黑线仓鼠及其白化突变系酪氨酸酶基因的克隆与序列分析

目的 对黑线仓鼠及其白化突变系酪氨酸酶基因进行比较研究,揭示黑线仓鼠白化突变系白化性状产生的分子机理.方法 根据小鼠与大鼠的酪氨酸酶基因保守区设计3对引物,利用RT-PCR方法,从黑线仓鼠及其白化系皮肤总RNA中扩增得到酪氨酸酶的cDNA基因,并对其二者进行克隆测序.结果 成功获得了黑线仓鼠及其白化突变系的酪氨酸酶基因,对二者的序列比较分析结果表明,二者的编码区没有差异.结论 黑线仓鼠白化突变系白化性状产生的原因与已知小鼠的白化性状产生原因不同,并不是由酪氨酸酶基因编码区突变造成的,其白化性状产生的机理有待进一步的研究.     

黑线仓鼠及其白化突变系毛囊中黑色素细胞的组织学分析

目的黑线仓鼠白化突变系是一种新的实验动物模型,本研究旨在组织水平上观察黑线仓鼠与白化突变系皮肤组织中黑色素细胞的分布与定位,以揭示黑线仓鼠白化突变系发生的细胞学机制。方法本实验选择黑线仓鼠和白化突变系各6只,取背部皮肤,制备石蜡切片,分别采用多巴染色、多巴-甲苯胺蓝复染,光镜观察、拍照。结果 Dopa染色显示,在黑线仓鼠与白化突变系皮肤组织中均有成熟黑色素细胞的分布,主要存在于毛囊毛乳头中,且黑线仓鼠黑色素阳性区要明显高于白化突变系。结论黑线仓鼠的酪氨酸酶活性要高于白化突变系。     

黑线仓鼠及其白化突变系血液生理生化值的测定与分析

目的测定黑线仓鼠及其白化突变系的血液生理生化参数,比较两者的差异,为医学实验研究提供参考。方法用眼球取血的方法采集动物全血,分别制备抗凝血和血清,应用全自动生化分析仪和全自动血细胞分析仪进行测定。用SPSS10.0软件包对测定结果进行分析。结果测定了黑线仓鼠及其白化突变系的血液生理生化正常值范围,并与其它动物的数据进行了比较。结论确定了黑线仓鼠与其白化突变系的血液生理生化正常值范围,两者在多项指标上存在差异。而且,黑线仓鼠及其白化突变系的血小板计数均高于小鼠,约高出3倍,这一差异可能有利于两者作为血液凝集实验模型的研究。     

PR8F/NS1不同位点突变株对小鼠致病性的比较研究

为了探索NS1不同位点突变对流感病毒毒力的影响以及NS1毒力相关位点的作用机制。分析流感病毒NS1蛋白的毒力相关关键基因区段和关键位点,以实验室保存的H1N1亚型流感病毒PR8F为模板,对其NS1基因的第42、81、149位氨基酸分别进行定点突变。利用反向遗传操作技术,成功拯救出突变毒株PR8F-42、PR8F-81、PR8F-149。将获救病毒接种SPF鸡胚,连续传代5代,至病毒能够稳定扩增后,通过血凝效价分析病毒复制效率。并将获救病毒与PR8F均以106 TCID50/100μL感染BALB/c小鼠,观察各组小鼠临床表现、体重变化及存活率。剖检攻毒后死亡小鼠,观察病理特征,制作肺组织病理切片。并提取小鼠肺脏RNA,通过qPCR检测各组小鼠肺脏的病毒载量。结果表明,PR8F的NS1蛋白第42位氨基酸由丝氨酸(Ser)改变为脯氨酸(Pro)对小鼠的致病性无明显改变。第81位、149位氨基酸突变则都能减弱突变株对小鼠的致病性,进而为研究NS1毒力相关位点的作用机制提供平台。     

高分辨率熔解曲线分析技术及其应用进展

高分辨率熔解曲线分析(High Resolution Melting,HRM)是结合饱和荧光染料、未标记探针和实时荧光定量PCR的一种新的检测基因突变与基因分型的分子诊断技术,具有高通量、低成本、简单快捷、结果准确、灵敏度和特异性高和真正闭管操作等优点。本文就高分辨率熔解曲线分析的临床应用和研究进展进行综述。     

红莲型细胞质雄性不育（HL-CMS）水稻不育系与保持系中3个ANTs基因表达模式的比较

探讨红莲型细胞质雄性不育（HL-CMS）水稻不育系‘粤泰A’（‘YTA’）和保持系‘粤泰B’（‘YTB’）中3个腺苷酸转位酶（ANT）基因在三叶期根、茎、叶以及不同发育时期的幼穗中的表达模式。结果表明：ANT1和ANT2在‘YTA’和‘YTB’三叶期的根、茎、叶中的表达量都较高,而在生殖生长不同时期的幼穗中表达量较低。‘YTA’中ANT1在不同时期的幼穗中表达量都较低,而ANT2的表达量到穗生长期II的幼穗才较低。‘YTB’中ANT1在生殖生长的穗生长期III的幼穗有很高的表达。ANT3的表达水平在研究的各组织中的表达都较低,在‘YTB’穗生长期V的幼穗中表达最高。相对于‘YTA’,‘YTB’中只有ANT3在穗生长期III和穗生长期V的幼穗中呈现明显的优势表达;而相对于‘YTB’,‘YTA’中ANT2和ANT3在穗生长期I、ANT2在穗生长期VI幼穗具有明显的优势表达。3个ANTs基因在HL-CMS不育系‘YTA’和保持系‘YTB’不同组织及发育时期的表达模式的差异,暗示它们可能与HL-CMS水稻不育系和保持系的发育调控有关。     

生长抑素基因在不同性别和年龄黑线仓鼠哈氏腺的差异表达

哈氏腺作为“视网膜-松果体轴”的候补结构,介导了体外光信号与体内神经内分泌调控过程,具有多样性和复杂的生理功能,并受神经和体液因素的双重调控。生长抑素（somatostatin, SS）是调控动物生长发育的主要因子之一,检测SS基因在黑线仓鼠哈氏腺的差异表达模式,为光信号调控动物的生长发育机制提供理论依据。以野生黑线仓鼠（Cricetulus barabensis）为研究对象,测量了不同性别和年龄个体哈氏腺的形态学指标,克隆了哈氏腺SS cDNA序列,实时荧光定量PCR方法检测了哈氏腺中SS基因的表达变化。结果显示：（1）黑线仓鼠体重无性别差异,随年龄增长而增加;哈氏腺的长度和重量也随年龄增长而增加;调整体重影响后,哈氏腺的重量和长度没有年龄之间的差异,但哈氏腺重量存在性别间差异（P<0.05）。（2）克隆到黑线仓鼠哈氏腺SS cDNA序列489 bp ,并对序列结构进行分析,黑线仓鼠哈氏腺SS cDNA具有典型分泌蛋白cDNA的特征,并在进化上高度保守;（3）检测到SS mRNA在黑线仓鼠哈氏腺中均有表达,表达量存在年龄和性别差异（P<0.05）;（4）随着个体性成熟和衰老,黑线仓鼠哈氏腺中SS mRNA的相对表达量逐渐降低,其表达量分别与哈氏腺长度和重量的发育变化负相关（r=-0.557,P=0.022;r=-0.806,P＜0.001）。结果表明,黑线仓鼠哈氏腺重量和SS表达量均表现出两性异形,可能是对不同繁殖策略的适应;SS基因作为负调控因子参与野生黑线仓鼠哈氏腺的生长发育过程。     

绵羊ghrelin基因表达的组织分布和发育性变化

选取2、30、60、90和120日龄的雄性哈萨克羊和新疆细毛羊各6只（无120日龄的哈萨克羊）,测体重后屠宰,采下丘脑、垂体、心脏、肝脏、瘤胃、网胃、瓣胃、皱胃、十二指肠、背最长肌,用RT-PCR和荧光实时定量PCR法检测ghrelin基因表达的组织分布,及其在皱胃中的发育性变化。研究结果表明：（1）品种内各生长时期的体重差异显著（P〈0．05）。雄性哈萨克羊和新疆细毛羊的体重在2日龄时无显著差异（P〉0．05）,30～90日龄间,前者的体重极显著高于后者（P〈0．01）;（2）所检测的各组织中都有ghrelin mRNA分布,但主要在皱胃中表达,其表达量远高于其他组织（P＜0．05）;（3）两品种绵羊皱胃ghrelin基因表达的发育性变化模式基本相似,都随着日龄的增加而呈上升趋势,其中雄性哈萨克羊的表达量在2～60日龄间持续上升,60日龄后趋于水平;雄性新疆细毛羊的表达量在2～90日龄间持续上升,90日龄后趋于水平。研究还发现雄性哈萨克羊皱胃胂relin基因的表达量在2～90日龄间极显著高于新疆细毛羊（P＜0．01）。     

标准品制备方法对FQ-PCR定量基因表达水平的影响

实时荧光定量PCR (FQ-PCR)标准曲线法准确定量基因表达的关键在于标准品与待检样本的扩增效率是否一致. 为检测DNA标准品与样本cDNA扩增效率的一致性,探讨定量用标准品的最佳制备方法,本研究以脂肪酸结合蛋白5(Fabp5)、过氧化物酶体增殖活化受体α (Ppar-α)及β肌动蛋白（β-Actin）的3个基因为对象,分别采用质粒纯化法、PCR产物直接纯化法、PCR产物凝胶回收法制备DNA标准品,10倍梯度稀释后用FQ PCR制作标准曲线. 并以10倍梯度稀释的样本cDNA标准曲线的参数为对照,进行比较分析. 结果表明,不同方法制备的DNA标准品的扩增效率差异较大,并且与cDNA的扩增效率不一致,不能对cDNA样本进行准确定量. 另外,虽然目的基因在cDNA样本中的拷贝未知,不能对基因表达水平进行绝对定量,但因不同cDNA样本的同一基因的扩增效率一致, 可对基因的表达进行准确的相对定量.     

转绿型白化突变系W_ (25)转绿过程中幼苗叶片内碳水化合物和氨基酸组分的变化

水稻转绿型白化突变系W25与亲本2177s苗期叶片内碳水化合物总量及蛋白质含量差异明显。亲本2177s幼苗叶片内碳水化合物和蛋白质代谢在两种温度下基本稳定。但W25却有明显不同,25℃下W25叶片内蔗糖和淀粉的含量比20℃下的低,但还原糖含量明显地高,蛋白质含量较高,丙酮酸激酶和谷氨酸胺合成酶活性强,游离氨基酸中Ser、Glu、Val的含量明显较低,Arg、Pro、Thr的含量明显较高,尤其是Thr含量接近了亲本水平。     

东北地区黑线仓鼠的代谢产热特征及其体温调节

为探讨寒冷地区黑线仓鼠 (Cricetulusbarabensis)的代谢产热特征及体温调节 ,本文采用封闭式流体压力呼吸仪对其代谢率、热传导和体温等热生物学指标进行了测定。结果显示 :在环境温度为 5～ 35℃的范围内 ,黑线仓鼠的体温基本维持恒定 ,平均体温为 36 33± 0 2 3℃ ;热中性区为 2 5～ 32 5℃ ;基础代谢率为 3 4 9±0 36mlO2 / (g·h) ;环境温度 (Ta)在 5～ 2 5℃范围内 ,代谢率 (MR)与Ta 呈负相关 ,回归方程为 :MR [mlO2 / (g·h) ]=9 6 0 - 0 2 2Ta (℃ ) ,在此范围内 ,黑线仓鼠的热传导率 (C)最低 ,平均为 0 2 8± 0 0 1mlO2 /(g·h·℃ ) ;代谢预期比和热传导预期比 (F值 )为 1 6 8。黑线仓鼠的基本热生物学特征为 :较高的BMR和热传导率 ,相对较低的体温和较宽的热中性区。这些特征可能限制了其在极端寒冷和干旱环境中的分布和生存.     

温度对黑线仓鼠能量代谢及开场行为的影响

形态、生理及行为的季节性变化是动物生存和繁殖的适应性策略。温度可能是影响啮齿动物季节性繁殖和种群波动的重要气候因子。为了验证环境温度能诱导鼠类体重、能量代谢及行为产生适应性变化的假设,并探究其中的相互关系和意义,通过不同温度处理模拟四季温度,以野生雄性黑线仓鼠(Cricetulus barabensis)为研究对象,检测其体重、日食量、静止代谢率(RMR)及开场行为的变化。结果显示:随着处理温度的下降,黑线仓鼠的体重、日食量及静止代谢率均出现显著性或极显著性地增加趋势(P0.05或P0.01);以体重为协变量的协方差分析表明,日食量和静止代谢率的增加不完全是由体重增加而造成的;高温处理降低了黑线仓鼠的爬行格数(P0.01),低温处理降低了黑线仓鼠的爬行格数和后肢站立次数(P0.01或P0.05),并产生明显的颤抖现象。以上研究结果支持环境温度能诱导鼠类体重、能量代谢及行为产生适应性变化的假设。低温同时增加黑线仓鼠能量的摄入水平和维持基本生长的能量支出水平,同时降低动物在陌生环境中的自发活动与探索行为。高温则降低黑线仓鼠能量的摄入和支出水平,同时减少自发活动与探索行为。体重、能量代谢和行为学特征的变化有利于仓鼠度过寒冷的冬季和干热的夏季,同时也与仓鼠的季节性繁殖现象相一致,因此这些特征可能是黑线仓鼠对其寒冷的冬季及干热的夏季生存环境的适应。     

繁殖经历对黑线仓鼠哺乳期能量收支的影响

为探讨繁殖经历与哺乳期最大持续能量收支的关系,对连续4 次繁殖的黑线仓鼠哺乳期的能量收支情况进行了测定。结果显示:1)不同繁殖组哺乳高峰期的摄食量、泌乳能量支出(MEO)、胎仔数和胎仔重差异不显著,静止代谢率(RMR)、非颤抖性产热(NST)、褐色脂肪组织(BAT)线粒体细胞色素c 氧化酶(COX)活性、血清甲状腺激素(T3 、T4 )和催乳素水平也无明显变化;2)摄食量与MEO、胎仔重和RMR 呈显著正相关。结果表明,不同繁殖经历的黑线仓鼠主要通过降低产热和增加能量摄入来满足哺乳高峰期的能量需求;哺乳期最大持续代谢率(SusMR)可能受乳腺组织泌乳能力的限制,与“外周限制假说” 的预测一致,不支持“中心限制假说”;SusMR 限制因素和哺乳期能量收支策略可能与繁殖经历无关。     

被毛在黑线仓鼠能量代谢、产热和体温调节中的作用

为阐明小型哺乳动物被毛的季节性变化及其在能量代谢和体温调节中的作用,测定了季节性驯化,以及不同光周期和温度驯化的黑线仓鼠的被毛重量、体温和能量收支。结果显示: (1)冬季黑线仓鼠的被毛重量和产热显著高于夏季;(2)短光照(8L∶16D)和低温(5℃ ) 对被毛生长的影响不显著; (3)与室温组(21℃ )相比,低温组(5℃ )摄入能、基础代谢率(BMR)、非颤抖性产热(NST) 、褐色脂肪组织细胞色素c 氧化酶活性和热传导率显著增加,而暖温组(30℃ )显著降低; (4)室温和低温下,剃毛导致摄入能、BMR、NST 和热传导率显著增加;结果表明:被毛的作用与环境温度有关,低温下被毛降低了能量需求,增强了动物应对低温环境的适应能力;被毛的适应性变化是独居的野生小型哺乳动物应对环境温度季节性波动的主要适应策略之一,在其能量代谢和体温调节中具有重要作用和意义。     

花生对非繁殖期雌性黑线仓鼠细胞免疫和血液指标的影响

食物的数量和质量是影响动物免疫功能的重要因素。野生动物在选择食物时是否会优先选择有利于其健康的食物？为解决该问题,我们以黑线仓鼠(Cricetulus barabensis)为研究对象,通过饲喂其喜食食物花生(Arachis hypogaea),然后检测反映健康状况的细胞免疫能力和血液指标。将30只非繁殖期成年雌性黑线仓鼠随机分为正常饲料组(normal fodder group,NF,n=10)、花生加饲料组(normal fodder plus peanuts group,NP,n=10)和花生组(Peanut,n=10),饲喂39 d后检测各项指标。结果发现Peanut组的体重增加,NP和Peanut组的摄食量降低。NP组注射植物血球凝集素(Phytohaemagglutinin,PHA)后12 h的PHA反应显著高于NF组。3组间白细胞数和淋巴细胞数在统计学上没有显著差异,但NP和Peanut组白细胞数比NF组分别高22.9%和25.0%,淋巴细胞数分别高15.0%和22.5%。NP和Peanut组红细胞数和红细胞压积显著高于NF组,而Peanut组血小板数显著高于NF和NP组。这些结果表明饲喂花生能增强黑线仓鼠的细胞免疫能力、输氧能力和凝血功能,这可能是其喜食花生的生理原因。     

外周血单个核细胞TNF-α 基因表达与哮喘相关表型*

目的:探讨外周血单个核细胞(PBMC)TNF-α基因mRNA表达与哮喘严重程度、临床病理及相关影响因素的关系。方法:采用实时荧光定量PCR技术检测67例哮喘病人和25例健康对照PBMC中TNF-α mRNA表达水平,分析其与哮喘控制程度、血浆TNF-α浓度、嗜酸性粒细胞百分比(EOS%)、血浆总IgE浓度和哮喘相关影响因素的关系。结果:经方差分析和SNK-q检验,哮喘未控制组PBMC中TNF-α mRNA表达水平高于正常组(P<0.01)、控制组(P<0.01)和部分控制组(P<0.05)。相关分析显示哮喘病人TNF-α mRNA表达与血浆TNF-α浓度和EOS%呈正相关,相关系数分别为r=0.584(P<0.01)和r=0.29(P<0.05),有吸烟史的哮喘病人TNF-α mRNA表达水平高于非吸烟病人(P<0.05)。结论:哮喘病人PBMC中TNF-α mRNA表达水平与哮喘的控制程度呈负相关,与血浆TNF-α浓度呈正相关,PBMC中TNF-α mRNA表达水平与血浆TNF-α浓度可作为哮喘控制程度的参考指标。     

印记基因Dlk1在小鼠胚胎发育中的表达分析

目的:研究印记基因Dlk1在小鼠胚胎发育过程中的动态表达模式,以揭示Dlk1与胚胎发育的关系。方法:通过半定量PCR和定量PCR分析Dlk1在小鼠胚胎发育E8.5～E19.5的基因表达模式,并选取Dlk1表达量最高的时期进行胚胎切片原位杂交和组织定量PCR分析。结果:在小鼠胚胎发育E8.5～E15.5时,Dlk1的表达逐渐升高,在E15.5时表达量达到最高;E15.5～E19.5时,Dlk1表达有所下降,但仍然维持较高水平。E15.5切片原位杂交显示,垂体、肺脏、软骨、舌和背侧肌肉组织中Dlk1表达较高,组织定量PCR实验进一步证实了原文杂交的结果。结论:Dlk1在小鼠胚胎发育中后期持续表达,并呈现一定的组织特异性,对胚胎发育可能起重要的调节作用。