促线粒体融合蛋白在线粒体融合和细胞凋亡中的作用

一直以来,线粒体动态变化都备受关注,这不仅关系到线粒体本身,也与细胞的整体状态密切相关。线粒体动态变化主要指线粒体的分裂和融合,该过程涉及一系列蛋白质。在线粒体融合中,目前研究得较深入的促线粒体融合蛋白主要有Mfn1、Mfn2和OPA1。随着研究的深入,发现这3种蛋白质不仅对于线粒体融合有重要作用,在细胞凋亡过程中也扮演着重要角色。现就Mfn1、Mfn2和OPA1的促线粒体融合作用及其与细胞凋亡的关系作详细阐述。     

线粒体分裂、融合与细胞凋亡

线粒体是高度动态变化的细胞器,其在细胞内不断分裂、融合并形成网状结构。线粒体的分裂和融合是由多种蛋白质精确调控完成的。Drp1／Dnm1p,Fis1／Fis1p,Caf4p和Mdv1p参与线粒体分裂的调控;Mfn1／2／Fzo1p控制线粒体外膜的融合,而Mgm1p／OPA1则参与线粒体内膜的融合。在细胞凋亡过程中线粒体片段化,网状结构被破坏,线粒体嵴发生重构,抑制这一过程可以部分抑制细胞色素c的释放和细胞凋亡。线粒体形态对于细胞维持正常生理代谢和机体发育起着重要的作用,一旦出现障碍会导致严重的疾病。     

大蒜素诱导结肠癌HT-29细胞凋亡

本实验的目的是观察大蒜素(allicin)对人结肠癌HT-29细胞凋亡和增殖的影响,并对其作用机制做初步的探讨。通过利用倒置显微镜、荧光显微镜、透射电镜、流式细胞术以及Real time PCR等方法,对大蒜素处理后的HT-29细胞的形态、存活率、细胞周期分布、细胞凋亡率、线粒体膜电位(驻追m)以及Bax/Bcl-2基因表达比例的变化进行了研究。结果显示,大蒜素可抑制HT-29细胞增殖,且呈剂量依赖性关系。大蒜素作用于HT-29细胞48 h的最佳药物浓度是6滋g/m L。在此条件下,细胞出现明显的凋亡现象。早期和晚期细胞凋亡率分别为(7.48依0.38)%和(10.07依0.78)%,驻追m显著下降(p0.01),细胞被阻滞于S期和G2期,Bax/Bcl-2的比值显著升高(p0.01)。因此,我们推测大蒜素可能通过调节Bax和Bcl-2两个基因的表达比例,诱导人结肠癌HT-29细胞的凋亡,进而抑制癌细胞的增殖。     

线粒体形态学改变与细胞凋亡

近年来,对于线粒体形态学以及其在凋亡过程中的改变和作用的研究打破了传统的观点。正常情况下,线粒体在细胞内相互连接成管网状结构,并发生着频繁的融合与分裂。融合和分裂由一系列蛋白质介导,二者之间的动态平衡维持着线粒体的形态和功能。在细胞凋亡的早期,线粒体融合和分裂失平衡,导致线粒体管网状结构碎裂和嵴的重构,这些改变对线粒体随后的变化以及凋亡的发生具有重要的意义。融合和分裂的蛋白质不仅调控线粒体形态和细胞凋亡过程,也和某些凋亡相关疾病有关。此外,促凋亡的Bcl-2蛋白可能通过改变线粒体的构形来调控凋亡过程。     

PUMA在结肠癌细胞中的表达及诱导细胞凋亡中的作用

目的:通过5-Fu诱导携带有野生型p53基因的HCT116和携带有突变性p53基因的HT-29两种结肠癌细胞系,比较两株细胞在各时间点凋亡水平和PUMA mRNA表达情况的差异,探讨PUMA对细胞凋亡的作用及诱导其表达的基本途径。方法:用逆转录聚合酶链反应(RT—PCR)检测不同结肠癌细胞株HT-29、HCT116在抗肿瘤药物5-Fu作用下不同时间点结肠癌细胞株内PUMA mRNA表达水平的差异,用吖啶橙/溴化乙啶(AO/EB)荧光染色检测各时间点细胞的凋亡水平,分析其与PUMAmRNA表达水平之间的关系。结果:携带有野生型P53基因的结肠癌细胞株HCT116在5-Fu作用下6h即可出现PUMA mRNA的表达,随着药物作用时间的延长其表达强度增加,并且与细胞凋亡水平呈正相关;含有突变型P53基因的结肠癌细胞株HT-29在5-Fu作用下无PUMA的表达。结论:通过5-Fu诱导细胞凋亡出现的PUMA表达需要野生型P53基因,突变型P53基因无法诱导PUMA的表达。PUMA与结肠癌细胞凋亡水平呈正相关,是一种促凋亡蛋白。     

山柰酚通过线粒体凋亡通路诱导三阴性乳腺癌细胞凋亡的机制研究

本文旨在探讨山柰酚对三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231的抑制作用及其可能的分子机制。用不同浓度的山柰酚处理细胞,CCK-8法检测山柰酚对MDA-MB-231和人正常乳腺上皮细胞MCF-10A活力的影响,倒置显微镜观察各组细胞形态变化,克隆形成法检测细胞增殖,流式细胞仪检测细胞凋亡,JC-1染色法检测细胞线粒体膜电位的改变,Western blot检测B细胞淋巴瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、细胞色素C(Cyt C)和细胞周期蛋白D1(CyclinD1)的蛋白表达,比色法检测半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-3(Caspase-3)以及半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-9(Caspase-9)的活性。结果显示,山柰酚体外可显著抑制MDA-MB-231细胞的增殖,诱导细胞凋亡,且对正常乳腺上皮细胞活力无影响,降低细胞线粒体膜电位,上调Bax、Cyt C的表达,下降Bcl-2和Cyclin D1的表达,增强Caspase-3、Caspase-9活性。结果表明,线粒体凋亡信号通路的激活是山柰酚诱导MDA-MB-231细胞凋亡的途径之一。     

三氧化二砷诱导细胞凋亡对线粒体的影响

线粒体作为细胞能量的“动力工厂”,在细胞的生理过程中起着重要的作用,本文采用三氧化二砷（Ａｓ２ Ｏ３） 诱导ＭＧＣ－ ８０３ 细胞凋亡,通过罗丹明１２３ 和Ｈｏｅｃｈｅｓｔ３３２５８ 对细胞进行荧光标记,利用具有光子计数成像能力的超高灵敏度荧光显微镜观察凋亡细胞与未加入Ａｓ２ Ｏ３ 的对照组细胞的区别,发现Ａｓ２ Ｏ３ 在诱导细胞凋亡时可引起线粒体内膜电位差减小     

高糖通过线粒体途径诱导成骨细胞凋亡

线粒体途径是细胞凋亡的重要途径之一. 在特定的刺激下,例如高糖条件,可以通过caspase依赖性和非依赖性两种途径诱导多种细胞凋亡.但线粒体凋亡途径在高糖引起成骨细胞凋亡中所起的作用,目前尚不清楚.本研究证明,高糖可以通过线粒体凋亡途径诱导成骨细胞凋亡.Annexin V-FITC/PI流式细胞学检测显示,高糖可诱导MC3T3-E1细胞凋亡.Western印迹检测发现,不同浓度D-葡萄糖（11,22,33 mmol/L）可以引起线粒体中Bax蛋白表达的增加,使Bax蛋白由细胞质中易位到线粒体,激活了线粒体凋亡途径.JC-1荧光探针检测证实,高糖处理成骨细胞后,线粒体膜电位明显降低,表明线粒体途径被激活.而细胞质中的细胞色素c、凋亡诱导因子（AIF）表达增加,细胞色素c和AIF从线粒体中释放到细胞质中,释放到细胞质中的细胞色素c使caspase-3、caspase-9剪切活化,从而激活了caspase依赖性凋亡途径.因此,线粒体凋亡途径可能是高糖诱导成骨细胞凋亡过程中一个重要的途径.     

EGCG对人结肠癌HT-29细胞凋亡的影响以及对MMP-2,RECK的调节作用

目的：观察表没食子儿茶素没食子酸酯（Epigallaocatechin-3-gallate,EGCG）对人结肠癌HT-29细胞增殖和凋亡的影响,并探讨其对MMP-2,RECK的调节作用。方法：体外培养人结肠癌HT-29细胞,MTT比色法检测EGCG对HT-29细胞的生长抑制作用;Histone/DNA ELISA检测细胞凋亡;FITC标记Annexin-V/PI双染流式细胞术分析凋亡细胞百分率;Western Blot和RT-PCR方法检测EGCG对MMP-2,RECK蛋白和mRNA表达的影响。结果：EGCG呈浓度和时间依赖性抑制HT-29细胞的增殖,并且增加HT-29细胞Histone/DNA碎片的渗漏;EGCG诱导HT-29细胞凋亡百分率增高;EGCG抑制MMP-2蛋白和mRNA的表达,促进RECK蛋白和mRNA的表达。结论：EGCG抑制人结肠癌HT-29细胞的增殖,促进其凋亡,并且呈浓度和时间依赖性;其作用机制可能与其下调MMP-2蛋白和mRNA的表达、上调RECK蛋白和mRNA的表达有关。     

EGCG 对人结肠癌HT-29 细胞凋亡的影响以及对MMP-2，RECK 的 调节作用

目的:观察表没食子儿茶素没食子酸酯(Epigallaocatechin-3-gallate,EGCG)对人结肠癌HT-29细胞增殖和凋亡的影响,并探讨其对MMP-2,RECK的调节作用。方法:体外培养人结肠癌HT-29细胞,MTT比色法检测EGCG对HT-29细胞的生长抑制作用;Histone/DNA ELISA检测细胞凋亡;FITC标记Annexin-V/PI双染流式细胞术分析凋亡细胞百分率;Western Blot和RT-PCR方法检测EGCG对MMP-2,RECK蛋白和mRNA表达的影响。结果:EGCG呈浓度和时间依赖性抑制HT-29细胞的增殖,并且增加HT-29细胞Histone/DNA碎片的渗漏;EGCG诱导HT-29细胞凋亡百分率增高;EGCG抑制MMP-2蛋白和mRNA的表达,促进RECK蛋白和mRNA的表达。结论:EGCG抑制人结肠癌HT-29细胞的增殖,促进其凋亡,并且呈浓度和时间依赖性;其作用机制可能与其下调MMP-2蛋白和mRNA的表达、上调RECK蛋白和mRNA的表达有关。     

miR-506-3p通过上调SDAD1促进结直肠癌细胞HT-29的凋亡

[目的]探讨miR-506-3p是否靶向SDAD1并调控结直肠癌细胞HT-29凋亡的发生。[方法]通过TargetScan在线分析miR-506-3p与SDAD1的匹配度,利用双荧光素酶报告系统检测miR-506-3p与SDAD1的结合。进一步过表达与干扰miR-506-3p,通过Western Blot法检测SDAD1及凋亡标志蛋白的表达情况,通过Annexin-V染色检测结直肠癌细胞HT-29的凋亡水平。[结果]miR-506-3p可以与SDAD1的3′端非编码689-692区域靶向结合。过表达miR-506-3p后,SDAD1与凋亡标志蛋白Cleaved-caspase 3和Cleaved-caspase 9的表达量上升,结直肠癌细胞HT-29的凋亡水平显著上升。干扰miR-506-3p后,SDAD1、凋亡标志蛋白Cleaved-caspase 3和Cleaved-caspase 9的表达量下降,结直肠癌细胞HT-29的凋亡水平显著下降。[结论]miR-506-3p可以靶向结合SDAD1从而上调其表达,而SDAD1是结直肠增殖、凋亡相关基因,miR-506-3p通过上调SDAD1促进结直肠癌细胞HT-29的凋亡。提示miR-506-3p的表达可能作为SDAD1靶向RNA反映结直肠癌的增殖,与结直肠癌的发生、进展相关,进一步探究miR-506-3p抑制剂在结直肠癌患者治疗方面的应用具有良好的临床应用前景。     

猪丁型冠状病毒诱导的细胞线粒体凋亡

猪丁型冠状病毒(Porcine deltacoronavirus,PDCoV)是一种新型的猪肠道致病性冠状病毒,可引起猪群剧烈腹泻及呕吐,但致病机制尚不清楚。本研究检测了PDCoV感染诱导的细胞凋亡。Caspase酶活性检测显示,在PDCoV感染的细胞中,caspase 3、caspase 8和caspase 9的活性随病毒感染量的增多而显著提高,类似的现象未能在紫外灭活病毒感染的细胞中观察到,表明PDCoV感染可同时激活内源性与外源性细胞凋亡通路,并暗示细胞凋亡的诱导依赖于病毒复制。为深入探究PDCoV诱导的内源性细胞凋亡,分别检测胞浆和线粒体中细胞色素C与凋亡诱导因子。结果显示,与正常细胞相比,PDCoV感染细胞从线粒体释放到胞浆的细胞色素C显著增多,且其释放量随着感染时间的延长而增多,而凋亡诱导因子始终定位于线粒体,提示PDCoV感染通过促使线粒体膜间隙的细胞色素C进入胞浆而启动caspase依赖的线粒体凋亡通路。本研究初步揭示了PDCoV诱导细胞凋亡的机制。     

乙酰哈巴苷通过Wnt信号通路诱导结肠癌HCT116细胞凋亡

本文探讨乙酰哈巴苷诱导结肠癌HCT116细胞凋亡机制。采用流式细胞术检测乙酰哈巴苷对HCT116细胞周期及凋亡的影响,发现细胞周期被阻滞在G1期,0.75 mmol/L乙酰哈巴苷处理48 h后,细胞凋亡明显增加。转录组测序显示乙酰哈巴苷引起HCT116细胞1 921个mRNA上调和2 208个mRNA下调,可显著影响Wnt信号通路。RT-qPCR和Western blot验证实验表明,乙酰哈巴苷处理后,HCT116细胞中β-catenin、CyclinD1、Survivin、Bcl-2和c-Myc蛋白显著降低(P<0.05),凋亡相关蛋白Bax和cleaved-caspase3表达增加(P<0.05)。上述结果表明,乙酰哈巴苷主要通过Wnt信号通路抑制结肠癌细胞增殖并诱导细胞凋亡。     

镉通过引发氧化应激和线粒体损伤诱导PK-15细胞凋亡

镉（cadmium,Cd）是一种生物累积性的有毒重金属元素,能够在肾组织大量蓄积并引起肾发生病变和功能损伤。前期研究证实,Cd处理能够引起猪肾PK-15细胞的活性氧（reactive oxygen species,ROS）水平升高和细胞死亡,但详细机制有待进一步研究。本研究以PK-15细胞为研究对象,通过CCK-8检测、透射电镜观察、DCFH-DA标记、JC-1染色、彗星实验和流式细胞术等研究手段,分别检测Cd处理后的细胞活性、形态变化、ROS生成、线粒体膜电位Δψm、DNA损伤及细胞凋亡情况。CCK-8实验结果显示,CdCl2处理后PK-15细胞活性下降,且呈时间和剂量依赖性;形态学观察发现,CdCl2处理引起PK-15细胞皱缩、变圆,细胞核固缩、染色质凝聚,线粒体肿胀、线粒体嵴减少或消失;荧光染色和流式细胞术检测结果显示,CdCl2处理引起PK-15细胞内ROS水平升高、线粒体膜电位Δψm下降和DNA损伤,最终导致细胞凋亡。Western印迹结果显示,CdCl2处理组中促凋亡蛋白质Bax表达量上调,抑凋亡蛋白质Bcl-2表达量下调,并且CdCl2处理组检测到了活化状态的裂解胱天蛋白酶3(cleaved caspase 3)。此外,ROS清除剂N-乙酰基-L-半胱氨酸（N-acetyl-L-cysteine,NAC）缓解了CdCl2引起的线粒体损伤、DNA损伤和细胞凋亡。综上所述,Cd通过引发氧化应激和线粒体损伤诱导PK-15细胞凋亡。     

镉诱导HEK293细胞凋亡及其线粒体凋亡途径

本课题研究了氯化镉(CdCl_2)诱导HEK293细胞(人胚胎肾细胞系)的凋亡,初步探讨了凋亡过程中Caspase-3、Bcl-2的变化和凋亡诱导因子(AIF)的转移以及它们的意义。MTT法检测CdCl_2对HEK293细胞增殖的抑制作用;通过倒置显微镜、电镜、琼脂糖凝胶电泳、流式细胞术、激光共聚焦观察细胞凋亡;应用Western blot法和荧光免疫法测定Caspase-3酶原、Bcl-2蛋白的变化以及检测AIF蛋白在细胞中的定位。结果显示:CdCl_2对HEK293细胞具有显著的生长抑制作用,并呈明显的剂量和时间依赖性。在琼脂糖凝胶电泳中,显示有凋亡细胞特有的DNA梯状条带,其中30μmol/L作用6-9h梯状条带最为清晰,时间过长或浓度过高则梯状条带逐渐模糊,表明镉浓度过高或处理时间过长,细胞有坏死。流式细胞仪检测也印证了这一结果。形态学观察可见明显的细胞凋亡特征。同时线粒体膜电位明显下降,发现Caspase-3酶原蛋白、Bcl-2蛋白含量减少,并具有时间依赖性;另外检测到线粒体AIF向细胞核转移。而Bcl-2转染后有一定的抑制凋亡作用。实验结果提示,CdCl_2能够诱导HEK293细胞凋亡,线粒体损伤导致AIF转移与细胞色素c释放,从而引发的非Caspases与Caspases凋亡途径可能在镉引发的细胞凋亡过程中起重要作用,而Caspase-3, Bcl-2起着重要的调控作用。     

FAS/ActD通过线粒体途径引起细胞阻滞诱导人宫颈癌HeLa细胞凋亡

为了探讨FAS抗体与放线菌素D(actinomycin D,ActD)联合作用诱导人宫颈癌HeLa细胞凋亡的分子机制,通过MTT法检测细胞活力,利用流式细胞仪检测细胞凋亡和细胞周期,从而研究FAS/ActD抑制细胞增殖的作用. 结果表明,FAS/ActD能明显降低HeLa细胞的活力,并且通过G1/G0期阻滞和S期阻滞诱导HeLa细胞凋亡. 此外,Western印迹分析进一步显示,FAS/ActD还能引起Bcl-2蛋白表达降低, Bax蛋白表达增加,Bid蛋白发生断裂激活,导致细胞质中Cyto-c释放的增加,并激活在细胞凋亡的执行过程中起着关键作用的caspase 9和caspase 3. 以上结果提示,FAS抗体与ActD的联合作用可能经线粒体途径引起细胞周期阻滞,从而诱导HeLa细胞凋亡. 该研究为宫颈癌的免疫治疗提供了新的思路.     

改构苹果多糖对人结肠癌HT29细胞凋亡的影响

目的:探讨改构苹果多糖(modified apple polysaecharides,MAP)对人结肠癌HT29细胞凋亡的影响及其机制.方法:采用MTT法观察不同浓度MAP对HT29细胞增殖的影响;TUNEL法和流式细胞术研究MAP对HT29细胞凋亡的作用;Western Blot法检测给予不同浓度MAP后,HT29细胞中凋亡相关蛋白caspase3,8,9、Bax和Bcl-2表达的变化.结果:与对照组相比,MAP对HT29细胞增殖有明显的抑制作用且能诱导HT29细胞的凋亡;MAP可促进HT29细胞caspase 3,8,9及Bax的表达,降低Bcl-2的表达,且均呈剂量依赖性.结论:MAP可以通过内部和外部途径诱导HT29细胞凋亡.     

三氧化二砷通过线粒体途径诱导人白血病HL-60细胞凋亡

目的:研究三氧化二砷(Arsenic trioxide,ATO)对人白血病HL-60细胞凋亡的影响,并以线粒体通路为靶点探讨其可能的机制。方法:采用1μg/m L、5μg/m L及10μg/m LATO处理HL-60细胞24小时后,采用流式细胞术检测细胞凋亡情况,通过细胞内MDA与GSH含量检测反映氧化应激水平,采用免疫印迹法检测凋亡相关分子表达,并通过免疫荧光染色检测细胞线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential,MMP)水平。结果:5μg/m L及10μg/m L ATO可显著诱导人白血病HL-60细胞凋亡,并显著增加其氧化应激水平,增加促凋亡分子Bax和Caspase-3的表达,而抑制抗凋亡分子Bcl-2的表达,降低HL-60细胞线粒体膜电位的水平。结论:一定剂量的ATO可诱导人白血病HL-60细胞凋亡,而这一作用可能是通过诱导线粒体相关性凋亡信号通路激活实现。