大肠杆菌发酵重组人白细胞介素—2的高密度表达

利用美国NBS公司BibFloⅢ型发酵罐,采用连续流加的方法培养能表达IL-2的E．coli,结果细菌温重达100g／L发酵液,IL－2活性达1．52×1010U／L发酵液。     

重组大肠杆菌高表达高密度发酵研究

大肠杆菌高密度高表达发酵技术是现代发酵工程的重要研究课题,此项技术可以有效地提高大肠杆菌的产量和外源重组蛋白的表达量,该文就影响大肠杆菌高密度发酵的主要因素如宿主菌类型、培养基组成、培养条件、生长抑制物质、补料调控等进行了阐述和讨论。     

重组大肠杆菌高密度发酵研究进展

重组大肠杆菌的高密度发酵是提高基因工程产品产量的一个非常有铲的手段,是现代发酵工程研究的一个热点。本文就高密度发酵中影响重组大肠杆菌发酵产率的几个因素,包括宿主菌、培养基、培养条件、补料方法以及高密度发酵过程中存在的问题和对策加以讨论,着重探讨了高密度下大肠杆菌产生的有害代副产物－－乙酸的产生机制、抑制作用机理,以及控制乙酸机累的技术方法。     

重组大肠杆菌高密度发酵研究进展

重组大肠杆菌的高密度发酵是提高基因工程产品产量的一个非常有效的手段,是现代发酵工程研究的一个热点。本文就高密度发酵中影响重组大肠杆菌发酵产率的几个因素,包括宿主菌、培养基、培养条件、补料方法以及高密度发酵过程中存在的问题和对策加以讨论,着重探讨了高密度下大肠杆菌产生的有害代谢副产物———乙酸的产生机制、抑制作用机理,以及控制乙酸积累的技术方法 。     

重组大肠杆菌高密度、高表达研究进展

高密度发酵因其节约、高效等诸多优点而成为近年来发酵工业重要的研究热点之一。要实现重组大肠杆菌高密度发酵,不仅要考虑工程菌自身的表达性能,还必须兼顾能促进基因工程菌生长和产物表达的最适培养条件,包括较佳的培养基组成、适宜的补料策略、培养温度、pH值、溶解氧等。该文就影响大肠杆菌高密度发酵的影响因子、工艺条件等进行综述,并探讨了大肠杆菌高密度发酵的工艺改进方向。     

重组大肠杆菌产普鲁兰酶的高密度发酵工艺研究

以表达普鲁兰酶的重组大肠杆菌作为出发菌株,在摇瓶培养的基础上,建立了大肠杆菌工程菌产普鲁兰酶的高密度发酵工艺。通过测定细胞密度、细胞干重、分离菌体可溶性成分与不溶性成分及SDS-PAGE电泳,分析重组大肠杆菌的生长和普鲁兰酶的表达情况。摇瓶试验使用合成培养基和LB培养基,重组大肠杆菌在合成培养基生长较慢,诱导5 h的普鲁兰酶表达量高于LB培养基,包涵体比例低于LB培养基。重组大肠杆菌的高密度发酵使用合成培养基,补料阶段采用指数流加的工艺,在设定细胞的比生长速率为0.12的前提下,限制补料中碳源的供应,以阻止乙酸的产生。当细胞密度OD600达到70.0开始诱导,最终细胞密度为每升53.3 g细胞干重,细胞内可溶性普鲁兰酶为每升1.35 g。     

重组人干扰素—β在大肠杆菌中的表达与活性分析

利用定点突变技术将人干扰素-β第17位半胱氨酸编码序列突变为丝氨酸(IFN-βser17),DNA序列分析证明了其核苷酸序列的正确性,并在大肠杆菌TAP106中获得高效表达,IFN-βser17表达量达20%,用Westemblot得到单一条带,细胞病变抑制法测定其比活性达(2～3)×107U/mg.INF-βser17的比活性和稳定性均超过天然人IFN-β.     

重组人α2a干扰素的高效表达与纯化

构建了人α2a型干扰素的表达载体,并在大肠杆菌中获得了高效表达,表达量平均为10~ IU/L菌液。还对其表达产物进行了纯化。经盐酸胍裂解菌体、硫酸铵沉淀、酸化处理,再经阴、阳离子交换层析和单克隆抗体亲和层析,使表达产物纯化了1072倍,比活性达1.2×IO~ IU/mg蛋白,达到序列纯,回收率达54％。表达产物N端21个氨基酸序列分析结果与IFN-α2a cDNA推导的序列相符合。     

两次诱导实现重组大肠杆菌高密度、高表达研究

通过不同温度诱导模式对大肠杆菌高密度,高表达的研究,确定两次升温诱导模式实现大肠杆菌高密度、高表达重组人载脂蛋白的目的。实验证实两次诱导成功的避免了乙酸对高密度、高表达的影响,最终发酵的细胞密度OD600达150,蛋白表达量4.8g·L-1,证明两次升温诱导的发酵方法在高密度、高表达外源蛋白上是成功的,从而为基因工程菌规模化生产奠定了基础。     

重组大肠杆菌高密度培养研究进展

大肠杆菌是基因工程中常用的宿主菌,许多有价值的多肽和蛋白在大肠杆菌中已成功地进行了表达,表达水平有些高达细胞总蛋白的３０％以上,为了提高单位体积设备产物的产量,除了提高表达水平外,还需提高重组大肠杆菌的培养密度。大肠杆菌高密度培养的早期工作主要是以宿主菌为模型进行研究的,而近年来,重组大肠杆菌高密度高表达的研究已经有了较大进展。本文着重综述了培养基成分、溶氧、比生长速率和代谢副产物乙酸等因素对工程菌生长和表达的影响,及提高菌密度和表达水平的培养方法。     

重组酵母菌的高密度发酵表达

酵母作为一类外源基因的表达系统具有很多优点 ,有许多外源基因在工程酵母菌表达生产重要的外源蛋白[1] 。从生理学角度看 ,作为外源基因的受体细胞 ,酵母的生理和遗传特性影响着外源基因的表达。同时 ,外源基因的表达 ,特别是高表达的外源蛋白对宿主细胞有抑制作用甚至会导致细胞中毒或死亡。再加上工程菌的培养过程中的不稳定性问题的存在 ,因此 ,菌体细胞的高浓度和目的基因的高表达是一对矛盾 ,它们互相制约 ,构成生物工程研究的重要工作之一。1 .工程酵母菌的高密度发酵酵母的高密度发酵是一个相对概念 ,一般指发酵液中酵母浓度在 30 …     

重组巴氏毕赤酵母高密度发酵表达rHSA

对基因工程菌Pichiapastoris的摇瓶发酵条件进行了试验 ,并根据摇瓶发酵的优化结果进行了补料分批高密度发酵。在摇瓶发酵时 ,甲醇诱导基因工程菌P .pastoris表达重组人血清白蛋白的发酵周期为 96h ;甲醇的最佳诱导浓度为 1 0g L ;发酵pH范围为 5 72～ 6 5 9;在摇瓶培养时 ,随着接种量的增加 ,虽然目的蛋白表达量缓慢增加 ,但单位细胞光密度的蛋白产率却明显下降 ,符合y =1 2 941x- 0 50 59方程 (线性相关系数r=0 9789) ,其限制性因子很可能为溶氧。在分批发酵 ,接种量为 1 0 %且种子细胞光密度 (OD60 0 )为 2 0左右时 ,细胞生长的延迟期为 2 1 1h左右 ,细胞生长光密度与培养时间的关系模型为 :y =0 7841e0 .2 3 19t(线性相关系数r=0 .993 6 ) ;在补料发酵时细胞干重浓度可达到 1 1 5g L— 1 6 0g L ,在 1 2 0h重组人血清白蛋白表达量最大达到 3 6g L。     

重组人干扰素α-2b在大肠杆菌中分泌表达

人干扰素α-2b原始基因在重组原核工程菌中表达量偏低,所以我们在不改变干扰素原有氨基酸组成的前提下,根据大肠杆菌密码子偏爱性使用定向突变技术对huIFNα-2b基因进行点突变。将大肠杆菌STⅡ信号肽基因与突变后huIFNα-2b基因融合并于信号肽5′端和huIFNα-2b基因3′端引入合适的酶切位点。融合基因克隆至载体pCSE,pET-22b和pPAK4L中,此3种载体分别含有组成型启动子、T7启动子和phoA启动子。融合基因在载体pCSE中表达量很低,其中约有50%的目标蛋白能够成功实现分泌。在E.coliBL21中,pET-22b经过IPTG诱导可以实现huIFNα-2b的高表达,但STⅡ信号肽不能被有效切除。含有phoA启动子的载体pPAK4L其在E.coliW3110中可以实现huIFNα-2b较高水平的分泌表达,经过低磷诱导其表达量最高可至20μg/mL(A550)菌液,约有30%的目标蛋白质信号肽能够被成功切除并分泌到胞间质中。     

重组人干扰素α2a软膏的动物皮肤试验

目的 :观察动物皮肤接触重组人干扰素α2a软膏后所产生的刺激反应情况 ,动物完整皮肤及破损皮肤短期内接触重组人干扰素α2a软膏所产生的急性毒性反应以及通过动物皮肤重复接触重组人干扰素α2a软膏后 ,观察机体免疫系统反应在皮肤上表现。方法 :选择家兔和豚鼠为试验动物 ,将干扰素软膏涂在脱毛的动物皮肤上 ,以赋形剂为空白对照 ,2 .4—二硝基氯代苯为阳性致敏物对照。结果 :本品对皮肤的刺激强度〈0 .5 ,即重组人干扰素α2a软膏无刺激性和弱致敏性。结论 :重组人干扰素α2a软膏动物试验中未见皮肤刺激性和过敏性发生 ,说明本品具有较高的安全性     

重组大肠杆菌高密度培养研究进展

重组大肠杆菌细胞高密度培养(High cell-density cultivation,HCDC)是获得高外源蛋白产率的一种重要策略,影响重组大肠杆菌高密度培养的因素主要有以下几个方面:重组体的构建及其稳定性,培养基成分,培养方式,培养条件及培养过程中抑制性代谢产物的积累等。从以上几个方面对近期的研究进展进行了综述。     

重组人干扰素α2b的提取和纯化

为了提高重组人干扰素α2b的质量 ,增加产量 ,降低成本 ,通过破菌 ,包涵体提取 ,离子交换层析 ,凝胶过滤等纯化方法制备干扰素纯品。结果表明干扰素纯度可达 95%以上 ,比活达到 1.2× 10 8IU/mg以上。结果提示 ,采用本方法收率高 ,纯度好 ,工艺稳定 ,适合大规模生产     

重组大肠杆菌高密度发酵生产RGD-TRAIL的条件优化

本文以一株产RGD-TRAIL的重组大肠杆菌为研究对象,在10L发酵罐中考查了诱导温度、pH值、溶氧、流加葡萄糖对重组大肠杆菌生长和RGD-TRAIL蛋白表达的影响。结果表明:诱导温度25℃,pH值控制7.0,溶氧控制30%,以5g·L~(-1)·h~(-1)流速流加葡萄糖最有利于菌体生长和蛋白表达,菌体收率和RGD-TRAIL产量分别达到45.99g·L~(-1)和160.2mg·L~(-1)。     

发酵条件对毕赤酵母表达重组人干扰素ω糖基化的影响

发酵条件是影响毕赤酵母 (P .pastoris)表达外源重组糖蛋白时糖基化的重要因素。通过菌体浓度、起始pH值、甲醇诱导浓度和周期、装液量等摇瓶发酵实验 ,研究不同发酵条件对毕赤酵母表达分泌型重组人干扰素ω(rhIFNω)过程中糖基化的影响 ;同时 ,在连续培养过程中考察pH值变化对rhIFNω糖基化的影响和分批发酵过程中rhIFNω糖基化的变化。结果表明 ,控制菌体密度 250g L(WCW)、起始pH值 6 0、装液量小于 30mL、甲醇诱导浓度 15g L、甲醇诱导 3次 (每 24h诱导一次 )等发酵条件 ,有利于摇瓶发酵过程中rhIFNω的糖基化 ;控制pH值 70～75可促进rhIFNω的糖基化 ;分批发酵过程中 ,糖基化与非糖基化rhIFNω的含量有同比变化趋势 ,但糖基化rhIFNω所占比例明显低于摇瓶发酵实验的结果 ,其原因有待进一步研究。     

重组大肠杆菌的高密度发酵和甘油生产条件的初步研究

在摇瓶中进行重组大肠杆菌菌株BL21高密度发酵条件的研究,考察了葡萄糖浓度、盐离子浓度、温度、接种量、发酵时间等对该菌株生产甘油的影响。初步确定底物浓度为2.5%,盐离子浓度0.2%,温度为37℃,接种量为2%,经24h的摇瓶发酵,甘油产量最高达6.8g/L。在30L发酵罐实验中、按初步确定的优化条件发酵26h,甘油产量可达46.67g/L,是LB/葡萄糖培养基中甘油产量的2.06倍。