LC-MS分析CmSnf1基因过表达对蛹虫草代谢组的影响

Sucrose-nonfermenting1(SNF1)蛋白激酶调节大量基因的转录,改变代谢酶的活性,并控制各种营养反应性细胞发育过程。本研究通过LC-MS非靶向代谢组学技术比较蛹虫草Cordyceps militaris野生型菌株Cm01和CmSnf1基因过表达菌株菌丝体的化学成分,从整体代谢物水平阐明CmSnf1基因过表达对蛹虫草代谢产物积累的影响。研究表明：CmSnf1基因过表达后,在LC-MS正负离子模式下检测出547种差异代谢物,同野生型菌株相比,220种产物上调和327种下调。尤其显著的是黄酮类物质2-香叶基-3,4,2′,4′-四羟基二氢查耳酮上调了140.55倍,甘油磷脂代谢中的磷脂酰丝氨酸(PS)下调了47.53倍。差异代谢产物参与甘油脂代谢、氨基酸生物合成和降解、半乳糖代谢、丙酮酸和酮类化合物代谢等多种途径。CmSnf1过表达菌株与野生型相比在酮类化合物代谢上具有优势,推测CmSnf1基因在蛹虫草药用功效中发挥着重要的作用。     

蛹虫草原基分化的差异蛋白质组学研究

蛹虫草子实体形成及发育的蛋白分子机制尚不清楚,本研究引入SWATH非标记定量蛋白质组学技术,对蛹虫草Cordyceps militaris 905菌株的菌丝体（mycelium,My）、原基（primordium,Po）、生长期子实体（developmental fruiting body,DF）和成熟期子实体（mature fruiting body,MF）进行了比较蛋白质组学分析。经搜库比对,从蛹虫草的My、Po、DF和MF中依次鉴定蛋白1 136个、1 090个、1 018个和997个（global FDR 1%）,经维恩分析后获得C. militaris 905蛹虫草表达蛋白1 578个。在此基础上,SWATH非标记技术定量蛋白1 109个。本研究获得了蛹虫草Po期与My期、DF期与Po期、MF期与DF期的差异表达蛋白,依次为115个、352个和104个,并对菌丝体分化形成原基的差异表达蛋白进行了重点解析。GO注释结果表明,Po期与My期差异表达蛋白以有机含氮类化合物代谢为主,其中AMP（活性成分虫草素合成的中间产物）从头生物合成途径富集最为显著。约1/5的差异表达蛋白参与氧化还原反应,还原酶活性的蛋白在原基中几乎都上调表达,而氧化功能的蛋白受到抑制,表明蛹虫草原基分化可能受到氧化应激的诱导。蛋白互作网络分析结果进一步表明,氧化还原反应与核苷类物质代谢相关联,可能通过影响AMP从头生物合成途径来调控虫草素的生物合成。对蛹虫草子实体系统的蛋白质组学研究和解析有利于揭示子实体形成的蛋白分子机制,为蛹虫草的基础和栽培研究提供了理论支撑。     

蛹虫草菌生物合成虫草素的研究进展

蛹虫草Cordyceps militaris是我国传统的药用真菌,虫草素是蛹虫草的主要活性成分,具有抗癌、抗肿瘤、抗病毒等多种生理功能。蛹虫草菌液体发酵是最有希望实现高效生产虫草素的途径,但现阶段生产强度低,亟需应用发酵工程及代谢工程手段提高虫草素产量。文中对液体发酵体系中培养基组分(碳/氮源、前体物质、金属离子等)和培养条件(pH、溶氧量、光照等)对虫草素产量的影响进行了总结,并对虫草素的分离纯化、生物合成基因簇及合成代谢途径进行了阐述,最后探讨了实现虫草素高效生产的关键环节。     

蛹虫草九个菌株子实体形成情况与主要活性成分分析

通过室内瓶栽试验对蛹虫草(Cordyceps militaris)9个菌株的主要子实体形成情况进行了分析,并采用DNS法和HPLC法测定了不同菌株胞内糖和虫草素含量。综合上述3个方面的试验结果,9个供试菌株中,8号菌株表现最优,子实体粗壮且生长整齐,虫草素及胞内糖含量显著高于其他菌株。     

蛹虫草磷酸甲羟戊酸激酶和焦磷酸甲羟戊酸脱羧酶基因的功能分析

【目的】确定蛹虫草甲羟戊酸途径中的2个关键酶——磷酸甲羟戊酸激酶(CmErg8)和焦磷酸甲羟戊酸脱羧酶(CmErg19)的功能及其对麦角甾醇和虫草素含量的影响。【方法】通过生物信息学分析鉴定蛹虫草中CmErg8和CmErg19,并采用酵母互补确定其功能是否保守;以蛹虫草尿嘧啶营养缺陷型CmΔpyrG为背景菌株,利用农杆菌介导的转化方法对CmErg8和CmErg19进行过表达,观察其对麦角甾醇和虫草素含量的影响。【结果】CmErg8和CmErg19不能互补酵母erg8和erg19突变体的温度敏感表型;CmErg8和CmErg19过表达菌株中麦角甾醇和虫草素含量均有所增加,特别是CmErg19基因过表达可以使虫草素含量提升5倍左右。【结论】本研究揭示了蛹虫草CmErg8和CmErg19的功能,并且发现蛹虫草麦角甾醇合成通路基因可能会影响虫草素含量。     

产虫草素酿酒酵母工程菌株的构建与发酵优化

虫草素作为药用真菌蛹虫草的主要活性成分,具有抗肿瘤、抗病毒等多种生理功能。现阶段虫草素主要通过蛹虫草液体发酵生产,但发酵周期长、生产强度低,制约了其大规模开发利用。文中在酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae S288C中异源表达虫草素合成关键基因ScCNS1和ScCNS2,成功构建了产虫草素的酵母工程菌SHC16,发酵240 h虫草素产量可达67.32 mg/L;基因表达分析显示,发酵后期磷酸戊糖途径、嘌呤代谢及虫草素合成途径关键酶编码基因ZWF1、PRS4、ADE4、ScCNS1及ScCNS2表达水平显著上调。进一步地,通过优化发酵培养基组成,确定以50 g/L葡萄糖为初始底物结合一次补料、添加5 mmol/L Cu2+和1.0 g/L腺嘌呤为最适培养基组成。基于此在5 L搅拌发酵罐中开展补料分批发酵,144 h虫草素产量达到137.27 mg/L,生产强度达0.95 mg/(L·h),较未优化发酵体系提高240%。     

真菌激发子对提高蛹虫草虫草菌素的作用

研究了不同真菌激发子菌株对提高蛹虫草生物量和虫草菌素含量的影响,其中一株疫霉（Phytophthora sp.)YL提高虫草菌素含量比对照高4倍。机械研磨和80℃高温细胞自溶相结合制备的真菌激发子诱导效果最佳。同一激发子不同浓度对虫草素的诱导实验表明,80μg/ml浓度碳水化合物的真菌激发子诱导蛹虫草产生虫草菌素效果最明显。     

蛹虫草优良菌株的筛选

通过对5株蛹虫草的菌丝形态和生长速率、液体培养生物量和胞外多糖、人工栽培和子实体中活性物质虫草多糖和虫草素的对比研究,筛选出优良的蛹虫草菌株。试验结果表明：蛹虫草6号菌株的菌丝的生长速率比其他菌株快;液体培养生物量和胞外多糖含量明显高于其他菌株;人工栽培的蛹虫草子实体头部大,子囊壳丰富,颜色橘黄,出草整齐均匀,出草率高,子实体中虫草多糖和虫草素的含量均高于其他菌株,表明6号菌株具有较高的经济价值,是值得开发和推广的好品种。     

真菌激发子对提高蛹虫草虫草菌素的作用*

研究了不同真菌激发子菌株对提高蛹虫草生物量和虫草菌素含量的影响,其中一株疫霉(Phytophthora sp.)YL提高虫草菌素含量比对照高4倍。机械研磨和80℃高温细胞自溶相结合制备的真菌激发子诱导效果最佳。同一激发子不同浓度对虫草素的诱导实验表明, 80mg/ml浓度碳水化合物的真菌激发子诱导蛹虫草产生虫草菌素效果最明显。     

人工蛹虫草不同菌株菌丝形态与其虫草素含量关系

对4个不同来源人工蛹虫草菌株进行平板试验,在培养条件相同情况下,观察比较其生长情况;对相同菌龄不同菌株菌丝体所含虫草素进行超声波提取。结果表明：峰面积与虫草素含量呈良好的线性关系,精密度高,其中菌株YJ11 3菌丝体虫草素含量最高,为0.505%,其次为菌株YJ11 1、YJ11 4,最低的是YJ11 2,仅0.097%;菌丝湿重依次为YJ11 3〉YJ11 1〉YJ11 4〉YJ11 2;不同蛹虫草菌株菌丝湿重与其虫草素含量呈正相关关系。     

虫草素产量不同的蛹虫草菌株代谢组差异

为探究虫草素高产和低产的两株蛹虫草菌代谢差异及其与虫草素代谢的关联性,本研究采用UPLC-QTOF-MS广泛靶向代谢组学技术和多元统计分析方法,结合相同蛹虫草菌不同发酵时间的菌丝体差异代谢物相对含量的变化情况,比较了两株蛹虫草菌相同发酵时间的菌丝体代谢差异.结果 表明:蛹虫草ClCC 14014菌株发酵第20和10天的...     

虫草素高产菌株的筛选及不同添加物对虫草素产量的影响研究

通过对14株蛹拟青霉菌株进行摇瓶液体发酵培养试验,筛选虫草素产量最高的蛹虫草菌株,并确定了虫草素的最佳收获期;比较8种营养添加物对虫草发酵过程中虫草素积累的影响,筛选出最佳的营养添加物,以提高液体发酵生产虫草素的产量。结果表明：蛹虫草CM001号菌株的虫草素产量最高,蛹虫草菌在第10天细胞量达到最大值20.44mg/mL,虫草素含量在第13天达到最大值73.81mg/L,70%以上的虫草素分布在发酵液中。其中分别添加腺苷、腺嘌呤、丙氨酸、L-天冬氨酸、甘氨酸5种物质,对虫草素合成的促进作用均较明显,均能有效提高蛹虫草液体发酵虫草素的产量,特别是添加1g/L的腺嘌呤能使10号菌株的虫草素产量提高7.09倍。     

通过化学结构修饰提高虫草素抗菌活性的试验研究

本文以我国传统药用真菌蛹虫草(Cordyceps militaris)的主要活性成分虫草素为先导化合物,合成了4个虫草素的正构烷酰胺同系物(Cn-AAC),即N-丙酰基虫草素(C3-AAC)、N-正辛酰胺虫草素(C8-AAC)、N-月桂酰基虫草素(C12-AAC)和N-硬脂酰基虫草素(C18-AAC),并通过抑菌试验对比测定了虫草素和4个Cn-AAC的最低抑菌浓度(MIC)。在此基础上,用SPSS10.0对MIC和Cn-AAC烷酰基侧链中碳原子数目(n)之间的关系进行了定量分析。结果表明:通过化学结构修饰的手段将虫草素改变成Cn-AAC同系物后,其抗菌活性会发生有规律的变化。Cn-AAC的MIC和n之间的关系可以用一个一元二次方程进行定量描述,其中抗菌活性最强的为C8-AAC;和虫草素相比,C8-AAC对枯草杆菌的MIC降低5倍,并可对虫草素本身不能产生抗菌活性的金黄色葡萄球菌和白色念珠菌产生抗菌活性。     

蛹虫草的光形态建成及蓝光受体基因Cmwc-1

蛹虫草[Cordyceps militaris(L.)Link],隶属于肉座菌目(Hypocreales),麦角菌科(Clavicipitaceae),虫草属(Cordyceps),其滋补作用和药用功效与名贵但难以人工培养的冬虫夏草相近,并日渐成为冬虫夏草的理想替代品。蛹虫草为虫草属模式种,分布广泛,在人工培养基或昆虫蛹体上能产生无性和有性阶段,其基因组已公布,成为大型真菌生物学研究的理想模型。对真菌而言,光可影响其生长发育、生理周期、形态变化及次级代谢产物产生,光照是蛹虫草子实体生长发育的必要条件,并能够调控其类胡萝卜素的产生。该研究采用5株代表性的蛹虫草菌株,包括1株退化菌株、1株白化菌株和3株在栽培中广泛运用但子实体形态各异的菌株作为对象,研究其光形态建成、克隆蓝光受体基因Cmwc-1并测定在不同光照条件下其表达量的变化。结果表明,除白化菌株外,光照刺激促进菌丝色素的形成,且蓝光的作用优于白光。光照抑制生长速度,所有的菌株在黑暗条件下生长最快,白光次之,蓝光最慢,退化菌株的生长速度在3种培养条件下均优于其他菌株。此外,光照促进分生孢子的产生。退化菌株在白光和蓝光条件下产孢量均最大。为了从分子层面阐明蛹虫草对光刺激的应答反应,该研究通过Hai-l tail PCR和基因步移的方法克隆得到了蓝光受体基因Cmwc-1。CmWC-1是1个GA-TA-Zinc finger型转录因子,含有谷氨酸富集结构域,LOV(Light,Oxygen,or Voltage),PAS(Per-Arn-t Sim)和锌指结构域,与粗糙脉孢霉的蓝光受体结构域组成基本一致。对5个研究对象的CmWC-1序列比较分析发现3个菌株在谷氨酰胺富集结构域缺失5个谷氨酰胺。基于JTT模型的贝叶斯树和最大似然法构建的WC-1系统树,其树形和ITS序列构建的系统树基本一致,且粪壳菌纲的一些主要类群以较高的支持率被划分为单系,说明WC-1可以作为系统进化分析的一个参照。Cmwc-1在黑暗条件下表达,光照刺激后表达量增加,待光照时间持续30 min,其表达量将不再上升,即光适应现象。蛹虫草光受体基因的研究将为子实体发育研究奠定基础。     

赖氨酸特异性组蛋白去甲基化酶基因对蛹虫草生长发育的影响

赖氨酸特异性组蛋白去甲基化酶(lysine-specifichistonedemethylase,LSD)是真核生物中关键的表观遗传调控因子,在真菌中能够执行组蛋白特定位点上赖氨酸的去甲基化,调控多个基因的表达,从而影响多种次级代谢产物的合成。本研究通过对蛹虫草LSD基因(CmLSD)编码蛋白的生物信息学分析,发现蛹虫草CmLSD蛋白具有典型JmjC功能域,可能参与组蛋白H3、H4的去甲基化修饰。进一步对蛹虫草菌株Cm01进行CmLSD基因的过表达和敲除研究,发现该基因能够影响蛹虫草的生长和分生孢子的产生,以及腺苷、虫草素的分泌。     

拆分网络分析22株蛹虫草亲缘关系及高产虫草素菌株初筛

对22株蛹虫草Cordyceps militaris的ITS序列进行分析,并基于拆分网络法splits networks,分析供试菌株的亲缘关系,再进一步比较供试菌株发酵产虫草素能力,筛选出高产虫草素菌株。结果表明,22株蛹虫草的ITS序列长度在518-539 bp之间,对位排列后有39个差异位点,其中有12个简约信息位点,并且都发生在ITS1区;构建的拆分网络显示22株虫草聚为3个类群,每个类群因其特有的碱基替换而区别于其他菌株;22株蛹虫草发酵产虫草素性能差异很大,且虫草素主要存在于胞外液中,MF27的胞外液虫草素含量为332.74 mg/L,显著高于其它菌株(P0.05)。本研究为研究蛹虫草菌株间的系统关系和种质资源管理提供了依据。     

蛹虫草中虫草素、虫草多糖综合提取工艺研究

以蛹虫草为材料．采用超声波水提法、超声波醇提法、水热回流法和醇热回流法4种提取方法选择虫草素和虫草多糖的最优提取办法．并用正交试验方法考察水热回流法中提取温度、提取次数、提取时间、料液比4个因素对虫草素、虫草多精综合提取效率的影响．以确定从蛹虫草中综合提取虫草素、虫草多糖最佳工艺。结果表明．水热回流法是提取虫草多糖和虫草素的最优提取方法．其最佳工艺条件为：用10倍量的水于80℃热回流提取3次．每次90min。     

几种虫草属真菌的学名订正

本文合格发表虫草属两个变型的名称,即Cordyceps militaris f.albina(蛹虫草白化变型)和C.ophioglossoides f.alba(大团囊虫草白化变型),并提出新名称C.shimizui(清水虫草)以代替非法的晚出同名C.chichibuensis Kobayasi & Shimizu,同时也证实C.shanxiensis(山西虫草)的合格发表地位。Cordyceps purpureostramata f.recurvata是一个不合格名称,其模式标定可以从原白中提供的照片得到线索。虫草属下分类单元作者的准确引证和一些种或种下分类单元拉丁名加词的正确拼法也在此作了讨论。     

蛹虫草缓解新型冠状病毒感染研究进展

严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)引起的COVID-19在全球范围内大流行,危害了人类健康和公共安全,随着对SARS-CoV-2的结构、功能和致病过程的了解,越来越多的潜在药物被开发。蛹虫草(Cordyceps militaris)是我国传统的药用真菌,具有显著的抗病毒作用,虫草素作为蛹虫草的主要活性成分能够与SARS-CoV-2刺突蛋白、主蛋白酶(Mpro)相结合,抑制病毒RNA依赖的RNA聚合酶(RDRP)活性,阻断SARS-CoV-2在机体内复制。蛹虫草还具有提升机体免疫力、修复受损组织的作用。本文概述虫草素抗SARS-CoV-2的机制和蛹虫草其他相关药理作用,以期为蛹虫草用于新型冠状病毒感染的辅助治疗提供参考。     

锌富集对蛹虫草菌丝体内虫草素、腺苷含量的影响

为了解蛹虫草菌丝体对锌的富集特性,研究锌富集对蛹虫草菌丝体内虫草素、腺苷含量的影响,通过在液体培养基中添加不同质量浓度的锌离子(0~35 g/L),探讨其对蛹虫草菌丝生物量、菌丝体内锌积累量,以及锌的富集对菌丝体内虫草素、腺苷含量产生的影响。结果表明:在0~35 g/L锌离子的梯度范围内,蛹虫草菌丝生物量与锌质量浓度呈显著负相关,锌质量浓度35 g/L为蛹虫草菌丝生长极限浓度。锌质量浓度40.0 g/L及以上菌丝生长受到完全抑制。菌丝体内锌的积累量随锌质量浓度的增加而显著升高,锌质量浓度为35.0 g/L时锌积累量可达到193.87 mg/g(干重)。蛹虫草菌丝体内腺苷的含量随锌质量浓度的增加而降低,在锌质量浓度为5 g/L时降幅显著,腺苷含量仅为对照组的17.24%,之后腺苷含量变化趋势趋于水平。腺苷含量的降低可能是因为锌的富集干扰了蛹虫草菌丝体内初生代谢的正常进行。虫草素的含量随锌质量浓度的增加而显著降低,可能是由于其直接前体腺苷含量的降低,或是Zn离子的加入,使得某些被刺激的酶和基因通过转录因子影响了虫草素的合成。