马IgM、IgG单克隆抗体的研制与鉴定

以马IgM、luG作为免疫抗原,以此免疫BALB/c小鼠,并取其脾细胞与骨髓瘤细胞(SP2.0)融合,通过酶联免疫吸附试验(ELISA)方法筛选,结果获得了4株分泌抗马IgM和2株分泌抗IgG的单克隆抗体的杂交瘤细胞,特异性试验证明,4株IgM单抗有很好的特异性,仅与马的IgM特异反应,而不与IgG反应;这4株单抗分别命名为IgM4H、IgM6B、IgM8A和IgM12F.经鉴定,IgM4H、IgM6B、IgM12F株为IgG1亚类,IgM8A株为IgG2a亚类,杂交瘤细胞的平均染色体数目为99条.杂交瘤细胞培养上清液及小鼠腹水McAb的ELISA都具有较高的效价,该杂交瘤细胞连续培养20代后仍能稳定分泌抗体.2株IgG的单克隆抗体有很好的特异性,只与IgG反应,而不与IgM发生交叉反应.     

1组曲霉单克隆抗体的制备与鉴定

目的制备并鉴定一组抗曲霉不同抗原的单克隆抗体。方法采用烟曲霉细胞壁抗原成分、分泌抗原和灭活分生孢子,分别免疫BALB／c小鼠,制备单克隆抗体,免疫荧光法鉴定单克隆抗体与曲霉属和念珠菌属抗原的交叉反应。结果获得29株稳定分泌抗曲霉单抗的杂交瘤细胞株,其中用烟曲霉细胞壁抗原成分免疫获得11株,用分泌抗原免疫获得13株,用孢子免疫获得5株;Ig亚类鉴定,11个克隆株为IgG1亚类,3个克隆株为IgG3,15个克隆株为IgM。免疫荧光法鉴定29株单抗特异性识别烟曲霉细胞壁抗原,与其他曲霉抗原有交叉反应。结论29株单克隆抗体,对于建立侵袭性曲霉感染早期诊断方法、筛选曲霉保护性抗体以及研究抗体保护机制奠定了实验基础。     

牛血清白蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立及鉴定

用牛血清白蛋白(BSA)免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行融合,培养上清经过双抗体夹心法检测初步筛选分泌鼠IgG的杂交瘤细胞,将此种杂交瘤细胞注射小鼠产生的腹水用间接ELISA法筛选,获得4株能稳定分泌抗BSA单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为2A5、3A3、3G6、4A8。鉴定结果显示,2A5细胞分泌IgG2a/κ,其余3株细胞分泌IgG1/κ;纯化后4株腹水单抗的纯度达90%以上,对BSA的ELISA滴度均可达到1∶100000以上;4株单抗均不与人以及马、猪、羊、兔、豚鼠等血清发生交叉反应;W estern B lotting试验证明4株单抗均识别分子量为68000的BSA;用间接ELISA法测定4株单抗相对亲和力及相对敏感度大小依次为3A3>2A5>3G6>4A8;杂交瘤细胞株连续培养3个月以及冻存半年后复苏,细胞生长良好,杂交瘤细胞分泌的抗体效价稳定。     

人脐带间充质干细胞食蟹猴连续静脉输注后免疫毒性与免疫调节作用研究

该文旨在研究人脐带间充质干细胞在食蟹猴体内的免疫毒性与免疫调节特性。连续14天给予食蟹猴不同剂量(2.0×10~6个·kg~(-1)和2.0×10~7个·kg~(-1))的人脐带间充质干细胞静脉滴注,检测食蟹猴血清IgG浓度、抗人脐带间充质干细胞抗体、淋巴细胞活化增殖和T细胞亚群的变化,以及胸腺和脾脏组织学变化。结果显示,连续14天静脉给予人脐带间充质干细胞对食蟹猴血清IgG浓度无影响,不刺激动物产生抗人脐带间充质干细胞抗体。人脐带间充质干细胞显著抑制食蟹猴淋巴细胞的活化增殖,降低CD3~(+)T细胞比例,刺激Treg细胞的增殖分化。组织学检查发现,部分动物出现与给药相关的胸腺皮质萎缩和脾脏淋巴生发中心增多增大。该研究得出,人脐带间充质干细胞的免疫毒性极低,静脉输注后不引起食蟹猴体内免疫排斥等异常反应,提示其在临床上异体应用的安全性。     

十七种哺乳动物二级抗体的制备和辣根过氧化物酶标记

目的制备兔抗17种哺乳动物的二级抗体,并进行辣根过氧化物酶标记,为哺乳血清学检测系统的建立提供工具。方法利用饱和硫酸铵沉淀法粗纯抗体后,再利用protein A或protein G亲和层析的方法进一步纯化哺乳动物的IgG,免疫大耳白兔制备抗血清,利用免疫双扩散来检测抗血清的效价,并用Protein A亲和层析的方法来纯化兔抗哺乳动物的二级抗体,采用简易过碘酸钠法对纯化的兔抗哺乳动物的二级抗体进行辣根过氧化物酶标记,通过ELISA方法测定标记抗体的效价,并利用Western blot方法考察标记抗体的特异性。结果纯化了恒河猴、东北虎、布氏田鼠、黑线姬鼠、斑羚、原驼、果子狸、食蟹猴、梅花鹿、长爪沙鼠、马鹿、骆驼、大仓鼠、豚鹿、熊猴、大耳羊和雪貂等17种哺乳动物的血清IgG,分别免疫大耳白兔制备了这17种哺乳动物的兔抗血清,免疫双扩散法测定兔抗这17种哺乳动物的抗血清效价均达到1∶32,并对纯化的兔抗恒河猴IgG、兔抗东北虎IgG、兔抗布氏田鼠IgG、兔抗黑线姬鼠IgG、兔抗斑羚IgG、兔抗原驼IgG、兔抗果子狸IgG、兔抗食蟹猴IgG、兔抗梅花鹿IgG、兔抗长爪沙鼠IgG、兔抗马鹿IgG、兔抗骆驼IgG、兔抗大仓鼠IgG、兔抗豚鹿IgG、兔抗熊猴IgG、兔抗大耳羊IgG和兔抗雪貂IgG等17种哺乳动物的二级抗体进行了辣根过氧化物酶标记,ELISA测定标记抗体的效价达到1∶（2000～60000）左右,Western blots显示标记抗体具有很好的特异性。结论成功制备了HRP标记的兔抗17种哺乳动物的二级抗体,为哺乳动物血清学检测体系的建立提供了工具。     

抗牛血清IgG单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立及鉴定

用牛血清IgG免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行融合,用含山羊血清的培养基培养细胞,上清用间接ELISA法筛选。获得4株能稳定分泌抗牛血清IgG的单克隆抗体杂交瘤细胞株,分别命名为1G5、2A8、3F5、4C5。其中2A8为IgG2a,其余3株为IgG1;腹水单抗的ELISA滴度均超过10-5;除3F5株单抗与山羊血清有交叉反应外,1G5、2A8、4C5株与人、马、猪、羊、兔、豚鼠等血清均不发生交叉反应;4株单抗与制备病毒性疫苗的基质液呈阴性反应;4株单抗识别分子量为160kD的牛血清IgG的两个不同抗原表位;4株单抗相对亲和力大小依次为4C5>2A8>1G5>3F5,相对敏感度依次为2A8>4C5>3F5>1G5;4株杂交瘤细胞株的染色体计数均大于90条,连续培养三个月以及冷冻保存半年后复苏,细胞生长良好。使用这些单抗建立的双抗体夹心法检测生物制品中的残留牛血清IgG。     

重组HIV-1 gp120 AAV2/1在小鼠和恒河猴体内的免疫原性

本文旨在研究表达HIV-1中国流行株gp120基因的重组腺相关病毒疫苗在小鼠和恒河猴体内的免疫原性。用rAAV2/1-gp120免疫BALB/c小鼠和恒河猴,分别用ELISA和HIV-1假病毒中和试验检测免疫动物血清中HIV-1特异性IgG抗体水平和中和抗体水平,用ELISPOT方法和体内杀伤实验检测HIV-1特异性细胞免疫应答水平。结果显示在小鼠体内用rAAV2/1-gp120仅免疫一次就能诱导较高水平的IgG抗体,IgG抗体至少能持续21周,但没有检测到中和抗体。rAAV2/1-gp120在小鼠体内诱导微弱水平的HIV-1特异性细胞免疫应答。rAAV2/1-gp120在恒河猴体内诱导的HIV-1特异性细胞和抗体反应均很弱,且检测不到中和抗体。提示rAAV2/1载体在诱导抗体反应方面具有特殊优势,但若希望诱导HIV-1特异性中和抗体,则需要改造env基因以提高其免疫原性。     

SIVp27单克隆抗体的制备和鉴定

[目的]建立SIVp27杂交瘤细胞株,并对其分泌的SIVp27单克隆抗体进行初步鉴定。[方法]使用基因重组的SIVp27蛋白免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术使用半固体培养基法建立杂交瘤细胞株,制备单克隆抗体。通过染色体核型对杂交瘤细胞株进行鉴定;采用Westernblot、免疫荧光法、酶联免疫吸附法确定单克隆抗体的交叉反应性、相对亲和力、抗原识别表位、免疫球蛋白的类型和亚类,对单克隆抗体进行鉴定。[结果]获得四株可稳定分泌SIVp27单克隆抗体的杂交瘤细胞,1C3、2B6为IgG1类,2E12为IgG2b类,3G3为IgG2a类。四株单抗均能识别SIV的p27蛋白,与逆转录病毒SRV、STLV无交叉反应,2B6、2E12与HIVp24有交叉反应。免疫荧光法检测腹水效价为1:10240~40960。1C3、2B6、2E12、3G3染色体平均数分别为103、97、96、101。2E12与3G3识别不同的抗原表位。[结论]成功地制备出四株SIVp27单克隆抗体,均具有良好的特异性和亲和力,为进一步建立免疫分析方法,进行SIV/SAIDS及其艾滋病相关研究,奠定了基础。     

人心肌肌钙蛋白Ⅰ单克隆抗体及多克隆抗体的制备

目的:以重组人心肌肌钙蛋白Ⅰ(cTnⅠ)为抗原制备鼠源单克隆抗体(McAb)及兔源多克隆抗体,并鉴定抗体的特性。方法:以纯化的重组人cTnⅠ为抗原免疫BALB/c小鼠,取鼠脾细胞同Sp2/0骨髓瘤细胞融合,利用选择培养基筛选融合的杂交瘤细胞,用有限稀释法分离获得能够稳定分泌抗cTnⅠ的McAb阳性克隆,并利用体内诱生法大规模制备McAb,用辛酸-硫酸铵沉淀法纯化抗体;兔多抗制备以cTnⅠ为抗原常规免疫后取其血清;用间接ELISA和Western印迹鉴定抗体的性质。结果:经ELISA鉴定,筛选出5株能分泌cTnⅠMcAb的杂交瘤细胞株,即C5B2、C5B3、C5B4、C5B1、B1A6,效价最高的B1A6株分泌的McAb为IgG3型,纯化后效价为1∶10000,亲和常数为1.08×10-9mol/L,Western印迹鉴定表明cTnⅠMcAb有良好的特异性;兔多抗纯化后的效价为1∶8000。结论:制备了具有良好特性的cTnⅠMcAb和多克隆抗体。     

抗嗜肺军团菌血清8型单克隆抗体的制备及双抗体夹心酶联免疫吸附试验检测法的建立

目的：制备针对嗜肺军团茵血清8型的单克隆抗体,并建立双抗体夹心酶联免疫吸附试验（ELISA）检测方法。方法：用甲醛灭活的嗜肺军团菌血清8型菌免疫BALB／c小鼠,采用杂交瘤技术制备抗嗜肺军团菌血清8型单克隆抗体,建立双抗夹心ELISA检测方法。结果：研制出8株能特异性分泌抗嗜肺军团菌血清8型单克隆抗体的杂交瘤细胞株,Ig类型分别为IgM（2株）、IgG,（1株）和IgG,（5株）;利用IgG1型单抗6G10与6C7配对,建立了双抗夹心ELISA检测方法,该方法的最低检出浓度为2．6×10^5cfu／mL,除与金黄色葡萄球菌有微弱的交叉反应外,与14株其他血清型嗜肺军团菌、17株非嗜肺军团菌及11株非军团菌均无交叉反应,具有较高的特异性。结论：制备了具有高特异性和亲和力的抗嗜肺军团菌血清8型单克隆抗体,并建立了双抗夹心EUSA检测方法。     

猕猴脱毛的营养学因素分析

目的通过对猕猴脱毛的相关营养学指标的比较分析,为改善人工饲养猕猴脱毛状况及其防治提供参考数据。方法根据被毛状况分组A、B、C,采集试验猴被毛和血清,测定其微量元素和氨基酸以及血清矿物元素,对各组相应指标进行比较分析。结果各组试验猴被毛Cu、Fe含量无显著性差异（P〉0.05）,但Mn、Zn、Pb、As则均有极显著性差异（P〈0.01）。被毛脯氨酸、缬氨酸、氨和精氨酸的含量A组和B组极显著低于C组（P〈0.01）,酪氨酸含量则是A显著低于B组（P〈0.05）,且极显著低于C组（P〈0.01）,B组又显著低于C组（P〈0.05）;胱氨酸含量C组高于A组和B组（P〈0.01）;苯丙氨酸含量是B组高于C组（P〈0.05）,且高于A组（P〈0.01）,C组又高于A组（P〈0.05）;赖氨酸、组氨酸和氨基酸总量含量是C组高于A组（P〈0.05）和高于B组（P〈0.01）,A组高于B组（P〈0.05）,其余氨基酸均无显著性差异（P〉0.05）。A、B组的血清Mg、P、Cu和Ca的含量高于C组,其余矿物元素的含量基本一致。结论 Mn过量、Zn的供给不足可能是影响人工饲养猕猴被毛质量的因素;胱氨酸对改善猕猴被毛品质、提高被毛质量应该有一定作用;高营养水平的Ca、Mg、P和Cu可能会影响人工饲养的猕猴的被毛质量。     

人凝血因子Ⅶ单克隆抗体的制备与鉴定

目的：制备抗人凝血因子Ⅶ单克隆抗体并鉴定其特性。方法：应用杂交瘤融合技术,以重组人凝血因子Ⅶ为抗原免疫BALB／c小鼠;取免疫小鼠的脾细胞与Sp2／0骨髓瘤细胞融合,经间接ELISA法筛选、融合细胞有限稀释法克隆、克隆化杂交瘤细胞株的亚类鉴定等方法筛选出单克隆抗体杂交瘤细胞株,并对单克隆抗体的特异性进行鉴定;用杂交瘤细胞株诱生小鼠腹水,应用蛋白A亲和层析法进行单抗的纯化。结果：获得了3株可稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞3E8、3D2和1C5,诱生的腹水效价分别为1：1×10^7、1：1×10^6和1：1×10^6;亚类鉴定表明388为IgG2a,其余2株均为IgGl;特异性鉴定显示它们与多种血浆蛋白均无交叉反应,表明单抗是特异的;经过亲和层析,获得了纯化的单抗。结论：获得了特异性的人凝血因子Ⅶ单克隆抗体,为建立人凝血因子Ⅶ检测及纯化方法奠定了基础。     

Monoclonal antibody for calcitriol (1 alpha,25-dihydroxyvitamin D3)

Hybridoma cell lines secreting antibodies for vitamin D3 metabolites have been generated by fusing splenocytes from BALB/c mice immunized with 3 beta-glutaryl-25-hydroxyvitamin D3 conjugated to bovine serum albumin (3 beta-glu-25-OH-D3-BSA) and Sp2/O-Ag14 myeloma cells. Purification of monoclonal antibodies from culture media or ascites fluids was accomplished by procedures including affinity chromatography on Protein A-Sepharose 4B. Each monoclonal antibody was analyzed as to its affinity and specificity by equilibrium dialysis and an enzyme immunoassay (EIA) based on a double antibody system. It was demonstrated that clone 1C2-60 produced an antibody highly specific to 1 alpha,25-dihydroxyvitamin D3 (calcitriol), and the clone 2B3-66 antibody was reactive to 25-hydroxyvitamin D3 and similar structural compounds. These two monoclonal antibodies produced by 1C2-60 and 2B3-66 were determined to belong to the IgG2a class, and their affinity constants (Ka) with 3 beta-glu-25-OH-D3 were demonstrated to be 3.6 X 10(9) M-1 and 2.9 X 10(9) M-1, respectively, at 4 degrees C. The characteristics of these monoclonal antibodies were compared with those of conventional antibodies raised in mice and rabbits. Finally, by using monoclonal antibody 1C2-60, a sensitive EIA has been developed that can detect 10 pg of calcitriol.     

食蟹猴微卫星DNA标记遗传监测及多态性分析

目的研究国内食蟹猴种群的遗传背景特性,建立食蟹猴种群遗传质量监测方法。方法采用微卫星DNA遗传标记技术对50只食蟹猴种群个体进行遗传质量监测及DNA多态性分析。结果从100个微卫星DNA位点中筛选出20个多态性高的位点,其食蟹猴种群个体的等位基因数目为5-10条,个体间均呈现高度的多态性;其观察等位基因数（Na）为5.0～10.0,有效等位基因数（Ne）为4.6118～8.3404,基因多样性（H）为0.7832～0.8801和香隆信息指数（I）为1.5651～2.1592。结论本实验有效地分析了食蟹猴种群的遗传多态性,为今后筛选特异性微卫星位点来建立食蟹猴种群遗传质量监测方法提供了理论依据。     

Blood groups of crab-eating macaques (Macaca fascicularis) demonstrated by isoimmune rhesus monkey (Macaca mulatta) sera.

Twenty-one isoimmune sera produced in rhesus monkey (Macaca mulatta) containing type-specific antibodies for simian-type red cell antigens were tested for their cross-reactivity with red cells from crab-eating macaques (M. fascicularis). The majority of the antisera gave cross-reactions determining polymorphisms in the red cells of crab-eating macaques, homologous to those of rhesus monkeys. These results attest to the close taxonomic realationship between the two species of macaques, and have the practical implication that isoimmune sera produced for blood typing can also be used for typing red cells from related species, as has been also observed in studies on apes.     

基于单个B细胞抗体基因扩增技术筛选马IgG1单克隆抗体*

在马的免疫学研究领域中,由于目前市场上缺乏商业化的马IgG单克隆抗体,使得对马的B细胞研究受到很大阻碍,IgG是B细胞受体(BCR)的重要构成成分,与B细胞分化成熟相关。为了获得马IgG特异性单克隆抗体,利用单个B细胞扩增技术进行抗体筛选。首先,将马IgG蛋白(EqIgG1-C)密码子优化后合成到真核表达载体pcDNA3.4上,纯化出抗原蛋白。随后,使用蛋白质免疫小鼠,分离脾细胞后利用流式细胞术分离特异性单个B细胞,扩增出抗体重链和轻链的可变区基因,用overlapping PCR方法扩增出线性化的完整抗体,并进行鉴定。结果从80个B细胞中获得了27株特异性重组单克隆抗体,并挑选出3株线性结合活性最强的抗体基因构建到表达载体上,共转染Expi293F^TM细胞后表达纯化,经过ELISA和Western blot验证,显示获得的抗体可以和EqIgG1-C蛋白有良好的结合作用。使用该方法可以省时高效的获得特异性抗体,为马的免疫学研究提供了重要研究工具,为鼠单克隆抗体筛选提供了技术拓展。     

抗H9亚型禽流感病毒血凝素单克隆抗体的制备和鉴定

目的:获得分泌抗H9亚型禽流感病毒(AIV)血凝素单克隆抗体的杂交瘤细胞。方法:以H9N2亚型AIV为免疫原,免疫6～8周龄雌性BALB/c小鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞Sp2/0-Ag-14,在PEG4000的作用下进行细胞融合,通过血凝抑制(HI)试验筛选分泌抗H9亚型AIV血凝素单克隆抗体的杂交瘤细胞。结果:经过连续3～4次克隆化,获得能稳定分泌抗H9亚型AIV血凝素的单克隆抗体细胞系6株,分别命名为1B2、1C10、1G2、2B7、2E3和5E11。6株细胞培养上清HI效价为24～28,腹水HI效价为210～213。除1G2为IgM外,其余5株均为IgG1。Western blotting结果显示,1B2、1C10、2B7和2E3能与AIVH9蛋白在Mr为75000处反应,表明其是针对AIVH9亚型血凝素蛋白的单抗。特异性试验表明该6株单抗均只与H9亚型AIV发生特异性HI反应,而不与其他14个HA亚型的AIV及新城疫病毒、传染性支气管炎病毒发生交叉反应,显示出良好的特异性。结论:制备了针对H9亚型禽流感病毒血凝素的单克隆抗体,为禽流感的快速诊断和病毒的抗原性分析等奠定了基础。     

Herpesvirus simiae (B virus) antibody response and virus shedding in experimental primary infection of cynomolgus monkeys.

Four cynomolgus monkeys (Macaca fascicularis) were inoculated in the lips and tongues with B virus. Virus shedding and antibody responses were monitored for up to 50 days postinfection. Virus was isolated from the oral cavities of all monkeys at 6 days postinfection despite the absence of observable lesions. Virus was not isolated from genital swabs or serum. Antibodies to both B virus and herpes simplex virus were detected by neutralization between days 8 and 12. Virus-specific IgM and IgG antibodies were measured by antibody capture radioimmunoassay. IgM was first detected on day 6; by contrast, IgG did not appear until day 12. Antibodies reactive in a competitive radioimmunoassay appeared by day 12 and peaked at 30 to 40 days postinfection. This study provides data on which to base the diagnosis of primary B virus infection in cynomolgus monkeys.     

柑橘衰退病毒多克隆和单克隆抗体的制备及检测效果分析

通过改进提纯方法获得了柑橘衰退病毒(Citrustristezavirus,CTV)的提纯液,其产量为1mg/100g植物组织。用CTV免疫大耳白兔,获得多克隆抗体,间接ELISA效价为1∶25600。用CTV免疫小鼠,经细胞融合、ELISA筛选和克隆化培养,获得18株能稳定分泌抗CTV单克隆抗体的杂交瘤单细胞株。对其中4株单克隆腹水抗体进行分析的结果表明,这些抗体的ELISA效价为1∶51200~1∶204800,其中2G和3H的抗体类型及亚类为IgG2a,1E和4H为IgG2b。用所制备抗体对不同来源柑橘样品的CTV检测结果显示,单克隆和多克隆抗体结合使用,采用三抗体夹心ELISA(TAS-ELISA)可以获得理想的检测效果,其特异性强、灵敏度高。同时发现所分析4株单克隆抗体对不同的CTV分离物鉴别能力存在差异,但有关这些CTV分离物的特性及其血清学关系还需进一步研究。