金黄色葡萄球菌肠毒素C的原核表达、纯化及活性鉴定

目的：在大肠杆菌中表达金黄色葡萄球菌肠毒素C（SEC）,并对其活性进行检测。方法：以金黄色葡萄球菌基因组为模板扩增SEC基因,经测序正确后插入原核表达载体pBV220中,转化大肠杆菌DH5α后温度热诱导重组SEC表达;表达产物经阳离子柱纯化后,用ELISA鉴定其抗原性;通过观测表达产物对鼠脾淋巴细胞的刺激增殖情况,检测其超抗原活性。结果：构建了SEC-pBV220原核表达载体,在大肠杆菌中可快速、高效表达SEC蛋白,表达产物具有超抗原活性。结论：实现了SEC的原核表达。     

金黄色葡萄球菌肠毒素研究进展

金黄色葡萄球菌肠毒素是由金黄色葡萄球菌分泌的一类胞外毒素,其中传统型为SEA-SEE,具有催吐活性。目前也发现了一些催吐活性未知的新类型肠毒素,命名为SEls。所有肠毒素的分子量都在22-28KDa之间,由单一肽链组成,其稳定性好,可耐大多数蛋白水解酶。金黄色葡萄球菌肠毒素具有较强的超抗原特性,可促使T淋巴细胞大量增殖,同时表现出对组织相容性复合物Ⅱ类分子(MHCⅡ)等位基因的不同偏爱性。超抗原的产生和调控依赖agr系统,同时也受其它因素的调控,如一些氨基酸。因此在免疫治疗中具有着重要作用。本文从性质、组成、结构、功能、检测方法等方面对金黄色葡萄球菌肠毒素进行简要介绍,为肠毒素的研究提供依据。     

金黄色葡萄球菌肠毒素 C2 的基因克隆、 表达及其生物学活性

利用 PCR 技术从金黄色葡萄球菌的基因组 DNA 中克隆 SEC2 全长基因, PCR 产物与 pGEM-T 载体连接,经测序证实后进行亚克隆,构建其表达载体 pET-28a-SEC2 ,在大肠杆菌 BL21(DE3) 中表达成熟重组蛋白 (rSEC2) , 纯化 rSEC2 蛋白并对其生物学活性进行研究 . 结果表明：成功克隆了 SEC2 全长基因,测序证实该基因共 717 bp ,编码 239 个氨基酸,与 GenBank 中收录的 SEC2 成熟蛋白质序列完全一致, SEC2 基因登录 GenBank(Accession number ： AY450554) ; 构建了 SEC2 的表达载体 pET-28a-SEC2 ,并在大肠杆菌 BL21(DE3) 中得到高效可溶性表达,可溶性的 rSEC2 经 Ni²⁺ 亲和层析纯化达到电泳纯,纯化的 rSEC2 蛋白经蛋白质印迹检测,并能有效刺激人外周血单个核细胞的增殖,被 rSEC2 刺激的外周血单个核细胞在体外对肿瘤细胞的生长有显著的抑制作用 .     

金葡菌类肠毒素K原核表达载体构建及其生物学活性分析

目的:金葡菌类肠毒素K(SElK)原核表达载体构建及其生物学活性初步分析。方法:通过常规分子生物学技术将SElK基因片段插入载体p ET-28a中,阳性单菌落扩大培养,诱导目的基因表达后通过Ni+亲和层析纯化SElK重组蛋白;小鼠脾淋巴细胞增殖实验及尾静脉注射后血常规检测SElK超抗原活性;进一步通过检测血清中谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、乳酸脱氢酶(LDH)和肌酸激酶(CK)活性及尿素(Urea)和肌酐(CR)含量来评价SElK潜在肠毒性。结果:成功构建SElK原核表达载体,并通过Ni~+亲和层析获得高纯度SElK重组蛋白(95%);随后的超抗原活性检测发现SElK能够在体外刺激小鼠脾淋巴细胞显著增殖,尾静脉注射后能够有效地刺激血液中淋巴细胞增殖;最终的肠毒性检测结果发现SElK能够显著增加血清中AST活性及Urea含量。结论:成功构建并纯化获得高纯度SElK重组蛋白,并对其超抗原活性及潜在肠毒性进行初步分析,为开发更优的抗肿瘤制剂提供备选药物。     

增强型金黄色葡萄球菌肠毒素C2突变体及其超抗原活性

金黄色葡萄球菌肠毒素C2 (Staphylococcal enterotoxin C2,SEC2)作为一种超级抗原蛋白,极微量即可有效激活机体免疫系统,这一特性可应用于对肿瘤和感染性疾病的辅助治疗.为了增强SEC2的超抗原活性,应用over-lap PCR方法将SEC2中的102～106位GKVTG氨基酸残基分别突变为WWH、WWT和WWP,获得3种突变体ST-1、ST-2和ST-3.三种突变体刺激小鼠淋巴细胞增殖活性和肿瘤细胞生长抑制活性与野生型SEC2相比均有显著提高.ST-1和ST-3的致热活性与野生型SEC2相当,而ST-2的致热活性明显高于野生型SEC2.此外,三种突变体体外刺激淋巴细胞分泌IL-2、IFN-γ和TNF-α的水平也显著提高,这可能是导致突变体具有较高肿瘤细胞生长抑制活性的原因.进一步实验发现,三种突变体刺激下,小鼠脾淋巴细胞mVβ8.2基因的转录水平较野生型SEC2显著增加,暗示突变体对TCR mVβ8.2分子亲和力的提高,可能是其超抗原活性增强的主要原因.     

金黄色葡萄球菌肠毒素B研究进展

金黄色葡萄球菌肠毒素B型(SEB)是一种典型的T细胞性超抗原,可引起T细胞多克隆活化。本文综述了金黄色葡萄球菌SEB的结构功能,生物学效应,诊断及治疗方面的研究进展,并重点介绍了金黄色葡萄球菌SEB的临床应用。     

金黄色葡萄球菌肠毒素A的基因克隆、表达及活性试验

利用PCR从金黄色葡萄球菌标准株（Staphylococcus aureus, ATCC13565）中克隆了金黄色葡萄球菌肠毒素A(SEA)的基因,序列测定结果与报道完全一致。构建了表达载体pETSEA并获得高效表达,重组蛋白（rSEA）在37℃诱导时以包涵体形式存在,降低温度则出现可溶表达,可溶性rSEA占总rSEA的55%。可溶性rSEA经Ni²⁺亲和层析纯化,达电泳纯。通过同源模建对rSEA对SEA进行结构比较,结果表明尽管rSEA比野生型SEA多了9个氨基酸但其结构并没有明显的变化。单核细胞增殖试验进一步证明了该结论：将rSEA与SEA同外周血单个核细胞共同培养,两者均能有效地促进其增殖。将rSEA与体内激活的脾细胞共培养,则能增强脾细胞的体外抑瘤活性。     

金黄色葡萄球菌肠毒素A、B、C、D、E重组载体的构建及表达

金黄色葡萄球菌肠毒素（Staphylococcal enterotoxins，SEs）是一组结构毒力相似、血清型不同的可溶性小分子蛋白质，平均分子质量为26~30 kD，是引起细菌性食物中毒及肠胃炎的主要因素之一。为了制备金黄色葡萄球菌肠毒素的纯品，首先合成了SEA、SEB、SEC、SED和SEE的基因序列，然后构建了5种肠毒素的原核表达载体，分别转入BL21（DE3）细胞中进行诱导表达。通过SDS-PAGE和Western blot验证，5种肠毒素蛋白均被成功表达，并且在较低的诱导温度（16 ℃）获得一定量的可溶性蛋白。成功制备了5种金黄色葡萄球菌肠毒素的可溶性蛋白，为今后更好地解决因SEs引起的食品安全问题奠定了基础。     

金黄色葡萄球菌肠毒素A Asp227Ala基因的克隆及表达

目的：金黄色葡萄球菌肠毒素A Asp227ala基因的克隆及表达。方法：利用错配PCR方法,从含有金黄色葡萄球菌肠毒素A（Staphylococcal enterotoxn A,SEA)基因的质粒中扩增出约720bp的DNA片段,将其克隆到表达载体7ZTS中,并转化于JM109（DE3）。结果：重组质粒的测序结果表明,它含有702bp（不包括N端72bp的信号肽编码区）,其核苷酸序列与文献报道完全一致,推导的氨基酸序列显示227位的天冬氨酸已突变为丙氨酸。结论：该基因所表达的蛋白为可溶性蛋白,表达量占总蛋白51.5%。表达的蛋白与天然肠毒素A产生的抗体能发生凝集作用,具有与天然SEA类同的抗原活性。     

IL-2与金黄色葡萄球菌肠毒素A和B融合基因的克隆及表达

目的：IL-2与金黄色葡萄球菌肠毒素A和B融合基因的克隆及表达。方法：分别在金黄色葡萄球菌肠毒素A227Ala、B基因的两端克隆上两个酶切点Hind Ⅲ,Kpn Ⅰ。将IL-2基因突变,设计一段linker使之分别与SEA227Ala和SEB相连并克隆到PET表达载体中,在大肠杆菌DH5a（DE3）-Pass中表达。结果：表达的蛋白占总蛋白15%。结论：IL-2与金黄色葡萄球菌肠毒素A和B融合蛋白能在大肠杆菌中有效表达。     

Stimulation of rat spleen cells by staphylococcal enterotoxins

Abstract There is much interest in staphylococcal enterotoxins as T cell mitogens in humans, mice and rabbits. Rat spleen cells were shown to proliferate in response to staphylococcal enterotoxins A and B and toxic shock syndrome toxin-1 at concentrations (5 to 500 ng ml⁻¹) which also stimulate mouse spleen cells. The proliferative response to all these enterotoxins was inhibitted by cyclosporin A, indicating the response to be predominantly that of T cells. These results indicate that the rat provides another convenient model for the analysis of T cell responses to enterotoxins.     

金黄色葡萄球菌LukF-PV基因的原核表达及血清特异性抗体的检测

目的:在大肠杆菌中表达金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,SA)LukF-PV基因,纯化重组蛋白并以其为抗原检测儿童SA感染者血清特异性IgG抗体,分析不同部位SA感染患者血清LukF-PV抗体水平。方法:将Luk F-PV克隆至pET-28a(+)载体,IPTG诱导重组蛋白表达、His柱纯化重组蛋白后,用间接ELISA检测儿童SA感染者与健康对照者血清特异性IgG抗体水平。结果:成功表达纯化LukF-PV蛋白,儿童SA感染组与健康对照组血清特异性抗体均值分别为(0.309±0.063)、(0.505±0.261),具有统计学意义(P0.05)。不同部位来源标本的感染者中血液组和扁桃体组抗体OD均值分别为(0.634±0.225)、(0.481±0.264)与健康对照组有显著差异(P0.05),其余各组与健康对照组无显著差异(P0.05)。抗体阳性率统计分析中血液组分别与脑脊液组、扁桃体组、咽拭子组、痰液组有统计学意义(P0.05),其余各组间均无显著差异(P0.05)。结论:LukF-PV成功表达纯化,,儿童SA感染组LukF-PV特异性IgG抗体显著高于健康对照组,其中来源于血液和扁桃体部位的SA感染者抗体水平与健康者有显著差异,尤以血液感染者最显著。     

重组B群脑膜炎球菌fHBP融合蛋白的表达和免疫原性研究

采用PCR构建编码B群脑膜炎球菌fHBP蛋白V<,1>变异型全长序列和V<,2>变异型C结构域抗原表位融合蛋白的基因片段.并克隆入pET30a<'(+)>载体,转化大肠杆菌BL21(DE3),在其实现表达,表达量约占菌体蛋白总量的30%.表达产物经离子交换层析纯化后,获得了纯度达到90%以上的融合蛋白.将融合蛋白免疫小...     

Enhanced and prolonged efficacy of superantigen-induced cytotoxic T lymphocyte activity by interleukin-2 in vivo

The bacterial superantigen, staphylococcal enterotoxin A (SEA) activates T cells with high frequency and directs them to lyse MHC-class-II-expressing cells in superantigen-dependent cell-mediated cytotoxicity (SDCC). Treatment of mice with SEA induced strong CD8⁺ T-cell(CTL)-mediated SDCC, as well as abundant cytokine production from CD4⁺ and CD8⁺ T cells. However, both cytotoxicity and cytokine release were transient. In contrast, combined treatment with SEA and recombinant interleukin-2 (rIL-2) increased peak levels and maintained CTL activity. These effects were concomitant with an increased number of SEA-reactive V11⁺ T cells. Both the CD4⁺ and CD8⁺ populations contained higher frequencies of cells expressing IL-2 receptor (IL-2R) , which suggests that continuous IL-2R signaling preserves its high expression and subsequently prevents loss of growth factor signal necessary for expansion of T cells. Although IL-2R expression was increased among both CD4⁺ and CD8⁺ cells, only the cytotoxic function of CTL, but not cytokine production from either CD4 or CD8, was augmented. These findings demonstrate that treatment with rIL-2 potentiates superantigen-induced cytotoxicity and maintains high CTL activity. rIL-2 might therefore be useful in improving superantigenbased tumor therapy.     

重组蛋白ES-Kringle5的表达、纯化及活性检测

目的：利用基因工程方法原核表达重组融合蛋白ES-Kringle5并进行纯化及活性检测。方法：ES-Kringle5是将内皮抑素N端的前27个氨基酸与Kringle5通过连接肽相连的重组融合蛋白,合成该重组蛋白的基因片段并插入载体pMD18-T中,然后克隆至大肠杆菌表达载体pET25b中并转化E.coli BL21（DE3）。乳糖诱导表达后经Ni-NTA亲和层析纯化后获得目的蛋白。通过抑制HUVEC细胞增殖实验检测其生物学活性。结果：重组质粒构建正确。利用乳糖诱导表达并降低诱导温度能增加目的蛋白的产量及可溶性表达。纯化后的重组蛋白纯度大于95%。生物学活性证明该重组蛋白具有抑制HUVEC的增殖能力。结论：具有生物学活性的重组蛋白ES-Kringle5可在大肠杆菌中高效表达,为研究其体内药效、药代及安全性评价奠定了基础。     

四环素-绿色荧光蛋白融合蛋白的构建及其活性测定

将来源于水母的绿色荧光蛋白基因 (gfp)和来源于E .coli转座子Tn10的四环素阻遏蛋白基因 (tetR)共同构建到E .coli表达载体pET_30a +上 ,获得TetRC_端与GFPN_端融合蛋白。对经诱导表达并纯化后的融合蛋白 (TR∷GFP)进行荧光发射光谱分析表明 ,该融合蛋白保留了GFP的荧光特性 ,即在 395nm激发下 ,可在 5 10nm附近有特征发射峰。在加入四环素后 ,融合蛋白在 395nm激发下 ,在400nm～700nm范围内的发射光谱发生明显变化 ,荧光强度普遍增加 ,且以 510nm处最大发射峰增幅最大 ,由原来 1132增至 2214 ,而四环素对相同浓度的GFP与TetR荧光影响不大 ,结果表明该融合蛋白 ,能感受外界四环素 ,并产生一定的荧光变化。     

sTACI-Fc-Myc重组质粒的构建、原核表达及活性鉴定

目的:构建s TACI-Fc-Myc重组质粒,并进行原核表达和纯化具有生物活性的融合蛋白。方法:通过PCR法获得s TACI-Fc-Myc重组片段,然后把融合基因片段与原核载体p ET28a连接在一起,并构建p ET28a-s TACI-Fc-Myc重组子,并转入BL21(DE3)中进行表达,用蛋白A凝胶亲和层析柱进行纯化及酶联免疫吸附剂(ELISA)法测定其生物学活性。结果:获得了s TACI-Fc-Myc重组质粒,且该质粒可以在BL21(DE3)中表达,亲和层析柱纯化后纯度可达到95%以上,与BAFF的结合活性具有剂量依赖性,浓度达到5 ng/μL时,两者的吸附达到饱和。结论:成功构建了s TACI-Fc-Myc原核表达载体,并使有生物学活性的融合蛋白在BL21(DE3)上获得了稳定表达,为进一步研究并筛选高活性BAFF拮抗肽奠定了基础。     

肠毒素C2中Met24对其超抗原活性无重要作用

目的:分析金黄色葡萄球菌肠毒素C2的T细胞受体结合区域α3结构中,第24位甲硫氨酸对其超抗原活性的影响作用.方法:应用定点突变技术对金黄色葡萄球菌肠毒素C2的Met24进行无意义突变,获得突变蛋白SEC2(M24A),对突变蛋白和野生型蛋白的体内、体外超抗原活性进行比较.结果:分别对野生型蛋白及突变蛋白的免疫刺激活性、肿瘤抑制活性、体内致热毒性进行了比较,发现突变蛋白的增值指数(PI)、抑瘤率、热源效应与野生型相比无显著差异(P＞0.05),这表明对第24位甲硫氨酸的替换没有对金黄色葡萄球菌肠毒素C2的超抗原活性造成明显影响.结论:在金黄色葡萄球菌肠毒素C2的α3结构中,Met24并不是决定其超抗原活性的重要氨基酸残基.     

26肽蜂毒素与基因变构IL-2嵌合蛋白的原核表达、纯化及活性测定

在E .coliDH5α中表达26肽蜂毒素与基因变构人白细胞介素2的嵌合体蛋白 ,并进行初步纯化和抗原性检测。利用剪接式重叠延伸 (splicedoverlapextension ,SOE)技术在26肽蜂毒素与基因变构IL-2的基因之间导入四个易形成空间结构的氨基酸残基组成的连接肽 (Gly4Ser)₃,构建嵌合体蛋白的基因,克隆到原核表达载体pGEX4T-2中,重组质粒转化宿主菌DH5α,经IPTG诱导表达目的融合蛋白,纯化蛋白经Thrombin酶切后进行SDS-PAGE与Western-blot鉴定。结果表明重组蛋白有良好的抗原性 。