从构建的噬菌体抗体库中筛选抗甲肝人单抗

用固相化甲肝抗原,对所构建的噬菌体抗体库进行了3轮淘筛。第3轮淘筛后洗脱下来的噬菌体,较第l轮增加了近100倍。含有抗体重链基因和轻链基因的重组克隆．也由淘筛前的25％增至100％。说明甲肝抗原对抗体库的淘筛,富集了表面呈现甲肝人单抗的噬菌体。经夹心ELISA法筛选到抗甲肝病毒噬菌体抗体,并以竞争抑制实验进一步证实了这些抗体的特异性。     

抗CD133纳米抗体的分离与鉴定

[目的]获得骆驼来源的与人CD133抗原特异性结合的纳米抗体。[方法]从3峰新疆双峰驼外周血中分离淋巴细胞,采用巢式PCR扩增获得cDNA并构建VHH天然噬菌体展示文库。包被CD133-606于ELISA板,对天然文库进行3轮亲和筛选,菌落PCR和基因测序确定能结合CD133的候选克隆。挑选重复序列VHH克隆构建到pET28a并转BL21用IPTG诱导表达。IMAC方法纯化重组VHH抗体蛋白,Western Blot和ELISA检测与CD133的抗原结合性。[结果]从109淋巴细胞中构建了库容为1.4×109cfu的噬菌体展示文库,Western Blot及ELISA结果显示重复4次核苷酸序列的VHH-13的纳米抗体能与CD133-606有较好的结合活性。[结论]通过对VHH天然展示文库的亲和筛选及鉴定,成功获得了能与人重组CD133胞外区特异结合的纳米抗体。     

抗GM-CSF纳米抗体的筛选与鉴定

目的:制备抗粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)纳米抗体,并测定其亲和力。方法:分离提取GM-CSF免疫后羊驼外周血淋巴细胞总RNA,PCR扩增得到纳米抗体基因片段,与载体pHEN1重组后克隆至大肠杆菌TG1以构建初始文库,经拯救构建得到噬菌体展示纳米抗体文库,并对其进行生物淘选;通过大肠杆菌BL21(DE3)原核表达阳性纳米抗体克隆,并测定其亲和力。结果:构建了多样性良好且库容量为1.37×10~9cfu的纳米抗体初始文库,3轮淘选后共筛选得到5株氨基酸序列差异性较大的纳米抗体,并对其中一株纳米抗体G1进行表达纯化,SDS-PAGE分析表明纳米抗体G1纯度较高,且有较高的亲和力(K_D=2.95×10~(-8)mol/L)。结论:制备了高亲和力的抗GM-CSF纳米抗体,可应用于相关炎症抗体药物研制和疾病监测等方面。     

人源天然ScFv噬菌体抗体库的构建及鉴定

噬菌体抗体库技术是获得治疗性抗体的一条重要途径。以20份健康人外周血为样本,通过提取淋巴细胞、逆转录－PCR（RT PCR）、抗体可变区基因的扩增、重叠PCR获得单链抗体（ScFv）基因,将ScFv克隆入噬粒载体,通过近300次的电转化获得了库容量为1.3×109的全人源天然ScFv噬菌体抗体库。通过随机挑克隆测序和用5种不同抗原筛选对抗体库进行了初步验证。随机测序表明抗体库具有较好的多样性,用5种不同抗原对其进行筛选,均获得了特异性噬菌体抗体的不同富集,表明成功构建了一个多样性良好的人源天然ScFv噬菌体抗体库。     

纳米抗体筛选技术研究进展

纳米抗体(nanobody, Nb)是在骆驼科血清中发现的一种新型抗体,具有体积小、特异性强、稳定性高、易于表达和能识别隐藏的抗原表位等优势,在各个领域具有广泛的应用价值。本文介绍了纳米抗体筛选与优化过程,包括纳米抗体文库构建、体外展示和亲和力成熟3个重要技术阶段的分类与特点。其中,简要描述了天然、免疫及半合成/合成文库的制备方法与重要参数,并系统介绍了应用噬菌体、酵母、细菌、核糖体/mRNA和真核细胞等表面展示系统,以及酵母双杂交、高通量测序和质谱鉴定方法,共8种不同体外展示技术进行快速筛选的方法及其优缺点,汇总用于提升纳米抗体功能可靠性的体外及计算机辅助亲和力成熟技术平台,为综合运用各种技术手段快速获得稳定、可靠、特异的纳米抗体类药物或诊断制剂提供了参考。     

纳米抗体技术及其在疾病诊断和治疗中的应用

单克隆抗体具有特异性结合抗原的能力,已被广泛应用于疾病诊断及治疗领域.但因单克隆抗体的组织渗透能力较差、体内的保留时间较长以及制备过程繁琐,从而限制了其在临床中的应用.自1993年首次报道在骆驼体内天然存在的单链抗体(HCAb)以来,由于其可变区间VHH(纳米抗体)具有体积小、溶解度高、特异性强以及可在细菌中大量表达等优点,较之传统单克隆抗体,VHH在疾病的诊断治疗及药物开发等医学领域具有更广阔的应用前景.本文综述了:纳米抗体的骨架区及互补决定区与传统抗体重链相应区间的结构比较;纳米抗体库的构建以及运用噬菌体展示技术对VHH库的筛选;纳米抗体技术在疾病诊断中的应用及其用于分子显像的优势,以及纳米抗体作为抗肿瘤免疫偶联物的靶向组分在癌症治疗领域中的最新进展.     

噬菌体抗体库淘筛方法的比较研究

目的:比较噬菌体抗体库的淘筛方法,从而为得到亲和力高、特异性强的抗体克隆打下基础.方法:在包被好抗原的2个细胞培养瓶中加入噬菌体抗体库,一个采用先直接加入宿主菌感染后,再将培养瓶内残留结合物洗脱中和后感染的方法,另一个则采用先洗脱并中和的噬菌体感染宿主菌,与抗原结合的剩余的噬菌体再行直接感染,将2种方法所得到的感染菌和援救所得的噬菌体进行CFU和PFU测定.结果:从实验的数据中可以发现,采用第一种方法所得次级库的容量要大于后一种方法所得的初级库.结论:噬菌体抗体库的淘筛方法必须按照实验的具体情况进行选择,如果要求严谨度适中,则可以采用直接感染的方法淘筛.     

天然兔源噬菌体单链抗体库的构建与鉴定

目的:构建天然兔源噬菌体单链抗体库。方法:采用RT-PCR法从未免疫的兔子脾脏中克隆得到抗体重链可变区(VH)与轻链可变区(VL)基因,重叠PCR将VH和VL拼接成scFv片段,将scFv连接到噬菌粒pComb3XSS上,电转入XL1-Blue菌中,得到单链抗体库,并用此抗体库筛选抗肌酸激酶抗体。结果:构建了容量为4×108,基因重组率95%的单链抗体库,DNA指纹图谱显示抗体库多样性良好。以肌酸激酶为抗原,从该库中筛到3株抗肌酸激酶的抗体。结论:分析表明构建的天然兔源单链抗体库质量良好,可用于快速筛选、制备多种单链抗体。     

从噬菌体表面展示肽库中筛选衣原体单克隆抗体识别的抗原表位

利用抗体捕获法,经三轮淘洗,从表面展示随机肽序列的噬菌体文库中筛选到与衣原体单克隆抗体C17特异结合的噬菌体克隆,其一致序列为：（L／I）PGGS（P／W）,竞争抑制实验表明含特异序列的克隆能与天然抗原竞争。据此,我们认为此序列为衣原体的B细胞抗原表位。     

利用重组系统构建大容量噬菌体抗体库

噬菌体抗体库技术是获得人源抗体的重要方法,此文探讨大容量天然噬菌体抗体库在筛选人源抗体中的实际应用价值。从正常人外周血分离淋巴细胞,通过基因工程方法获得抗体基因并且构建到含有重组位点的载体pDF中获得初级噬菌体抗体库,初级库在重组系统中重组之后获得了容量为9×1010的天然Fab噬菌体抗体库,通过序列测定和重组蛋白筛选来对抗体库的质量进行初步鉴定。对随机挑取的96个克隆测序序列分析表明各种型别比例基本合适;用四种抗原筛选有明显的富集,并且获得了针对其中一种抗原的阳性抗体克隆。     

Generation and Characterization of a Nanobody Against SARS-CoV

Virologica Sinica - The sudden emergence of severe acute respiratory syndrome coronavirus (SARS-CoV) has caused global panic in 2003, and the risk of SARS-CoV outbreak still exists. However, no...     

双特异性纳米抗体的研究进展及其应用

从纳米抗体的研究进展,双特异性纳米抗体在感染类疾病、肿瘤以及免疫系统疾病治疗领域的研究成果、研究热点及发展前景等方面综述了双特异性纳米抗体的研究进展并分析了未来可能的发展方向.首先比较了纳米抗体与全长单克隆抗体之间的差异并阐述了双特异性纳米抗体具备的独特优势;继而概括了双特异性纳米抗体的发展历程,并对新冠病毒的中和性抗...     

Nanobody stabilization of G protein-coupled receptor conformational states

Remarkable progress has been made in the field of G protein-coupled receptor (GPCR) structural biology during the past four years. Several obstacles to generating diffraction quality crystals of GPCRs have been overcome by combining innovative methods ranging from protein engineering to lipid-based screens and microdiffraction technology. The initial GPCR structures represent energetically stable inactive-state conformations. However, GPCRs signal through different G protein isoforms or G protein-independent effectors upon ligand binding suggesting the existence of multiple ligand-specific active states. These active-state conformations are unstable in the absence of specific cytosolic signaling partners representing new challenges for structural biology. Camelid single chain antibody fragments (nanobodies) show promise for stabilizing active GPCR conformations and as chaperones for crystallogenesis.     

Immunodetection of the recombinant GroEL by the Nanobody NbBruc02

Brucella has a great impact on health and economy in Syria, thus much effort is being placed on the development of diagnostics and vaccines. In this context, a wide Nanobody "immune" library was previously established, from which several Brucella-specific binders were isolated. One of these camel genetically engineered heavy-chain antibody fragments was referred to as NbBruc02. The precise antigen of NbBruc02 was presumed to be, according to proteomic approaches, the Brucella heat shock protein of 60?kDa (HSP-60). HSP-60, or alternatively named GroEL, is an interesting Brucella immunodominant antigen with important roles in the parasite life cycle, mainly adhesion and penetration during the infection of macrophages. In the present work, the capacity of NbBruc02 to filtrate the native GroEL from Brucella total extract was tested by immunochromatography approach. The interaction between NbBruc02 and its antigen was further confirmed using recombinant GroEL from Brucella. Interestingly, NbBruc02 was able to immunodetect the native as well as the denatured forms of the rGroEL in ELISA and immunoblotting, respectively. In agreement with previously reported data, NbBruc02 was able only to detect the denatured Yersinia rGroEL. Using surface plasmon resonance (SPR) biosensor, NbBruc02 showed a strong interaction, with nanomolar affinity (K (D)?=?~10(-8)?M), with the native rGroEL of Brucella and not of Yersinia. Because the casual conformational changes in the GroEL 3D structure make the base of its function, NbBruc02 by its ability to recognize a "conformational epitope," could open wide perspectives to study the role of GroEL in Brucella physiology.     

纳米抗体的稳定性及其结构基础研究进展

驼类纳米抗体结构简单、易于改造,且具有低免疫原性、高稳定性、高特异性、高亲和力等特点,因而具有广泛的应用前景。纳米抗体的优势之一在于其具有较高的稳定性,比常规抗体更易于储藏和运输,甚至在高温、化学和压力等极端条件下变性后仍可有效地重折叠并恢复其抗原亲和力。本文综述了纳米抗体稳定性与其结构基础方面的研究进展,阐述了纳米抗体氨基酸序列、二硫键、结构域等与其稳定性的关系,揭示了高度稳定性的纳米抗体普遍具有的结构特征。基于这些结构特征,讨论了几种纳米抗体的稳定性优化策略,包括共有序列驱动的序列修复、替换易于修饰的氨基酸、净蛋白质电荷的改变、非天然二硫键的引入以及CDR超变区的移植。预期对纳米抗体的稳定性调控提供理论指导,以拓展其作为治疗药物、诊断试剂和生物传感器等方面的应用。     

Distinctive Activation Mechanism for Angiotensin Receptor Revealed by a Synthetic Nanobody

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SARS-CoV-2中和性纳米抗体的原核表达及中和活性检测

纳米抗体(nanobody,Nb)作为目前已知的能与目标抗原结合的最小单位抗体,在生物医药、临床研究等方面具有良好的应用前景。根据大肠杆菌密码子偏好性优化合成严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severe acute respiratory syndrome-coronavirus 2,SARS-CoV-2)中和性纳米抗体H11-D4基因,将其克隆到pET28a表达载体上后,转化至大肠杆菌感受态细胞Rosetta(DE3)进行诱导表达,通过镍柱纯化、质谱分析、Western Blot鉴定H11-D4的表达情况并使用中和试验验证其中和活性。研究结果显示,纳米抗体H11-D4可成功在大肠杆菌中表达,最佳诱导条件为IPTG终浓度1.0 mmol·L^-1,37℃诱导5 h。H11-D4抗体的分子量大小约为17.9 kD,与预测值相符。经镍柱纯化后,产量为25.16 mg·L^-1。透析复性后利用TritonX-114快速有效地去除了内毒素,中和试验成功验证了H11-D4的中和活性(IC50)为171.1 nmol·L^-1,研究结果可为...