用快速琼脂糖层析纯化磷酸甘油酸激酶及磷酸甘油醛脱氢酶

研究了用快速琼脂糖离子交换层析(DEAE—Fast Flow sepharose)结台PEG 4000／Reppal PES双水相体系从黄豆中分离纯化磷酸甘油酸激酶(PGK)及磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)。控制床层高度(10～20cm),径向放大具有压降低的优点．设计多点进料取代传统的中心管进料,解决了径向流场不均匀的问题。GAPr)H的总收率及纯化倍数分别为58％和144,PGK的总收率及纯化倍数分别为41％和44。工艺成本为2．92美元／ku GPADH,具有一定的实用价值。     

用双水相萃取分离纯化磷酸甘油酸激酶和磷酸甘油醛脱氢酶

用聚乙二醇（ＰＥＧ）／羟丙基淀粉（ＲｅｐｐａｌＰＥＳ）双水相体系两步法从黄豆中分离磷酸甘油酸激酶（ＰＧＫ）和磷酸甘油醛脱氢酶（ＧＡＰＤＨ）。ＰＧＫ在上相收率及ＧＡＰＤＨ在下相收率均在８０％以上。放大采用离心倾析机（ｄｅｃａｎｔｅｒ）连续处理匀浆液,用离心萃取器（ｓｅｐａｒａｔｏｒ）完成双水相体系的萃取两相分离。整个工艺具有处理量大、接触时间短、酶收率高的优点     

2型猪链球菌磷酸甘油酸激酶基因的克隆表达及酶活性测定

目的:克隆表达2型猪链球菌中磷酸甘油酸激酶(PGK)并对其酶学特性进行测定。方法:采用PCR方法从05ZYH33基因组中扩增出pgk片段,构建重组表达质粒p ET28a:pgk,经双酶切及测序验证正确的质粒转化入E.coli BL21(DE3)中进行IPTG诱导表达,重组PGK蛋白经SDSPAGE和质谱鉴定并测定其酶学活性。结果:PGK在大肠杆菌中可溶性表达,纯化后得到约43k Da的重组PGK蛋白,其酶促反应最适温度为25℃,最适pH为7.5,2型猪链球菌PGK的酶活性为75U/ml,PGK相对于3-PGA的Km值为1.744mmol/L,Vmax为0.143mmol/(L·min),相对于ATP的Km值为2.266mmol/L,Vmax为0.318mmol/(L·min)。结论:利用原核表达系统成功地表达了2型猪链球菌中的PGK,并获得了活性较好的重组PGK,酶学检测发现纯化的PGK具有良好的体外活性,为进一步研究该病在2型猪链球菌致病及代谢机制奠定了基础。     

两个新的前列腺癌相关分泌蛋白的鉴定和表达

为了获得代表不同前列腺癌进展阶段的细胞系的胞外蛋白表达谱, 验证其中差异表达蛋白是否为分泌蛋白, 在细胞水平看其是否有作为前列腺癌血清标志物的潜质, 文章利用双向电泳寻找胞外蛋白中差异表达的点, 并质谱鉴定其是何种蛋白质。应用RT-PCR方法分析候选分子在8种细胞系中的表达和对雄激素刺激的应答, 构建了候选分子的真核表达载体, 瞬时转染293T细胞, 应用标签抗体Western blotting方法检测验证细胞培养基中候选分子的表达。结果表明: 筛选出两个C4-2胞外高表达的分子-- 磷酸丙糖异构酶-1(Triosephosphate isomerase 1, TPI1)和多配体聚糖结合蛋白(Syndecan binding protein, syntenin, ST1); 转录水平发现它们与前列腺癌恶性程度相关, 并且后者受雄激素的作用下调; 二者均为分泌蛋白。磷酸丙糖异构酶-1和多配体聚糖结合蛋白均有作为指示前列腺癌发展阶段的血清标志物的潜质。     

抗肿瘤代谢靶标磷酸甘油酸变位酶1 及其抑制剂的研究进展

肿瘤细胞的Warburg效应是近期肿瘤代谢研究的一大热点,磷酸甘油酸变位酶1（PGAM1）在糖酵解生物通路中起着重要作用。 报道显示PGAM1在肿瘤细胞中普遍高表达,同时促进细胞增殖过程中的糖酵解和生物合成代谢通路。基于该发现,针对PGAM1进行小 分子抑制剂研究成为开发抗肿瘤药物的新思路。综述PGAM1在肿瘤细胞中的功能、意义以及PGAM1抑制剂的开发前景。     

磷酸果糖激酶-1与磷酸果糖激酶-2不是同工酶

磷酸果糖激酶-1与磷酸果糖激酶-2催化的反应性质、底物都相同,但是它们的产物是不同的。因此．严格的说它们不是同工酶。     

大肠杆菌磷酸甘油酸脱氢酶突变体的构建及抗反馈抑制效应

磷酸甘油酸脱氢酶(D-3-phosphoglycerate dehydrogenase,PGDH,EC 1.1.1.95)为L-丝氨酸合成途径的关键酶,其编码基因为ser A,其活性受到合成产物L-丝氨酸的反馈抑制调控。为解除丝氨酸的反馈抑制,采用定点突变技术把编码PGDH酶344位组氨酸或346位天冬氨酸或364位天冬氨酸的密码子定点突变为丙氨酸密码子。改造后的ser AFbr被连到表达载体pT7-7上,并转入大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)中进行表达,破壁回收粗酶液,通过DEAE阴离子柱纯化PGDH突变体,并对其酶活性和IC_(50)值进行了测定。结果,野生型PGDH酶IC_(50)值为7μmol/L,而PGDH双突变体N346A/H344A催化活性与野生型相近,在丝氨酸浓度为160 mmol/L时,其酶活仍保持未添加丝氨酸时酶活的96%,基本解除反馈抑制。     

日本血吸虫磷酸甘油酸变位酶SjPGAM基因的克隆、表达及功能分析

磷酸甘油酸变位酶(Phosphoglycerate mutas)是糖酵解过程中的一种重要酶,主要催化3-磷酸甘油酸转化为2-磷酸甘油酸.利用PCR技术从日本血吸虫19 d童虫中首次扩增到一个PGAM家族基因,序列分析表明该基因的完整编码框含753 bp,编码250个氨基酸,理论分子量28.26 kD,理论等电点7.01.同源性分析结果表明,该基因的氨基酸序列具有典型PGAM家族特征,推测为血吸虫的PGAM基因,命名为SjPGAM(GenBank Accession No.EU374631).实时定量PCR分析显示该基因在14d和19d童虫中的表达量明显高于其他发育阶段,42d雄虫中的表达量高于雌虫.构建了该基因的原核重组表达质粒pET-28a( )-PGAM,在大肠杆菌系统中成功获得了表达,重组蛋白以包涵体形式存在,Western blotting显示表达产物能被日本血吸虫成虫粗抗原免疫血清所识别.SjPGAM基因及其表达产物的获得,为探索PGAM基因家族在血吸虫能量代谢过程中碳水化合物转运、新陈代谢调节和生长发育提供了重要基础.     

生物信息学预测与实验验证相结合策略筛选鉴定新的人分泌蛋白基因

使用生物信息学预测结合实验验证的策略筛选鉴定人新的分泌蛋白基因。用SignalP、SOSUI、PSORT和BLAST等程序对UniProt蛋白数据库进行生物信息学分析 ,筛选出用于实验验证的 1 4个功能未知基因。采用RT PCR方法 ,克隆得到 1 4个基因的全长编码序列 ,并构建到真核表达载体pcDNA3.1 ( - ) Myc His质粒。采用蛋白质印迹与免疫荧光分析 ,检测到其中 7个基因的表达。除其中一个在细胞核表达外 ,其余 6个只在细胞质中表达 ;其中的 4个基因的表达产物在细胞培养液中可被检测到 ,鉴定为 4个新的分泌蛋白基因。     

毕赤酵母全蛋白质组信号肽及分泌蛋白分析

信号肽是影响毕赤酵母异源蛋白分泌效率的关键因素之一。目前最常使用的信号肽是来自酿酒酵母的α交配因子(α-mating factor, MFα)的信号肽,利用这个外源信号肽已经成功分泌表达了多种异源蛋白。然而,MFα可能不适用于所有外源蛋白的分泌表达。毕赤酵母分泌蛋白中具有许多典型的信号肽序列,这些内源信号肽可以提供除MFα信号肽之外更为广泛的信号肽选择。因此,有必要分析预测所有内源信号肽引导外源蛋白分泌效果。本研究利用SignalP、TMHMM、Phobius、WoLF PSORT和NetGPI等生物信息工具对毕赤酵母GS115 (ATCC 20864)的全蛋白组进行内源蛋白信号肽及分泌特征的预测,得到了信号肽分布、长度、氨基酸比例和保守性等规律,同时筛选得到69个分泌蛋白及其信号肽,并通过分泌蛋白组验证给出了10条可能用于外源蛋白表达的内源性信号肽。本研究获得的内源性信号肽或许为毕赤酵母表达外源蛋白提供了新的有力工具。     

Garlic Compound, Diallyl Disulfide Induces Cell Cycle Arrest in Prostate Cancer Cell Line PC-3

Prostate cancer is the most predominant cancer in men and related death rate increases every year. Till date, there is no effective therapy for androgen independent prostate cancer. Previous studies reported that aged garlic extract suppresses cancer growth. In the present study, diallyl disulfide [DADS], oil soluble organosulfur compound of garlic, was studied for its antiproliferative and induction of cell cycle arrest on prostate cancer cells in vitro. The suppression of cell growth was assessed by MTT assay. Induction of cell cycle arrest was assessed and confirmed by propidium iodide staining in flowcytometric analysis and western blotting analysis of major cell cycle regulator proteins. The results showed that DADS inhibited the growth of prostate cancer cells in a dose dependent manner, compared to the control. At 25 μM and 40 μM concentrations, DADS induced cell cycle arrest at G2/M transition in PC-3 cells. Western blotting analysis of cyclin A, B₁ and cyclin dependent kinase 1 [CDK1] revealed that DADS inhibited the cell cycle by downregulating CDK1 expression. It is concluded that DADS, inhibits proliferation of prostate cancer cells through cell cycle arrest. Dose dependent effect of DADS on PC-3 cell line was observed in the present study.     

敲低前列腺癌相关基因PC-1的表达抑制前列腺癌细胞C4-2雄激素非依赖性生长

目的:研究敲低癌基因D52家族成员PC-1的表达对前列腺癌细胞雄激素非依赖性生长的影响。方法:利用RNA干扰技术构建PC-1稳定低表达的C4-2细胞株;利用四唑盐(MTT)比色实验检测敲低PC-1基因表达对C4-2细胞雄激素非依赖生长的影响。结果:敲低PC-1表达抑制前列腺癌C4-2细胞的生长,并降低了C4-2细胞雄激素非依赖性生长的能力。结论:PC-1基因参与了前列腺癌向雄激素非依赖阶段发展和维持的过程,为进一步研究PC-1在促进前列腺癌细胞发生发展过程中的作用奠定了基础。     

Tumor Necrosis Factor-related Apoptosis-inducing Ligand (TRAIL)-Troglitazone-induced Apoptosis in Prostate Cancer Cells Involve AMP-activated Protein Kinase

Prostate cancer (PCa) is one of the most frequently diagnosed cancers in men with limited treatment options for the hormone-resistant forms. Development of novel therapeutic options is critically needed to target advanced forms. Here we demonstrate that combinatorial treatment with the thiazolidinedione troglitazone (TZD) and TNF-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL) can induce significant apoptosis in various PCa cells independent of androgen receptor status. Because TZD is known to activate AMP-activated protein kinase (AMPK), we determined whether AMPK is a molecular target mediating this apoptotic cascade by utilizing PCa cell lines stably overexpressing AMPKα1 dominant negative (C4-2-DN) or empty vector (C4-2-EV). Our results indicated a significantly higher degree of apoptosis with TRAIL-TZD combination in C4-2-EV cells compared with C4-2-DN cells. Similarly, results from a 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide assay showed a larger reduction of viability of C4-2-EV cells compared with C4-2-DN cells when treated with TRAIL-TZD, thus suggesting that C4-2-DN cells were more apoptosis-resistant. Additionally, siRNA-mediated knockdown of endogenous AMPKα1 expression showed a reduction of TRAIL-TZD-induced apoptosis, further confirming the participation of AMPK in mediating this apoptosis. Apoptosis induction by this combinatorial treatment was also associated with a cleavage of β-catenin that was inhibited in both C4-2-DN cells and those cells in which AMPKα1 was knocked down. In addition, time course studies showed an increase in pACC^S79 (AMPK target) levels coinciding with the time of apoptosis. These studies indicate the involvement of AMPK in TRAIL-TZD-mediated apoptosis and β-catenin cleavage and suggest the possibility of utilizing AMPK as a therapeutic target in apoptosis-resistant prostate cancer.     

癌细胞膜流动性与蛋白激酶C相关性的初步探讨

细胞膜流动性是细胞的重要物理性质,与细胞功能密切相关。为深入认识细胞膜与细胞功能的关系,研究癌症机理及寻找预防治疗的方法提供新的视角和实验数据,采用荧光漂白后恢复技术检测皮肤癌A431细胞和正常HACAT细胞的膜流动性,同时测定蛋白激酶C的活性及mRNA的表达。通过激光扫描共聚焦显微镜的荧光恢复曲线计算得知A431细胞的荧光恢复率和扩散系数均低于HACAT细胞,即A431细胞膜流动性低于HACAT细胞;而蛋白激酶C活性、mRNA表达量却高于正常细胞。以上差异都有统计学意义（P〈0．05）。由此推断癌细胞膜流动性与蛋白激酶C相互作用、相互影响,彼此之间存在密切的关系。     

SIK1作为miR-93新的靶基因抑制前列腺癌细胞增殖、侵袭和迁移

该文探讨了SIK1作为miR-93新的靶基因对前列腺癌细胞增殖、侵袭和迁移的抑制作用.采用重组质粒pcDNA3.1-SIK1上调前列腺癌细胞中SIK1的表达后,利用CCK8和克隆形成实验检测细胞增殖;利用细胞划痕和Transwell实验检测细胞侵袭和迁移;利用West-ern blot检测E-cadherin和Vime...     

雄激素非依赖性前列腺癌细胞雄激素受体靶基因的筛选与初步鉴定

采用染色质免疫共沉淀技术在全基因组水平筛选雄激素非依赖性前列腺癌细胞LNCaP-AI的雄激素受体结合位点,行高通量测序及生物信息学分析共得到2 876个peak（pvalue〈1×10–5）,peak平均长度为673 bp;将peak序列定位到Hg19基因组,共有1 865个靶基因,其中fold enrichment≥10的基因有425个。对peak相关基因进行GO分析发现,与细胞、细胞组分、细胞过程、结合、细胞器相关的基因位列前五位;对peak相关基因进行通路分析发现,与黏着斑、代谢通路、癌症中的转录错误调控、嘌呤代谢等信号通路相关的基因占大多数。筛选出7个候选AR靶基因,采用Real-time qPCR技术分析它们在LNCaP-AI细胞和雄激素依赖性前列腺癌细胞LNCaP中对DTH刺激的反应性,发现DHT刺激可改变7个候选AR靶基因在LNCaP-AI细胞中的表达,为进一步研究雄激素依赖性前列腺癌向非依赖性前列腺癌发展的过程中雄激素受体及其调控的下游靶基因功能起着至关重要的作用。     

The Role of the Pleckstrin Homology Domain-containing Protein CKIP-1 in Activation of p21-activated Kinase 1 (PAK1)

Upon growth factor stimulation, PAK1 is recruited to the plasma membrane and activated by a mechanism that requires its phosphorylation at Ser-223 by the protein kinase CK2. However, the upstream signaling molecules that regulate this phosphorylation event are not clearly defined. Here, we demonstrate a major role of the CK2α-interacting protein CKIP-1 in activation of PAK1. CK2α, CKIP-1, and PAK1 are translocated to membrane ruffles in response to the epidermal growth factor (EGF), where CKIP-1 mediates the interaction between CK2α and PAK1 in a PI3K-dependent manner. Consistently, PAK1 mediates phosphorylation and modulation of the activity of p41-Arc, one of its plasma membrane substrate, in a fashion that requires PI3K and CKIP-1. Moreover, CKIP-1 knockdown or PI3K inhibition suppresses PAK1-mediated cell migration and invasion, demonstrating the physiological significance of the PI3K-CKIP-1-CK2-PAK1 signaling pathway. Taken together, these findings identify a novel mechanism for the activation of PAK1 at the plasma membrane, which is critical for cell migration and invasion.     

miR-125b在前列腺癌1E8细胞运动转移中的作用及其分子机制的初步探讨

目的 研究 miR-125b在前列腺癌高低转移潜能细胞中的表达差异及其对高转移细胞株1E8细胞的运动转移中的作用和可能的分子机制.方法 realtime PCR法检测前列腺癌高低转移潜能配对细胞系中 miR-125b的表达差异.通过划痕实验及transwell实验观察1E8细胞及转染 miR-125b 抑制剂及其阴性对照后该细胞运动转移能力的变化.结果 realtime PCR结果显示高转移潜能1E8细胞中miR-125b表达水明显高于低转移潜能2B4细胞;下调miR-125b会减弱1E8细胞的运动转移能力.结论 miR-125b可促进前列腺癌细胞的运动转移能力.