溶原菌产生与NmpC及蛋白质2非常相似的外膜蛋白。在。‘。“‘一12的基因图上,基因nmpC定位于12分钟,qsr缺陷前噬菌体也在附近的位置。因此,可以肯定一埘pC基因位于缺陷前噬菌体之中,实际上就是噬菌体的k基因。在野生型的K一12株中,由于插入序列的存在,阻止了这个基因的表达。     

拼接信号序列单碱基变异提高马传染性贫血病毒mRNA拼接效率

分别以马传染性贫血(马传贫)驴强毒(D—A EIAV)RNA和马传贫驴白细胞弱毒疫苗(DLA EIAV)RNA为模板,利用RT—PCR的方法,克隆到马传贫强、弱毒株基因组外显子2及其下游的核苷酸序列。然后将报告基因CAT插入到EIAV内含子2env阅读框架中,构成CAT拼接报告系统。同时在强毒株重组表达质粒的基础上,将其外显子-3上游拼接受体位点的核苷酸序列CAG突变为弱毒株相应位置的核苷酸序列TAG,得到强毒单核苷酸突变株重组表达质粒。用构建的3个重组表达质粒DNA转染驴血白细胞,ELISA检测转染细胞CAT浓度。结果表明：EIAV强毒株重组表达质粒中CAT蛋白表达量最高,EIAV强毒株重组表达质粒次之,EIAV强毒突变株重组表达质粒最低。由于CAT基因被插入于各重组质粒中的EIAV内含子-2里,EIAV外显子-2、3之间的拼接可导致该基因的删除,因而其拼接效率低于EIAVmRNA外显子-2、3之间的拼接效率。实验数据表明,EIAV SA2拼接信号序列单碱基变异提高了SD2-SA2拼接效率;D—AEIAV SA2-SD2拼接效率比DLA EIAV相应位点拼接效率高。     

植酸酶基因中稀有密码子的改造提高其在毕赤酵母中的表达量

对来源于黑曲霉N2 5(AspergillusnigerChinaStrain)的植酸酶基因phyA进行PCR介导的定点突变 ,不改变其所编码氨基酸 ,选用毕赤酵母偏爱的密码子对该基因保守序列中第 81位和第 85位的Arg密码子进行同义突变 .构建了含正确突变的克隆载体pUC18 phyAm 和酵母表达载体pPIC9k phyAm,电击转化毕赤酵母 ,经MM、MD平板筛选和产物的酶活性测定 ,筛选出突变与未突变高酶活酵母转化子各 2株 .这 4株转化子的Southern印迹结果表明 ,phyA基因以单交换方式单拷贝整合到酵母染色体DNA中 .表达产物的SDS PAGE分析表明 ,重组酵母中的植酸酶能有效分泌和表达 ,蛋白质分子大小为 70 15kD .转化子酶活测定结果表明 ,经密码子优化的突变重组酵母酶活力明显高于未进行优化的重组酵母转化子 .经密码子优化的突变重组酵母株PP NPm 8于麦芽汁培养基中诱导 36h后酶活力可达 4 76 0 0U/ml,其活力比未优化重组酵母株PP NP 2 (2 36 6 7U/ml)提高了约 1倍 ,且重组转化子遗传稳定性良好 .     

DNA复制、修复与重组

在一些大肠杆菌株系中,RecET是一种噬菌体衍生出的简单而有效的重组系统,它能通过单链退火启动同源重组。一种称作RecE的5’-3’外切核酸酶可以对生成的DNA末端进行再切割,在切口处造成一个3’－单链末端,而重组酶RecT在此末端加载以单链DNA（ssDNA）互补链。     

急性弛缓性麻痹病例中Ⅱ型脊髓灰质炎疫苗病毒变异株基因特征分析

研究Ⅱ型脊髓灰质炎(脊灰)疫苗变异株的基因特征,为我国使用口服脊灰减毒活疫苗/脊灰灭活疫苗使用策略,维持无脊灰状态和全球最终消灭脊灰提供科学依据。根据型内鉴定的检测结果,从2000~2001年AFP病例分离到的Ⅱ型脊灰疫苗变异株中选取有聚集性的5株病毒进行全基因组序列测定(贵州省3株、山东省2株),并进行核苷酸、氨基酸同源性分析。贵州省3株病毒全基因组序列完全一致,但与SabinⅢ型病毒发生重组,重组区域在3A区(nt5343~5353);与疫苗株相比,Ⅱ型区域变异10个碱基,其中VP1区变异4个,与SabinⅡ型株核苷酸同源性为99·56%,氨基酸同源性99·34%;Ⅲ型区域变异9个碱基。山东省2株病毒全基因序列共享16个突变位点,没有发生重组,与SabinⅡ型株相比,VP1区分别变异7个和4个碱基,核苷酸同源性分别为99·22%和99·56%,氨基酸同源性分别为99·0%和99·67%。上述5株病毒在重要的减毒位点nt481、nt2909均发生突变。此研究中5株病毒分属于两个不同的传播链,但是共享nt481、nt2909、nt2992三个突变位点,这3个突变位点不在重组区域内,他们的共同作用可能是影响病毒传播力的重要因素,但目前尚无证据证明脊灰疫苗病毒型间重组会增加病毒的毒力及传播力。     

编码酵母丙氨酸tRNA两个半分子的DNA的克隆

用DNA合成仪合成寡聚脱氧核苷酸。用T4-DNA连接酶把这些寡聚脱氧核苷酸重组成双链DNA。这两个双链DNA的上游是T7-启动子,下游分别编码酵母丙氨酸tRNA的5′半分子(1-35位核苷酸)和3′半分子(35-76位核苷酸)。再把这两个双链DNA克隆到PUC 12质粒中。经点杂交筛选和DNA顺序测定证明克隆是成功的。     

抗CD5单链抗体基因克隆和表达

以分泌抗CD5单克隆抗体的杂交瘤细胞poly(A) mRNA为模板,通过RTPCR扩增出抗CD5单克隆抗体的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL) cDNA片段组装出抗CD5单链抗体(ScFv) cDNA片段。该ScFv片段被克隆到pCANTAB 5E载体上,以E.coli TG1为宿主,进行噬菌体表面呈现。通过Molt4细胞表面分子CD抗原,对噬菌体表面呈现的ScFv进行免疫亲和富集筛选。经细胞ELISA鉴定,得到4株高亲和力克隆。DNA序列分析得知,单链抗体全长732碱基,其中VH为339碱基,VL为300碱基。抗CD5 ScFv在E.coli HB2151中以可溶形式分泌表达,产物主要分布于周质之中,占周质中总蛋白的20%。     

基因突变的改进

据Amersham生命科学报导:使用他们的单试管Sculptor体外突变发生装置,已使在一天内进行高效突变成为可能。在Amersham已有的体外寡聚核苷酸引导诱变发生的基础上,Sculptor给出了三种主要的改进。 这些改进包括在开始扩散反应时,使用T7聚合酶。酶消化过程包括使用T5核酸外切酶把残留单链模板DNA链从由扩散反应中得到的双链DNA产品中除去,经改进的流线型操作过程使残留单链DNA量达到最小。     

用改进的寡核苷酸诱导突变法改造人胰岛素前体基因

我们用改进了的寡聚核苷酸诱导突变法,将两个单一限制性内切酶位点引入人胰岛素前体B链与C链连接处附近,及C链与A铁连接处附近。用含U模板法将B链第30个残基密码子ACC改成ACG,从而引入MluⅠ位点。用修改了的缺口双链DNA突变法,将A链第4个残基密码于GAG改成CTG,引入了一个PstⅠ位点。突变效率的为17％-36％。这个突变体在人胰岛素前体结构及蛋白质折叠的研究中,将有利于更换不同的C-肽。     

天然兔源噬菌体单链抗体库的构建与鉴定

目的:构建天然兔源噬菌体单链抗体库。方法:采用RT-PCR法从未免疫的兔子脾脏中克隆得到抗体重链可变区(VH)与轻链可变区(VL)基因,重叠PCR将VH和VL拼接成scFv片段,将scFv连接到噬菌粒pComb3XSS上,电转入XL1-Blue菌中,得到单链抗体库,并用此抗体库筛选抗肌酸激酶抗体。结果:构建了容量为4×108,基因重组率95%的单链抗体库,DNA指纹图谱显示抗体库多样性良好。以肌酸激酶为抗原,从该库中筛到3株抗肌酸激酶的抗体。结论:分析表明构建的天然兔源单链抗体库质量良好,可用于快速筛选、制备多种单链抗体。     

一株新分离的肠杆菌噬菌体的快速遗传鉴定及其宿主识别基因的快速克隆

以大肠杆菌8099为宿主自医院污水中分离出一株肠杆菌噬菌体IME08,其遗传物质经RNA酶、DNA酶处理证实其为DNA,用限制性内切酶处理该DNA证实其为双链DNA。利用随机引物PCR技术扩增并克隆该噬菌体基因组的随机片段,经测序后同源比对,判断该噬菌体是一株新的T4-like噬菌体。根据4株T4-like噬菌体 (T4,JS98,T2及K3) 宿主识别基因 (g37) 5'端的高度保守序列,采用随机PCR与巢式PCR结合的“基因组跳跃”策略快速克隆出了该噬菌体的宿主识别基因g37和g38。     

从噬菌体抗体库中淘选血纤维蛋白特异的单链抗体

为构建小鼠噬菌体抗体库 ,以获得对人血纤维蛋白特异的抗体 ,由小鼠脾脏提取 m RNA,经反转录 PCR扩增出抗体重链、轻链可变区基因片段 ,将二者和一段编码十五肽 (Gly4 Ser) 3的 DNA接头借助重组 PCR组装成为单链抗体 (single- chain antibody,Sc Ab)基因 .将单链抗体基因插入噬菌体展示载体 p CANTAB- 5E,通过电击法转化大肠杆菌 TG1细胞 ,用辅助噬菌体 M1 3K0 7超感染 ,构建了库容量在 1 0 8以上的噬菌体单链抗体库 .利用亲和选择方法 (淘选 ) ,从噬菌体抗体库中选得血纤维蛋白特异的单链抗体 .模拟抗体成熟过程 ,用 DNA改组 (DNA shuffling)技术使抗体基因重新组合 ,构建新的改组抗体库 ,并从中选择到提高了亲和力的噬菌体单链抗体 .抗体基因在大肠杆菌中表达 ,表达蛋白经 Sephadex G- 75柱层析分离 ,得到初步纯化的单链抗体蛋白 .