敬钊毒素-Ⅲ对Nav1.8通道的抑制作用

敬钊毒素-Ⅲ(JingzhaotoxinⅢ,JZTX-Ⅲ)是从敬钊缨毛蛛毒液中分离到的一种门控调节型毒素,能选择性抑制钠通道亚型Nav1.5激活,但对其他6种钠通道亚型(Nav1.1 Nav1.4 Nav1.6和Nav1.7)无抑制作用。为了更好地研究钠通道结构与功能之间的关系,采用全细胞膜片钳技术检测了JZTX-Ⅲ对表达在ND7123细胞上的Nav1.8画道的影响。结果显示,JZTX-Ⅲ抑制Nav1.8电流,并且这种抑制作用具有时间和浓度依赖性,抑制时间常数和IC_(50)值分别为41.15±0.6 s和1.4±0.23μmol/L;1μmol/JZTX-Ⅲ使Nav1.8画道的电流-电压关系曲线和激活曲线分别向去极化方向漂移10 mV和9mV,使Nav.1.8通道的稳态失活曲线向超极化方向漂移16 mV,明显改变Nav1.8通道的激活和稳态失活动力学。此外,钠通道序列比对结果提示JZTX-Ⅲ可能通过结合Nav1.8通道DIIS3~S4连接环上的Lys(K)残基抑制Nav1.8通道。以上研究结果为进一步探索钠通道结构与功能之间的关系奠定了基础。     

O2-芋螺毒素Tx7.29抑制钙通道电流及镇痛活性研究（英文）

目的 海洋肉食性软体动物芋螺的毒液是生物活性多肽的一个宝贵来源。这些活性多肽大多是富含二硫键的神经毒素,通常称为芋螺毒素。在本研究中,发现了一个全新的O2超家族芋螺毒素Tx7.29,通过对其进行功能研究,期望发现新的镇痛药候选物。方法 从织锦芋螺毒管c DNA文库中克隆得到Tx7.29的c DNA序列。通过化学合成,制得了Tx7.29的成熟肽,并通过质谱鉴定了其分子质量。通过膜片钳实验和动物实验确定Tx7.29的生物学功能。结果 Tx7.29的c DNA序列编码了一个包含68个氨基酸残基的芋螺毒素前体,由19个残基的信号肽、28个残基的前片段和22个残基的成熟肽组成。圆二色谱分析表明,β转角和反平行片层是Tx7.29二级结构中的主要组分。通过膜片钳实验发现,Tx7.29可以显著抑制大鼠背根神经节细胞的钙通道电流,但对钠电流和钾电流没有明显作用。在小鼠热板疼痛试验中,从0.5到4小时,Tx7.29以剂量依赖性的方式,增加了试验小鼠的热板潜伏时间。Tx7.29对ND7/23细胞无明显细胞毒性。结论 Tx7.29有望成为一种镇痛药物先导化合物,同时它的发现也扩大了O2-芋螺毒素的作用范围。     

虎纹捕鸟蛛毒素-X的化学合成及其鉴定

应用芴甲氧羰基（Fmoc）固相方法化学合成了虎纹捕鸟蛛毒素-X（huwentoxin-X,HWTX-X）,并在含5mmol／LGSH和0．5mmol／LGSSG的0．1mol／L Tris-HCl溶液（pH8．0）中氧化复性：复性产物与天然多肽具有相同的分子质量,在反相HPLC上共洗脱,其一维核磁共振谱规则分散,表明合成多肽形成了3对二硫键和稳定的空间结构,并与天然多肽相同：此合成的多肽能专一性抑制大鼠背根神经节细胞上N-型电压敏感钙离子通道．其IC50约40nmol／L. HWTX-X的成功合成和鉴定为进一步研究HWTX-X的结构与功能关系、药理学性质以及新型镇痛药物研发奠定了基础．     

海南捕鸟蛛毒素-Ⅳ在大肠杆菌中的分泌表达及纯化

海南捕鸟蛛毒素-Ⅳ(hainantoxin-Ⅳ,HNTX-Ⅳ)是从海南捕鸟蛛(Selenocosmia hainana)的毒液中分离得到的一种可以特异性抑制河豚毒素敏感型(TTX-S)钠通道的多肽毒素，并且能够选择性抑制Na_v1.7亚型电压门控钠离子通道。HNTX-Ⅳ的成熟肽含有35个氨基酸残基，其结构通过3对二硫键稳定。HNTX-Ⅳ是研究钠通道结构和功能以及镇痛药物开发过程中非常有用的一种分子探针，但是其在天然毒素中的含量较少，很难分离足够量的组分进行后续研究。在本研究中，我们通过OEPR克隆构建了HNTX-Ⅳ的大肠杆菌分泌表达质粒pSE-G1M5-SUMO-HNTX-Ⅳ。将质粒pSE-G1M5-SUMO-HNTX-Ⅳ转化到大肠杆菌BL21(DE3)中进行自动诱导分泌表达，含有6×His标签和SUMO标签的融合蛋白质6×His-SUMO-HNTX-Ⅳ成功分泌到大肠杆菌的细胞外培养基中。通过弱阳离子交换柱富集和Ni-NTA柱纯化之后，成功获得了纯度较高的融合蛋白质6×His-SUMO-HNTX-Ⅳ。通过Ulp1激酶切割，重组HNTX-Ⅳ(rHNTX-Ⅳ)被释放出来...     

芋螺毒素ImI的化学合成及其杀虫活性研究

为研究芋螺毒素Im I的杀虫活性,本研究采用化学方法合成芋螺毒素线性肽,经氧化折叠后质谱鉴定获得芋螺毒素Im I,采用MTT法和昆虫注射法研究其杀虫活性。结果表明采用化学合成法可以成功合成芋螺毒素线性肽,经氧化折叠后质谱鉴定形成2个二硫键;活性实验表明芋螺毒素Im I具有抑制昆虫细胞sf9生长的活性,半数有效量为0. 13 n M;对黄粉虫具有杀虫活性,半数致死剂量为0. 11μg/mg。通过化学合成法可以有效合成芋螺毒素Im I,其具有良好的杀虫活性,可为研发新型多肽类生物杀虫剂奠定基础。     

α-芋螺毒素lt1a的纯化与鉴定

芋螺毒素是芋螺毒液管中所分泌的富含半胱氨酸和各种翻译后修饰的多肽混合物.从信号芋螺毒液中纯化出一系列天然多肽.其中L3组分经N端序列测定以及酶切质谱分析,确定其一级序列为GVWDγCCKDPQCRQNHMQHCPA,其中γ为羧基化谷氨酸.该毒素具有典型的α-芋螺毒素半胱氨酸骨架,被命名为lt1a,是迄今为止被报道的最长的一条α-芋螺毒素.     

新型抗虫活性肽雷氏大疣蛛毒素4596的纯化与鉴定

雷氏大疣蛛是我国新近鉴定的蜘蛛新种,虽然动物学家们已经对其进行过分类地位与生态学特性研究,然而有关抗昆虫活性成分研究的报道较少.通过比较解剖蜘蛛毒囊、乳胶软管诱导与电脉冲刺激3种蜘蛛毒液采集技术,发现雷氏大疣蛛毒液的最佳采集方法是电脉冲刺激采毒法.该蜘蛛粗毒对蜚蠊50%致死剂量LD50值是1.486 mg/g.结合阳离子交换层析和反相高效液相色谱技术从该蜘蛛粗毒中分离纯化到一种新型多肽毒素,根据质谱分析确定其相对分子质量为4 596.38,该毒素被命名为雷氏大疣蜘蛛毒素-4596(raventoxin-4596,RVTX-4596).通过初步毒性实验证实RVTX-4596是一种新型抗昆虫毒素.     

Thr28突变对虎纹捕鸟蛛毒素-Ⅳ钠通道活性的影响

虎纹捕鸟蛛毒素-Ⅳ(HWTX-Ⅳ)是从虎纹捕鸟蛛粗毒中分离纯化到的一种新型多肽类神经毒素,能明显抑制表达于大鼠背根神经节细胞的河豚毒素敏感型(TTX-S)钠通道.为了更好地研究该毒素的结构与功能之间的关系,采用芴甲氧羰基(Fmoc)固相多肽化学合成法合成了用谷氨酸(Glu)替代HWTX-Ⅳ第28位苏氨酸残基的突变体T28D-HWTX-Ⅳ,线性多肽合成产物经反相高效液相色谱(HPLC)分离纯化后进行谷胱甘肽氧化复性.复性产物采用基质辅助激光解析飞行时间质谱(MALDI-TOF/TOF MS)技术鉴定分子质量,通过全细胞膜片钳电生理技术测定其电压门控钠通道药理学活性.当第28位Thr残基被Glu取代后,突变体T28D-HWTX-Ⅳ对表达于大鼠DRG细胞膜上的TTX-S钠通道的IC50值约为362 nmol/L,对TTX-S钠通道的抑制活性比天然HWTX-Ⅳ(IC50值=30 nmol/L)下降了约12倍,显示第28位的Thr残基是HWTX-Ⅳ与TTX-S型钠通道相互作用的关键活性残基.目前的研究为进一步探索HWTX-Ⅳ的结构与功能关系及新型镇痛药物的研发奠定了基础.     

敬钊毒素-V对Kv4.3通道的抑制作用

K+通道亚型Kv4.3在调节心肌细胞动作电位的幅度与时程方面具有重要作用,是治疗心律失常的有效作用靶点,但目前世界上该通道的特异性抑制剂非常缺乏。敬钊毒素-V(Jingzhaotoxin-V,JZTX-V)是从敬钊缨毛蜘蛛粗毒中纯化到的一种新型肽类神经毒素,能够部分抑制大鼠背根神经节细胞上的瞬时外向K+电流,其半数有效抑制浓度(IC50值)为52.3nmol/L。为了研究JZTX-V对Kv4.3通道的作用,本实验通过多肽固相化学合成的方法得到JZTX-V,并用双电极杆电压钳技术检测JZTX-V对表达在非洲爪蟾卵母细胞上的Kv4.3通道电流的作用。结果显示,JZTX-V能够完全抑制Kv4.3通道电流,并且这种抑制作用具有浓度依赖性和时间依赖性,其IC50值为425.1nmol/L,JZTX-V还能够使通道的电流-电压关系曲线和稳态失活曲线分别向去极化方向漂移大约29mV和10mV,改变Kv4.3通道的动力学特征,因此我们推测JZTX-V是一种Kv4.3通道门控调制毒素。以上研究结果对于开发心肌Kv4.3通道的分子探针及以Kv4.3通道为靶点的药物设计具有借鉴作用。     

新型东亚钳蝎小分子成分的生化性质及其对大鼠心室肌细胞Ito的作用

分离纯化获得了两个东亚钳蝎小分子活性多肽ＢｍＰ０２和ＢｍＰ０３。经质谱鉴定二者皆为单一峰,分子量分别为２．９５０ｋＤ和２．９３５ｋＤ。ＢｍＰ０２的氨基酸序列已被测定。用全细胞膜片箝方法记录到ＢｍＰ０２对大鼠心室肌细胞短暂外向钾电流（Ｉｔｏ）具有明显的抑制作用（ｎ＝５）,冲洗后可部分恢复,且其抑制活性具有浓度依赖性和电压非依赖性。进一步研究表明,ＢｍＰ０２可影响短暂外向钾通道的失活化和恢复过程,但却不影响其激活过程     

桶形芋螺毒液蛋白质组分析及二硫键异构酶的鉴定

蛋白质二硫键异构酶(PDI)是内质网新生肽链折叠中一个重要的折叠酶。在热带药用海洋生物芋螺的毒液中,富含PDI酶,该酶对于毒液中芋螺毒素神经肽的体内氧化折叠至关重要。研究上样量、水化方式与时间、除盐步骤、聚焦电压和时间、平衡时间、凝胶电泳方法和染色方法等方面,优化并建立了较为理想的芋螺毒液蛋白样品双向电泳的实验条件与方法;通过双向电泳和MALDI-TOF-MS质谱分析技术,从海南产桶形芋螺(Conus betulinus Linnaeus)毒液蛋白中成功分离鉴定出PDI等9种蛋白;通过双向电泳和PDQuest软件分析了并比较了三种不同大小桶形芋螺毒液总蛋白的差异性,并质谱鉴定出5个明显的差异蛋白点。研究建立了桶形芋螺毒液蛋白双向电泳分析及质谱鉴定的技术方法,为后续大量分离纯化出天然的芋螺PDI酶以及利用蛋白质组学技术方法深入研究芋螺毒液特征提供了重要的基础。     

M-超家族芋螺毒素研究进展

芋螺毒素是来源于芋螺毒液的活性多肽,具有分子质量小,作用靶点广泛且特异性高的优点,是一种丰富的生物资源。M-超家族芋螺毒素是芋螺毒素中较为复杂的超家族之一,包括μ-、ψ-和κM-家族,分别作用于电压门控钠通道、N型乙酰胆碱受体和电压门控钾通道。另外,mr3a和tx3c的发现预示M-超家族可能存在新的家族。本文对这些芋螺毒素的生理学和药理学特征、结构与功能的关系及应用研究进行综述。     

Lys4突变对敬钊缨毛蛛毒素-V钠通道活性的影响

敬钊缨毛蛛毒素-V(jingzhauotoxin-V,JZTX-V)是从敬钊缨毛蛛粗毒中纯化到的一种新型河豚毒素不敏感型钠通道抑制剂,为了深入研究该毒素的结构与功能关系,应用芴甲氧羰基(Fmoc)固相多肽化学合成方法合成了用丙氨酸(Ala)替代JZTX-V第4位赖氨酸残基的突变体K4A-JZTX-V,合成线性多肽经反相高效液相色谱分离纯化后进行谷胱甘肽氧化复性.复性产物分别用MALDI-TOF/TOF质谱进行相时分子质量的鉴定,用膜片钳电生理方法进行电压门控钠通道抑制活性分析.研究结果表明,Lys4被Ala取代后,K4A-JZTX-V对大鼠背根神经节细胞膜上表达的河豚毒素敏感型(TTX-S)钠通道的抑制活性与天然JZTX-V基本相当,提示Lys4与JZTX-V时TTX-S钠通道的抑制活性关系不大;而K4A-JZTX-V对河豚毒素不敏感型(TTX-R)钠通道的抑制活性却比天然JZTX-V下降了约8.3倍,说明Lye4是JZTX-V与河豚毒素不敏感型钠通道抑制活性相关的氨基酸残基.     

穴居狼蛛毒中一个抗菌活性多肽的鉴定和纯化

从我国新疆地区产穴居狼蛛的毒液中分离纯化了一种多肽——狼蛛抗菌肽(Lycosin)。穴居狼蛛的粗毒在酸性聚丙烯酰胺凝胶电泳中可分出11条蛋白带,用0.6％的大肠杆菌琼脂胶覆盖在凝胶上进行鉴定表明,电泳迁移率最快的区带有抗菌活性。经鉴定该多肽分子系由43至45个氨基酸残基组成,N-末端为丙氨酸,分子中的碱性和疏水性氨基酸分别占总氨基酸残基数的1/4和1/3。     

敬钊毒素-Ⅴ的合成、复性及其钾通道活性鉴定

敬钊毒素-Ⅴ(jingzhaotoxin-Ⅴ,JZTX-Ⅴ)是从敬钊缨毛蛛粗毒中纯化得到的一种新型河豚毒素不敏感型钠通道抑制剂.为了深入研究该毒素的功能,应用芴甲氧羰基(Fmoc)固相方法化学合成了JZTX-Ⅴ,合成多肽经谷胱甘肽法氧化复性后,利用反相高效液相色谱(RP-HPLC)进行分离纯化.复性产物的相对分子质量经质谱测定为3 605.51,而与天然毒素混合进行HPLC共洗脱实验时也只得到单一峰.全细胞膜片钳实验显示,JZTX-Ⅴ能够抑制大鼠背根神经节细胞上的A型钾电流,却对外向延迟整流钾电流没有影响,对处于静息关闭状态的A-型钾通道也表现出较高的亲和性.JZTX-Ⅴ对A型钾通道的这种抑制作用具有浓度依从性, 其半数有效抑制浓度(IC50)为52.3 nmol/L. JZTX-Ⅴ通过引起A型钾通道的活化曲线往去极化方向漂移,和失活曲线往超极化方向漂移来改变通道的门控特征.目前的研究结果为深入开展JZTX-Ⅴ的功能研究及分子改造奠定了基础.     

指形龙隙蛛毒腺中抗凝活性多肽挖掘

目的：有毒动物毒腺分泌大量结构多样和功能丰富的活性多肽,是多肽药物开发的天然宝库。目前仅有一小部分有毒动物活性多肽被研究,因此有必要建立一种更加高效的活性多肽挖掘方法。方法：以指形龙隙蛛为研究对象,通过对毒腺样本进行转录组测序、数据分析与多肽挑选,多肽重组表达制备,体外活性筛选和动物模型体内活性评价等方法,进行抗凝活性多肽的开发。结果：筛选到一种凝血因子Xa抑制剂PDBPE-001,多肽分子量为9 889.82 Da,由92个氨基酸残基组成,有4对二硫键。该多肽可通过重组表达的方式高效制备,对凝血因子Xa的抑制活性呈浓度依赖性,其半抑制浓度约为0.807μmol/L。在体内血栓模型中,30 mg/kg PDBPE-001能起到良好的抗血栓效果。结论：首次从指形龙隙蛛中获得了一个新型Factor Xa抑制剂,为新型抗凝血药物开发提供了一个全新的先导多肽分子。     

虎纹捕鸟蛛毒素虎纹毒素-III对美洲蜚蠊神经细胞电压门控离子通道的影响

HWTX-III是从中国虎纹捕鸟蛛Ornithoctonus huwena粗毒中分离纯化到的一种昆虫神经多肽。通过应用全细胞膜片钳技术研究了HWTX-III对美洲蜚蠊Periplaneta americana神经细胞电压门控离子通道的影响。发现HWTX-III特异性地抑制美洲蜚蠊背侧不成对中间(dorsal unpaired median, DUM）神经细胞的电压门控钠通道(IC50≈1.106 μmol/L),而对电压门控钾通道没有明显的影响。HWTX-III通过一种新型的不同于其他蜘蛛毒素的机制抑制昆虫电压门控钠通道,它不影响通道的激活与失活动力学,也不明显地漂移稳态失活曲线。HWTX-III对昆虫神经细胞电压门控钠通道的特异性与新型作用机制为研究电压门控钠通道分子结构的多样性以及开发新的安全的杀虫剂提供有用的工具。     

海南产桶形芋螺蛋白质二硫键异构酶的鉴定

蛋白质二硫键异构酶(PDI)是内质网新生肽链折叠中一个重要的折叠酶.在热 带药用海洋生物芋螺的毒液中富含PDI酶,该酶对于毒液中芋螺毒素神经肽的体内 氧化折叠至关重要.本研究主要采用凝胶过滤层析和制备型Rotofor液相等电聚焦 电泳等多种方法,从海南产桶形芋螺（Conus betulinus Linnaeus）毒管中分离 纯化天然的PDI酶蛋白,经电泳和MALDI-TOF MS质谱鉴定分析确证获得了高纯度 的桶形芋螺PDI酶,建立了天然芋螺PDI酶分离纯化的技术方法. 以芋螺毒素线性 肽K412为底物进行了PDI酶活性鉴定.结果表明,该分离纯化的PDI酶能够促进K412 的氧化折叠.由于芋螺毒素的氧化折叠非常复杂,且氧化折叠后具有正确二硫键连 接方式的芋螺毒素才具有各种药理活性,因此,本研究结果为后续PDI酶在种类繁 多的芋螺毒素氧化折叠中的应用及其作用机制研究提供了重要的物质基础.     

中药蛴螬多肽Probrelin抗白色念珠菌活性研究

[目的] 研究蛴螬多肽Probrelin对白色念珠菌的抗菌活性。[方法] 采用肉汤稀释法测定蛴螬多肽Probrelin对正常菌株及临床耐药菌株的最小抑菌浓度,同时结合平板计数法测定最小杀真菌浓度;通过不同浓度多肽处理后经平板计数绘制时间-杀菌动力学曲线;通过PI吸收实验检测多肽对白色念珠菌细胞膜完整性的影响;通过核酸阻滞实验检测多肽与核酸间是否具有结合作用;通过扫描电子显微镜检测多肽对白色念珠菌形态的影响;通过结晶紫染色法检测多肽对生物膜生成及成熟生物膜的影响;通过显微镜观察多肽对白色念珠菌菌丝形成的影响;通过棋盘法检测多肽与抗真菌药物间的相互效应;通过小鼠皮下感染模型检测多肽在生理条件下的抗白色念珠菌活性。[结果] 蛴螬多肽Probrelin对正常菌株及临床耐药菌株的最小抑菌浓度均为100 μg/mL,最小杀真菌浓度为100-200 μg/mL,且对白色念珠菌的杀菌动力学具有时间和浓度依赖性;该多肽以浓度依赖性的方式影响白色念珠菌细胞膜的完整性,并通过破坏白色念珠菌细胞壁的结构影响其形态,但与核酸间不具有结合作用;该多肽既可抑制白色念珠菌生物膜的形成,又可清除成熟生物膜,同时还可抑制白色念珠菌菌丝的形成;该多肽与抗真菌药物Clotrimazole间具有协同效应;在小鼠皮下感染模型中,该多肽可以有效杀灭白色念珠菌,进而抑制感染。[结论] 蛴螬多肽Probrelin对白色念珠菌具有良好的抑制杀灭活性,可以作为新的药物分子或模板分子用于抗白色念珠菌药物的研发。     

脱氧鬼臼毒素对美洲大蠊背侧不成对中间神经元电压

目的:探讨脱氧鬼臼毒素(DOP)对美洲大蠊背侧不成对中间神经元(DUM)电压依赖性钾电流IK的影响。方法:采用全细胞膜片钳技术研究脱氧鬼臼毒素对美洲大蠊背侧不成对中间神经元电压依赖性钾电流的电流幅度,电流-电压关系以及激活曲线的影响。结果:DOP能够抑制电压依赖性钾通道电流的幅度,而且此抑制作用具有浓度依赖性(5、10、20、40μmol/L)。DOP抑制IK的半数抑制浓度(IC50)值为18.064μmol/L。20μmol/L DOP能使IK的电流-电压关系曲线下移,并能使IK的激活曲线向去极化方向移动。结论:DOP对美洲大蠊背侧不成对中间神经元(DUM)电压依赖性钾电流具有抑制作用,这可能是其杀虫作用的机制之一。