酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶基因(PGK1)启动子片段的亚克隆

含有3-磷酸甘油酸激酶基因(PGK1)的酿酒酵母染色体3.1kb HindⅢ片段,已被克隆到大肠杆菌-酵母菌穿梭载体pCN60上。Kpn Ⅰ核酸内切酶在pCN60上没有酶切位点,而在pCN60(PGK1)上仅有一酶切位点。用此酶将pCN60(PGK1)质粒完全酶切,再用Bal31从两端逐步消解碱基对,使反应终止于每端消解500bp左右,加上EcoR Ⅰlinker。用EcoRⅠ、BamH Ⅰ酶切,分离1. 9kb的DNA片段,插入用同样双酶切的酵母启动子探针载体pVC727上,转化E.coli C600,再从转化子中提取重组质粒转化酵母受体菌NA87-11A。用菌落染色法筛选出PHO5基因高效表达转化子,这个转化子质粒含有1.9kb的BamH Ⅰ、EcoRⅠ酶切片段,它具有强启动子功能,并测定其3'末端序列。     

酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶基因(PGK1)启动子片段的亚克隆

含有3-磷酸甘油酸激酶基因(PGK1)的酿酒酵母染色体3.1kb HindⅢ片段,已被克隆到大肠杆菌-酵母菌穿梭载体pCN60上。Kpn Ⅰ核酸内切酶在pCN60上没有酶切位点,而在pCN60(PGK1)上仅有一酶切位点。用此酶将pCN60(PGK1)质粒完全酶切,再用Bal31从两端逐步消解碱基对,使反应终止于每端消解500bp左右,加上EcoR Ⅰlinker。用EcoRⅠ、BamH Ⅰ酶切,分离1. 9kb的DNA片段,插入用同样双酶切的酵母启动子探针载体pVC727上,转化E.coli C600,再从转化子中提取重组质粒转化酵母受体菌NA87-11A。用菌落染色法筛选出PHO5基因高效表达转化子,这个转化子质粒含有1.9kb的BamH Ⅰ、EcoRⅠ酶切片段,它具有强启动子功能,并测定其3'末端序列。     

酵母菌色氨酸合成酶基因的克隆与表达

用RemHI酶切酿酒酵母(Saceharomyces cercuisiae) 1412-4D染色体DNA,通过蔗糖梯度分离2-4kb DNA片段并插入穿棱质粒pCN60,构成1412-4D基因文库。从基因文库中提取重组质粒,转化受体菌C9(a,trp5,adcl,ade6),用直接功能互补法,分离到9株重组质粒,它们都含有3．2kb的TRP5 DNA片段,分别命名为pCN60(trps)1-90转化体中色氨酸合成酶的酶活水平比原始菌株1412-4D高3倍。     

扣囊拟内孢霉α-淀粉酶基因的克隆和在酿酒酵母中表达

以穿梭质粒pCN60为载体,大肠杆菌C600为受体构建了扣囊拟内孢霉(Endomycopsis fibuligera)G45 Sau 3A基因文库。从基因文库中提取重组质粒DNA并转化酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)BJ1991,选出四个具有o-淀粉酶活性的转化子,琼脂糖凝胶电泳结果证实插入的DNA片段为9.0kb。对插入DNA片段亚克隆,确定。-淀粉酶基因位于PstI-Sall 3.9kb片段上,启动子位于PstI-EcoRI 的1.3kb片段上。用亚克隆PGK11.9kb片段置换。-淀粉酶启动子区,其转化子的e-淀粉酶活性有明显提高。     

蚕豆叶绿体DNA BamH I克隆库的构建及含16S-25S rRNA基因克隆的分析

蚕豆叶绿体DNA(ct—DNA)经BamH I酶切产生26个片段,最大的为14．00kb,最小的为0．42kb。本文以pBR322为载体,E．Coli HB101为受体菌,采用标准分子克隆法构建了蚕豆ct—DNA BamH I克隆库,并从库中分离得到含叶绿体rRNA基因的克隆。32P标记的E．Coil 16S、23S rRNA能和蚕豆ct—DNA BamH I第6(B₆,5．65kb)和第9(B₉,4．70kb)个片段杂交,含有这二个片段的克隆分别命名为pVFB32和pVFBl6。利用几种限制性内切酶酶切和Southern印迹法构建了pVFBl6的物理图谱。pVFBl6电镜下观察到有一变性环(A—T丰富区),经Hind I酶切,电镜观察定位此A—T丰富区位于16S和23S rRNA基因的间隔顺序内,推测该环可能与DNA复制有关。     

转座子Tn233(CH)链霉素敏感突变种及其回变种的研究

转座子Tn233-1(CH)是Tn233(CH)的链霉素敏感突变种,比较了突变种质粒pBR322:: Tn233-1(CH)DNA和野生型质粒pBR322::Tn233(CH)DNA的EcoRⅠ、BamHⅠ、HindⅢ与PstI限制性内切酶图谱,结果表明Tn233-1(CH)中带链霉素抗性基因的限制片段H3上插入了一个约800bp长的IS因子,在这个插入的DNA片段上有一个PstI切点而没有EcoRⅠ、BamHⅠ及HindⅢ切点。 对链霉素抗性回变种的质粒DNA pBR322:: Tn233-1-R(CH)的限制图谱加以分析后表明,插入在H3限制性片段上的IS因子已经切除,但是限制片段E2与E3的长度发生了改变。此外,在限制片段E2上出现了一个新的IS插入片段,在这一插入片段上有一个HindⅢ与PstⅠ切点。我们对此突变与回变的机理进行了讨论。     

扣囊拟内孢霉α-淀粉酶基因的克隆和在酿酒酵母中表达

以穿梭质粒pCN60为载体,大肠杆菌C600为受体构建了扣囊拟内孢霉(Endomycopsis fibuligera)G45 Sau 3A基因文库。从基因文库中提取重组质粒DNA并转化酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)BJ1991,选出四个具有o-淀粉酶活性的转化子,琼脂糖凝胶电泳结果证实插入的DNA片段为9.0kb。对插入DNA片段亚克隆,确定。-淀粉酶基因位于PstI-Sall 3.9kb片段上,启动子位于PstI-EcoRI 的1.3kb片段上。用亚克隆PGK11.9kb片段置换。-淀粉酶启动子区,其转化子的e-淀粉酶活性有明显提高。     

环状芽孢杆菌C-2几丁酶基因的克隆

环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)C-2总DNA经PstI部分酶切后分离2～10kb的片段,插入质粒pUC19的PstI位点,转化大肠杆菌(Escherichia coli),利用几丁质平板从约8000个重组子中筛选到一个几丁酶基因阳性克隆(命名为pCHT1)。用12种限制酶对重组质粒进行的酶切分析表明,重组质粒中的插入片段长3.0kb,其中各有一个KpnI,SacI和SspI位点。把该克隆片段反向插入pUC19的PstI位点所得到的重组子同样具有几丁酶基因表达活性,说明此片段含有一个完整的几丁酶基因,其自身的启动子能被大肠杆菌转录系统所识别。Southern杂交证实了该片段来自于B.circulans C-2基因组,且以单拷贝形式存在,它不能与来自于其它7株几丁酶产生菌的总DNA杂交。     

番茄1-氨基环丙烷羧酸(ACC)合成酶基因的反义RNA-核酶嵌合DNA序列的构建

根据番茄ACC合成酶基因（LE—ACC2）DNA序列,以番茄(LycopersiconesculentumMill)果实的总DNA为模板,利用PCR技术扩增得到预期大小的该基因编码区内部分DNA序列,插入到质粒载体pGEM—3zf(＋)的BamHⅠ和HindⅢ位点之间后转化E．coliDH—5α,可选出重组子pRE,经酶切,PCR及DNA序列分析证明克隆成功;将pRE上的目的DNA序列以反义方式构建到我室已合成并克隆的含核酶DNA序列的重组质粒pRⅠ的BamHⅠ和HindⅢ之间,构成含有反义RNA-核酶嵌合DNA序列的重组质粒pREⅠ,经酶切及序列分析,结果与预期一致.     

糖化酶基因的克隆和在酿酒酵母中表达

以穿梭质粒pLCl为载体,大肠杆菌C600为受体构建了扣囊拟内孢霉(Endomycopsis fibuligera)Sau34基因文库。从基因文库中提取重组质粒DNA,转化酿酒酵母BJ1991,选出具有淀粉水解酶活性的转化子,它含有编码扣囊拟内孢霉胞外糖化酶的基因片段,能发酵淀粉。琼脂糖凝胶电泳证明所插入DNA片段为5.3kb,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测得糖化酶的分子量为54000。酶活最适温度为50℃,最适pH为5.5。     

螺旋霉素聚酮合成酶基因和抗性基因的克隆与表达的研究

根据不同聚酮合成酶基因DNA的同源性,利用放线紫红素聚酮合成酶基因act Ⅰ,actⅢ作探针,从螺旋霉索产生菌Str．spiramyceticus U-1941基因文库中检测并分离了螺旋霉素聚酮合成酶基因pCN3H8。限制酶酶切分析表明,其分子量为44kb。通过分子杂交实验,将螺旋霉素聚酮缩合酶基因(与act Ⅰ有同源性)及聚酮氧化还原酶基因(与actⅢ有同源性)进行了定位。pCN3H8 DNA在麦迪霉素产生菌变株Str.mycarofaciens sub sp．68中的表达产物,经紫外光谱分析与麦迪霉素相似。pCN3H8在放线紫红素聚酮缩合酶基因缺陷型变株Str．coelicolor TKl7中的表达产物,不具有放线紫红素的色素,其纸层析谱型与螺旋霉素有显著差别。pCN3H8在变青链霉菌Str．lividans TK24中的表达产物,也具有抗菌活性。将pCN3H8 DNA转化对螺旋霉素敏感的Str.griseofuscus原生质体,获得了螺旋霉素抗性的表达。从转化子中分离得到了质粒DNA pSG3,其分子量为7．0kb,可能是pCN3H8DNA转化Str．grlseofuscus时在体内缺失而形成。再转化实验证明,宿主菌对螺旋霉索的抗性,确实是由于pSG3 DNA作用的结果。含质粒pCG4,pSG3的螺旋霉素产生菌Str．Ambofaciens转化子螺旋霉素的产率明显提高。     

成熟志贺毒素全长与截短A亚单位在E.coli中的表达及纯化

应用PCR技术从Ⅰ型痢疾志贺菌(Shigella dysenteriaetype I)中,扩增出约895 bp的成熟ShT-A基因片段,克隆至pGEM-T载体中,经蓝白斑筛选、PCR和双酶切鉴定正确后,命名为pGEM-TA2。测序结果表明,ShT-A与GenBank中ShT-A序列完全一致。用BamHⅠ和KpnⅠ双酶切克隆质粒,得到为895 bp成熟ShT-A与pQE30原核重组表达载体连接,构建原核重组表达质粒。经IPTG诱导,SDS-PAGE电泳观察,没有目的蛋白表达。DNAsis软件分析ShT-A基因序列,发现513 bp处有HindⅢ位点,故以ShT-A上游引物的BamHⅠ和HindⅢ从pGEM-TA2切出一个513 bp的截短片段,重新插入pQE30表达载体,得到pQE30-A513重组表达质粒,转化E.coliM15,经IPTG诱导,SDS-PAGE电泳观察,在20 ku处出现1条特异性的表达蛋白带,与截短ShT-A513分子量相符,表达量约占菌体总蛋白的37.4%,表达形式为包涵体。为抗体的制备提供了必要的物质基础。     

酵母菌基因工程载体——pCN系杂种质粒的构建及其特性的研究

pCN系质粒是利用DNA重组技术,以YRp7和pAT153为原始质粒所构建的酵母菌基因工程载体。pCN系质粒由酵母菌TRPL基因的1．4 kb DNA片段和完整的pAT 153分子组成。根据pAT153质粒中所插入的TRPl DNA片段的方向性,pCN质粒有两种不同的构型。在性质上,pCN系质粒保留了 YRp7高转化能力和pAT153高拷贝水平,同时它在酵母受体中的稳定性比’YPp7明显提高。pCN质粒中尤以pCN60可作为酵母基因工程的载体。     

酵母甘油醛—3—磷酸脱氢酶(GPD)基因及其启动子的分离和鉴定

以大肠杆菌质粒pBR322为载体进行了野生型酿酒酵母(S.cerevisiae)的基因组克隆。以人工合成的寡聚核苷酸(3’GTGCGTACATAGATAGAGTA5’)为探针进行分子杂交,分离到的阳性克隆经限制性内切酶酶谱、southem杂交分析证实,插入序列中的2．1kb Hind Hi片段含有GPD基因。其中650bpTaq I片段的部分序列分析结果初步表明,该区域可能包含了高表达GPD基因的启动子。     

含花生根瘤菌吸氢基因重组质粒pZ-55的特性分析

应用含豌豆根瘤菌部分吸氢基因的探针及PCR分析,从花生根瘤菌基因文库中筛选到含有吸氢基因的重组质粒pZ-55。用BamHⅠ、EcoRⅠ和KpnⅠ等内切酶对pZ-55 进行酶切分析,构建了pZ-55的酶切物理图谱。经三亲本杂交分析,pZ-55能互补诱变株Ln-1（Hup     

谷氨酸棒状杆菌质粒pXZ 10145的限制酶图谱和嵌合质粒的组建

从谷氨酸棒状杆菌中已经分离到质粒pxzl0145,该质粒带有氯霉素抗性。通过电子显微镜和BamH I酵切后在1％琼脂糖凝胶电泳上测定pXZl0145质粒的大小为5．3kb。用Bam—HI、PstI、EcoRI、saII等限制酶进行酶切,并用BamH I+sa1 I、BamH I+Pst I、Pst I+sal I、EcoR I+Pst I、EcOR I+BamH I等双重酶切,得到pxzlol45限制性内切酶的图谱。证明BamH I和Pst I为单一酶切点。将pxzl0 145与pBR322利用BamH I切点连接得到一嵌台质粒pxz34。这一质粒能在大肠杆菌中复制,在大肠杆菌中表现有氨苄青霉素和氯霉素的抗性,但是抗氯霉素的能力大大降低,只抗2Y／ml。     

鲤鱼肝组织线粒体DNA的限制性内切酶分析

用EcoRⅠI,HindⅢ,PstⅠ,BglⅡ,BamHⅠ,Xho Ⅰ, Xba Ⅰ, Sal Ⅰ和Kpn Ⅰ共9种限制性内切酶酶切对鲤鱼肝组织的mtDNA进行酶解,利用Gel-Pro Analyzer算出各酶切片段长度及mtDNA大小,测出其大小约为16．61kb(1kb=1×103b),另外,对电泳条件的优化进行了探讨,并将实骚结果与以前报道的有关酶切实验结果进行了比较,表明鲤鱼mtDNA的长度及限制性酶切位点均存在地域差异．     

苏云金芽胞杆菌cryⅡ基因的克隆和表达

分离的苏云金芽胞杆菌(Bacillus-thuringiensis)YBT-791对鳞翅目小菜蛾(Plutellaxylostella)有毒力,将其质粒DNA提纯,经HindⅢ酶切后与杀虫晶体蛋白cryⅡ基因探针杂交,显示出分子量分别为5kb和9．4kb两条DNA阳性片段。把5kb的DNA阳性片段克隆到pUCl8的HindⅢ位点上并转化大肠杆菌TGl,经酶切和杂交检测,证明斑点杂交阳性克隆子中含有5kb的cryI片段。把这个含cryⅡ基因的5kbHindⅢ片段进行亚克隆,将4kb的BamHI－Pstl酶切片段插入穿梭载体pXl61中,并用电脉冲法克隆于苏云金杆菌不产伴胞晶体的突变株中,得到产生单一cry Ⅱ基因编码的杀虫晶体蛋白的克隆菌株M一5。经电镜观察,该克隆菌株能形成出发菌YBT－791多种形态伴胞晶体中的一种方形伴胞晶体;经免疫双扩试验,它只能与Cry Ⅱ晶体蛋白抗血清形成沉淀线;经SDS—PAGE电泳,克隆菌的伴胞晶体只含有一种65kDa的晶体蛋白。生物测定结果表明它既对鳞翅目小菜蛾(Piutella xylostella)有毒性,又对双翅目致倦库蚊(Culex quinquefasciatus)有毒性。     

番茄1―氨基环丙烷羧酸(ACC)合成酶基因的反义RNA―核酶嵌合DNA序列的构建 The Construction of Antisense RNA-Ribozyme Chimeric DNA Sequence of Tomato ACC Synthase Gene

根据番茄ACC合成酶基因(LE-ACC2)DNA序列,以番茄(Lycopersicon esculentumMill)果实的总DNA为模板,利用PCR技术扩增得到预期大小的该基因编码区内部分DNA序列,插入到质粒载体pGEM-3zf(+)的BamHⅠ和HindⅢ位点之间后转化E. coliDH-5α,可选出重组子pRE,经酶切,PCR及DNA序列分析证明克隆成功;将pRE上的目的DNA序列以反义方式构建到我室已合成并克隆的含核酶DNA序列的重组质粒pRI的BamHⅠ和HindⅢ之间,构成含有反义RNA-核酶嵌合DNA序列的重组质粒pREI,经酶切及序列分析,结果与预期一致。 Abstract　According DNA sequence of Tomato ACC synthase gene(LE-ACC2)。5,Y#〗　Abstract　According DNA sequence of Tomato ACC synthase gene(LE-ACC2), and using total DNA of fruit of tomato (Lycopersicon esculentumMill) as template, the expected partial DNA Sequence in coding region of gene was obtainted by PCR amplification and inserted imto pGEM-3zf(+) digested with BamHⅠ and HindⅢ, then we transformcd the system into DH5-α and selected the postive recombinant (pRE). The digestion of enzyme, PCR amplification and sequence of DNA analysis demonstrated that the cloning was successiful; By the antisense way, the DNA sequence from pRE was combined to pRI between BamHⅠand HindⅢ to consturct pREI containing antisense RNA-Ribozyme chimeric DNA sequence (pRI was constructed in our Lab and contains Ribozyme DNA sequence). The restriction map of recombinants and sequence analysis were indentical to the expected results.