真菌漆酶性质、分子生物学及其应用研究进展

漆酶是一种含铜的多酚氧化酶。目前发现多种生物能够产生漆酶,包括植物、真菌、昆虫和细菌等,其中,以真菌中的白腐真菌研究最多。由于漆酶在生物漂白、农作物秸秆利用以及环境污染处理等方面具有广阔的应用前景,漆酶研究受到越来越多的关注。同时,随着分子生物学技术的发展,漆酶研究已经深入到基因水平,多种漆酶基因已经成功获得克隆,一些漆酶基因也实现了异源表达。现针对真菌漆酶的生物学性质、分子生物学及其应用的研究进展进行了概括总结,并对其前景进行了展望。     

灵芝(Ganoderma lucidum)漆酶基因的克隆及其序列分析

漆酶(laccase EC1·10·3·2)是一种含Cu的多酚氧化酶,自从1883年日本学者吉田首次从漆树汁液中发现以来,漆酶特别是真菌漆酶一直是生物学、化学和环境科学等领域十分活跃的研究热点,在纸浆的生物漂白[1,2],有毒污染物的降解[3~5]等方面有较大的应用价值.根据其来源主要分为漆树漆酶和真菌漆酶两大类,由一个结构相似的基因家族所编码,目前,至少有40个以上的真菌漆酶基因被克隆和测序[6~9],最近也有从细菌中克隆到漆酶基因的报道[10~12].我国幅员辽阔,具有十分丰富的真菌资源,但是我国对漆酶的研究与发达国家相比还十分落后,对于漆酶基因资…     

多环芳烃的真菌漆酶转化及污染土壤修复技术

漆酶可以转化多种有机污染物,在环境保护领域具有广泛的应用潜力。二十年来,通过多学科协同研究,对真菌漆酶转化多环芳烃的机制、特征等各方面的认识不断深入。基于漆酶等真菌木质素分解酶的污染土壤修复技术不断发展,并逐渐走向田间应用。本文首先介绍了真菌漆酶的一般作用机制与多环芳烃转化特征,结合我们的相关研究提出了漆酶作用下多环芳烃在土壤中的迁移模式;其次介绍了利用漆酶氧化原理修复污染农田土壤的潜力,着重对利用农业废弃物进行真菌生物刺激的修复实践进行了评述;最后,就漆酶转化多环芳烃基础研究中的若干重要问题进行了思考,并展望了真菌及其漆酶系统在污染土壤修复应用中的发展方向。     

影响真菌漆酶表达及其活性的因素

丝状真菌同一菌株中存在动力学、理化特性各异的多个漆酶同工酶。金属离子,碳、氮等培养基成分,培养条件,以及异生物质、热休克处理和共培养的菌株等多种生物和非生物的因素对真菌漆酶同工酶表现出选择性诱导效应。影响真菌漆酶表达及其调控因素的研究能指导漆酶的选择性合成,以满足不同的应用需求。主要阐述影响真菌漆酶表达及其活性的因素的相关研究进展。     

漆酶及其应用的研究进展

漆酶是一种含铜的多酚氧化酶,白腐真菌普遍能分泌该酶.有氧条件下,漆酶能催化多种高分子化合物降解,利用该性质漆酶已经广泛应用于生物制浆、污染物生物降解、生物漂白等领域.介绍了目前漆酶在农业和工业各个领域中的应用.     

真菌漆酶及其应用

漆酶是一种含铜多酚氧化酶,在白腐菌中普遍存在,少数低等真菌和植物中也产生,多为分泌型糖蛋白。至少20种漆酶得到了分离和纯化。该酶是一种氨基酸残基在500个左右的单体酶,一般都为酸性蛋白,含有4个铜离子,形成3个活性区域;表面一些氨基酸被不同程度地糖基化。晶体结构和其它一些波谱学研究解释了其空间结构和可能的电子传递机制。运用PCR技术和cDNA文库技术,越来越多的漆酶基因被克隆,许多来源的基因都是以家族形式存在于染色体上的。已研究的漆酶基因中都含有10个左右的内含子,这些内含子在活性域位置上有比较高的保守性。一些特殊序列的存在与否决定了该酶的表达形式-诱导型或组成型,诱导型菌株的调控序列中含有一段受酚类化合物作用的序列,而不含有该序列的酶基因则都是组成型表达的。漆酶在S.cerevisiae、Trichodermareesei、A.oryzaeTATAamylase和Pichiapasti等异源表达系统中有成功表达的报道。漆酶的应用集中在以下几方面:漆酶参与的有机合成;生物检测;有毒化合物的消除;工业废水处理;纸浆的生物漂白;等等。     

真菌漆酶的酶活测定方法评价

目前真菌漆酶酶活的测定方法多样,没有统一的标准,致使不同研究之间的漆酶酶活无法进行比较分析,也造成漆酶产品在酶活质量意义上的混乱。因此,对测定真菌漆酶酶活的各种不同的分光光度法进行了综述和比较分析,认为采用ABTS法作为测定漆酶酶活的方法较具合理性和科学性,建议作为漆酶酶活测定的统一方法。     

毛木耳漆酶基因的克隆、序列分析及其鉴定

本文利用PCR和RACE技术首次从毛木耳AP4菌株中获得编码漆酶基因的cDNA及其基因组全长序列,基因组大小为2514 bp.通过比较该漆酶基因的cDNA和基因组DNA的全长序列,发现该基因包含14个外显子和13个内含子.cDNA序列的全长为1972 bp,其包含一个完整的ORE长度为1860 bp,编码619氨基酸,推测的分子量大小为68 kD,等电点pI为5.15.在氨基酸序列的氨基末端存在一个信号肽序列,同时该基因还包括含铜氧化酶的三个功能结构域KOG1263、SufI和pfam00394.氨基酸序列与GenBank中登录的真菌漆酶蛋白序列比对表明:该氨基酸序列与其它真菌漆酶蛋白序列有较高的同源性,氨基酸序列相同性最高达41%,相似性为58%,并且含有真菌漆酶的四个保守的Cu-bind结构域.将获得的漆酶基因lacl与毕赤酵母表达载体pPIC9K连接,构建重组质粒pYH3660,将其转化到毕赤酵母中,经甲醇诱导该基因在第10天产酶高达123 IU/L,并通过Native SDS-PAGE电泳获得预期大小的漆酶蛋白条带.结构分析和功能验证均表明:本研究获得的基因lacl为漆酶基因.     

真菌漆酶及其应用

漆酶是一种含铜多酚氧化酶,在白腐菌中普遍存在,少数低等真菌和植物中也产生,多为分泌型糖蛋白,至少20种漆酶得到了分离和纯化。该酶是一种氨基酸残基在500个左右的单体酶,一般都为酸性蛋白,含有4个铜离子,形成3个活性区域。表面一些氨基酸被不同程度地糖基化,晶体结构和其它一些波谱学研究解释了其空间结构和可能的电子传递机制,运用PCR技术和cDNA文库技术,越来越多的漆酶基因被克隆,许多来源的基因都是以家族形式存在于染色体上的。已研究的漆酶基因中都含有10个左右的内含子,这些内含子在活性域位置上有比较高的保守性。一些特殊序列的存在与否决定了该酶的表达形式－诱导型或组成型,诱导型菌株的调控序列中含有一段受酚类化合物作用的序列,而不含有该序列的酶基因则都是组成型表达的。漆酶在S.cervisiae,Trichnoderma reesei,A.oryzae TATA amylase和Pichia pasti等异源表达系统中有成功表达的报道。漆酶的应用集中在在以下几方面：漆酶参与的有机合成,生物检测,有毒化合物的消除。工业废水处理,纸浆的生物漂白;等等。     

漆酶可降解底物种类的研究进展

漆酶是一种含铜离子的多酚氧化酶,广泛存在于植物及真菌中。漆酶含特有的铜离子,其功能为传递结构中的电子,使漆酶具有了较强的氧化还原能力,能与木质素、胺类化合物、芳香化合物等底物发生作用,且大多数反应的唯一产物为水。目前,漆酶在降解多种有毒物质和有害污染物方面表现出高效、成本较低的特性,如白腐真菌所产的高水平漆酶已广泛成熟应用在工业废水处理等生物整治和修复领域。近年来最新研究利用载体固定化酶的技术使漆酶能够在使用后回收反复利用且更具有稳定性,这降低成本的同时还保持了漆酶催化氧化的特性,克服了不少漆酶在解决环境污染中出现的问题。利用介体的介导作用解决了漆酶氧化还原电势较低的问题,大量增多了可降解底物的种类,使其在废水处理、污染物降解、土壤修复、工业染料漂白等领域的应用前景更广阔。对现有漆酶应用于各领域进行研究总结,综述了降解各领域中的有害污染物等底物种类,提出了利用漆酶的降解过程中的现有不足和改进方向,以期为生物法降解环境污染物的研究提供参考。     

真菌漆酶的性质、生产及应用研究进展

作为一种含铜的多酚氧化酶,真菌漆酶比细菌漆酶、植物漆酶等具有更好的热稳定性、金属离子耐受性及更高的底物催化氧化性,在工农业及环境领域的应用中得到了较高的关注。目前普遍认为,限制漆酶广泛应用的因素在于漆酶的生产规模、成本与性质。真菌漆酶的生产模式包括固态发酵和液体发酵,工业生产基本以液体发酵为主。除了在染料脱色、染织废水处理、纸浆漂白等过程中的应用,最新的研究不断拓展了漆酶新的用途,对近年来真菌漆酶的发酵生产、酶学性质及应用研究中的最新结果进行了概述。     

真菌漆酶在绿色化学中的研究进展

漆酶主要是由真菌分泌的一类胞外多铜氧化酶,因其具备多功能特性而被广泛地应用于绿色环境化学。漆酶能够以分子氧作为电子接受体,催化氧化多种酚类和非酚类底物形成自由基中间体,随后这些自由基中间体涉及到氧化耦合或键断裂,最终导致底物发生氧化、分解或聚合反应。目前,主要采用包埋、吸附、共价绑定和交联结合等方法制备固定化漆酶,以增强漆酶在实际环境中的催化活性、稳定性和循环再利用功效。概述了真菌漆酶的分子组成、结构特性及其催化氧化不同底物的作用机理,系统地比较了漆酶的固定化技术及其利弊,重点阐述了漆酶在有机污染物去除、合成染料脱色、造纸废水、食品加工、生物传感器和环境质量指示器等领域的研究进展,旨在为拓展和开发真菌漆酶在绿色环境化学中的多功能应用提供新的理论依据和指导思想。     

转几丁质酶基因研究进展

几丁质酶基因是近年来作物抗病基因工程研究的热点之一。已对10多种作物进行了转几丁质酶基因研究,大多数转基因作物能增强作物对真菌或昆虫的抗性,转几丁质酶基因于生防因子的研究也越来越多,为生物防治提供了一条新途径。     

白蚁及共生微生物木质纤维素水解酶的种类

白蚁是热带生态系统重要的木质纤维素降解者。白蚁种类丰富,可分成高等白蚁和低等白蚁,食性也具有各自特点。白蚁自身可以产生纤维素酶,主要是GHF9的内切葡聚糖酶(EG),也有β-葡萄糖苷酶(GB)。低等白蚁共生的原虫中已发现丰富的纤维素酶基因,属于GHF5,7和45。同时还有其他相关功能基因,如木聚糖酶和果胶类物质水解酶。高等白蚁肠道中没有共生原虫。高等培菌白蚁可以利用共生蚁巢伞属真菌促进木质纤维素降解,真菌可以产生纤维素酶,果胶质水解酶类、木聚糖酶,同时还产生可能与木质素分解相关的一种漆酶,但是从分子水平,关于共生真菌纤维素水解酶的研究还较少。白蚁肠道已分离出许多具有木质纤维素降解能力的菌株,最近的研究也发现了大量细菌纤维素酶基因。白蚁-共生系统丰富的木质纤维素水解酶类为发展生物方法开发纤维素乙醇这一思路提供有价值的资源。     

灰树花漆酶酶学性质的初步研究

漆酶是一种具有广泛应用前景的多功能酶,但能否大规模工业化生产成了制约其应用开发的主要瓶颈之一。担子菌类真菌是分泌漆酶的主要来源之一,灰树花隶属于担子菌,但有关其分泌漆酶的研究鲜有报道。本文初步探讨了pH值、温度及不同阴、阳离子等因素对灰树花孢外漆酶酶学特性的影响,结果表明灰树花孢外漆酶最适反应pH值为2.2,最适反应温度65℃,且反应体系中缓冲液的组成也会影响灰树花漆酶的活性。灰树花漆酶具有较强的热稳定性,但反应体系中若存在卤族离子则会强烈抑制灰树花漆酶的活性。本研究为今后开发利用灰树花漆酶提供了借鉴。     

粗毛栓菌诱变菌株SAH-12漆酶基因的克隆与序列分析

粗毛栓菌Trametes gallica诱变菌株SAH-12是通过紫外诱变选育得到的漆酶高产菌株。为了对其漆酶基因进行研究和利用,采用cDNA末端快速扩增(Rapid Amplification of cDNA Ends,RACE)技术,从T.gallica诱变菌株SAH-12分离得到漆酶基因全长cDNA Lacc1(GenBank accession No.DQ431716)及其对应的结构基因Lac1(DQ431715)。该基因属于真菌漆酶基因家族,与来自出发菌T.gallica漆酶基因lacA(AY875867)在成熟肽编码区的同源性最高(一致性为98%)。Lacc1全长1891bp,由40bp的5'-UTR、1554bp的完整ORF和297bp的3'-UTR构成,具有polyA加尾信号AATACA和59bp的polyA结构;其完整ORF可编码21个氨基酸残基组成的信号肽和496个氨基酸残基组成的成熟蛋白。在Lacc1基因的推导氨基酸序列中有4个潜在的N-糖基化位点和4个参与二硫键形成的Cys残基,且含有真菌漆酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型铜离子结合区的4个高度保守序列。结构基因Lac1全长2338bp,含10个内含子和11个外显子,各内含子长度在51bp～76bp之间,且其序列均符合5'-gt……ag-3'规则。     

β-胡萝卜素对阿魏蘑漆酶基因表达及其相关蛋白的影响

前期研究发现β-胡萝卜素为阿魏蘑和胶红酵母共培养过程中提高漆酶活性的关键因子。为了探究共培养过程中β-胡萝卜素的作用机制,本论文扩增并分析了漆酶编码序列及其上游调控序列,通过qRT-PCR、双向电泳等技术对加入β-胡萝卜素条件下漆酶基因表达及相关蛋白的变化进行了研究。扩增得了到阿魏蘑漆酶基因LAC-CDS,该基因长1 566 bp,含有最为保守的漆酶特征氨基酸序列-L3;漆酶上游序列中存在若干个潜在的XRE、STRE等与胁迫响应相关的元件,它们可能对漆酶的转录进行了调控;β-胡萝卜素加入后,漆酶基因转录表达量在发酵第5 d达到最高,为对照的6倍;双向电泳得到阿魏蘑胞内9个差异蛋白点,它们大多与蛋白质合成以及生物体能量代谢有关。实验结果表明β-胡萝卜素诱导了漆酶基因的高水平转录,并影响胞内多种蛋白的合成,这为进一步提高漆酶的发酵水平提供了理论依据。     

真核生物来源漆酶的异源表达研究进展

漆酶属于多铜氧化酶家族中的一种,广泛存在于昆虫、植物、真菌和细菌中。由于其作用的底物范围较广,因此在纺织、制浆、食品以及木质素的降解等方面有广阔的应用前景。但是自然界中的漆酶存在表达量和酶活低、高温易失活等问题,限制了它的应用。对漆酶进行大量高效的异源表达,是解决这一问题的有效途径。近年来,越来越多不同来源的漆酶基因被克隆,并在不同宿主中异源表达。但这些大多局限于实验室研究,还未达到工业化生产的水平。笔者对真核生物来源漆酶的异源表达研究进展进行综述,重点介绍了真核生物来源的漆酶在不同表达系统中的异源表达情况以及在酵母细胞中表达漆酶时提高表达量和酶活性能的方法,以期为研究者们提供参考。     

真菌漆酶及其介体系统：来源、机理与应用

漆酶是一类含铜氧化酶,广泛分布于植物、真菌、细菌、昆虫中,它们能够高效催化芳香族和非芳香族化合物氧化降解,并最终将分子氧还原为水作为副产物。一些小分子介体能够进一步提高漆酶的降解底物范围、催化效率和稳定性。它们与漆酶构成漆酶/介体系统（laccase mediator systems, LMS）,能够更有效地降解非酚类、多环芳烃类等难降解化合物,在造纸制浆与漂白、染料脱色、环境脱毒等领域有着巨大的应用前景,成为近年来的研究热点之一。对漆酶的来源与功能、真菌漆酶结构与反应机理、介体类型与作用机理、LMS的应用进行了综述,以期为漆酶的应用研究提供参考。     

环状芽孢杆菌几丁质酶基因序列分析、表达和生物活性测定

真菌病害一直是影响作物的主要病害之一 ,每年造成巨大经济损失。几丁质酶可水解许多病原真菌细胞壁所含有的主要成分—几丁质 ,是研究得最多的抗真菌蛋白质。许多几丁质酶基因已从微生物中克隆到 ,芽孢杆菌是一类重要的几丁质酶产生菌。环状芽孢杆菌可产生并分泌多种多糖降解酶类 ,包括几丁质酶、β 1 ,3 葡聚糖酶、β 1 ,6葡聚糖酶和半纤维素酶[1] 。Ｗａｔａｎａｂｅ克隆了环状芽孢杆菌ＷＬ 1 2菌株的几丁质酶基因ｃｈｉＡ和ｃｈｉＤ ,对该几丁质酶基因的结构和功能进行了深入研究[2～ 4 ] 。我国的陈三凤克隆了黄杆菌的几丁质酶基因 ,…