碳水化合物的合成研究——Ⅰ.D-果糖-1-磷酸酯及 D-果糖的酶促合成

本文报道了用化学与酶促相结合的方法,由二羟基丙酮磷酸酯与D-甘油醛在兔肌醛缩酶的存在下进行酶促不对称合成,一步缩合得到D-果糖-1-磷酸酯,经酸水解后得到结晶D-果糖。用同样的方法,以DL-甘油醛代替D-甘油醛则得到D-果糖-1-磷酸酯和L-山梨糖-1-磷酸酯的混合物。用钙盐结晶的方法分离,得到D-果糖-氯化钙结晶,除去氯化钙后得到单一的结晶D-果糖。母液在Dowex-1 B_4O~-_7型树脂进行梯度淋洗得到L-山梨糖结晶。     

生物法合成稀有己酮糖的研究进展

稀有糖是一类在自然界中存在但含量很低、同时具有重要生理功能的一类单糖及其衍生物,在膳食、保健、医药等领域中发挥着重要的作用。此外稀有糖还可以作为多种天然产物和药物的合成前体。然而稀有糖的合成成本较高,大大制约了其广泛应用。当前利用微生物和酶转化法合成稀有糖成为一种强有利的工具。综述了生物法合成稀有己酮糖(包括D-塔格糖、D-山梨糖、D-阿洛酮糖、L-塔格糖、L-果糖、L-山梨糖和1-脱氧-L-果糖等)的研究进展,探讨了稀有己酮糖合成策略的研究趋势。     

以D-果糖为原料利用新型异构酶转化生产D-阿洛糖

稀少糖是自然界中含量稀少、化学合成困难的一类低热量单糖。D-阿洛糖是一种重要的稀少己醛糖,其具有减少活性自由基、抑制癌细胞增殖等独特的生理学功能。因此,以微生物发酵生产D-阿洛酮糖-3-差向异构酶(DPE)和L-鼠李糖异构酶(L-RhI)转化生产D-阿洛糖,成为近几年来国际研究的热点之一。文中分别克隆了来源于解纤维梭菌Clostridium cellulolyticum H10的DPE基因以及来源于枯草芽胞杆菌Bacillussubtilis 168的L-RhI基因,并分别使其在宿主菌B.subtilis及大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)中得到了表达。进一步利用镍亲和层析和阴离子交换色谱等手段对这两种酶进行了纯化,并对这两种纯化后酶的转化能力进行了分析测定。结果表明,以D-果糖为原料利用两种异构酶依次转化获得D-阿洛酮糖及D-阿洛糖,其两步转化效率分别为27.34%和34.64%。     

双酶偶联转化果糖制备含有稀少糖的混合糖液

酶转化法是功能性稀少糖生产的重要途径,但单一稀少糖转化酶的转化率普遍较低。文中提出构建双酶偶联转化系统提高转化效率的思路,即利用D-阿洛酮糖3-差向异构酶(D-psicose 3-epimerase,DPE)和L-鼠李糖异构酶(L-rhamnose isomerase,L-RhI)双酶偶联反应,催化D-果糖生成D-阿洛酮糖和D-阿洛糖等功能性稀少糖。DPE和L-RhI加酶量的比例为1∶10,其中DPE的浓度为0.05 mg/mL;转化反应的最佳温度为60℃,最适pH为9.0。当D-果糖浓度为2%时,反应10 h达到平衡,此时D-阿洛酮糖和D-阿洛糖的产量分别为5.12和2.04 g/L。利用文中提出的双酶偶联系统可以将果葡糖浆等富含果糖的低附加值原料转化为含有功能性稀少糖的高附加值混合糖液。     

用甘露糖异构酶从D-果糖生产D-甘露糖

D-甘露糖是合成甘露醇、药物和糖蛋白中糖链的原料。最近又发现D-甘露糖能抑制沙门氏菌的生长,可用做家禽饲料添加剂,预防细菌污染。D-甘露糖是用植物甘露聚糖,酸解制备的,或由葡萄糖经钼催化的差向异构作用制备,因此价格十分昂贵。 甘露糖异构酶可将D-果糖可逆性转化成D-甘露糖。新近从土壤中分离到的假单胞菌MI可以产生耐热甘露糖异构酶。 假单胞菌甘露糖异构酶的最适活性温度约为60℃(在0.1MD-甘露糖,pH7.0条件下反应30分钟)。温度高于50℃酶不稳定。在测试过的糖类中只     

蔗糖:蔗糖-1-果糖基转移酶的表面展示及酶学性质分析

【目的】蔗糖:蔗糖-1-果糖基转移酶催化1分子蔗糖上的果糖基转移到另一个蔗糖分子上,形成1-蔗果三糖和葡萄糖。在低聚果糖中,1-蔗果三糖益生素活性最高。本研究将该酶展示在酵母菌细胞表面上,并用于1-蔗果三糖的制备。【方法】将来自莴苣的蔗糖:蔗糖-1-果糖基转移酶基因克隆到用于酵母细胞表面展示的表达载体上,并在解脂亚罗酵母菌中进行异源表达,表达的酶展示在该细胞表面上,然后以蔗糖为底物,研究表面展示的蔗糖:蔗糖-1-果糖基转移酶的性质。【结果】免疫荧光实验结果表明蔗糖:蔗糖-1-果糖基转移酶已展示在酵母菌的细胞表面上,高效液相色谱结果表明酵母表面展示的该酶具有转移酶的催化活性。该酶的最适作用温度、最适作用p H分别为45°C和7.5;该酶的催化活性受Zn2+和Cu2+的抑制,受Ca2+激活;该酶重复使用7次后,酶活下降50%。表面展示的蔗糖:蔗糖-1-果糖基转移酶和3%蔗糖混合后在40°C条件下孵育30 min后,所产1-蔗果三糖含量最高为20.8 mmol/L。【结论】蔗糖:蔗糖-1-果糖基转移酶在解脂亚罗酵母菌中得到成功表达,并展示在其细胞表面上,生化研究表明该重组蛋白具有果糖基转移酶活性,且催化蔗果三糖的生成。表面展示的蔗糖:蔗糖-1-果糖基转移酶作为一种全细胞催化剂能够用于1-蔗果三糖的制备。     

链霉菌来源D-甘露糖异构酶的性质及其在制备D-甘露糖中的应用

【背景】D-甘露糖具有多种功能活性,在食品、医药、饲料等行业应用广泛。D-甘露糖异构酶可以催化D-果糖与D-甘露糖之间的相互转化,在D-甘露糖的酶法制备中具有应用潜力。【目的】克隆一个链霉菌(Streptomycessp.)来源的D-甘露糖异构酶基因(ssMIaseA)并在大肠杆菌中表达,研究其酶学性质,并用于制备D-甘露糖。【方法】从链霉菌(Streptomycessp.)中发掘一个D-甘露糖异构酶基因(ssMIaseA),构建重组表达质粒pET-28a-ssMIaseA并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,经Ni-NTA亲和层析纯化后测定酶学性质,利用高效液相色谱对SsMIaseA制备D-甘露糖进行研究。【结果】SsMIaseA与嗜热裂孢菌(Thermobifda fusca)来源的D-甘露糖异构酶ManI相似性最高,为60.2%。该酶比酶活为525 U/mg,分子量约为45 kD,最适pH和温度分别为7.5和45°C,在pH 6.5-10.0范围内和45°C以下保持稳定。该酶对甘露糖具有最高催化活性,其次是果糖、塔罗糖和塔格糖。利用SsMIaseA转化600 g/L D-果糖,反应8 h达到平衡,生成185 g/L D-甘露糖,转化率为31%。【结论】SsMIaseA作为新型D-甘露糖异构酶为D-甘露糖的酶法制备奠定了基础。     

重组共表达大肠杆菌细胞从D-葡萄糖一锅法生产D-甘露糖

【背景】D-甘露糖的酶促转化方法已受到相当大的关注。【目的】研究D-葡萄糖异构酶(D-glucoseisomerase,D-GIase)和D-来苏糖异构酶(D-lyxoseisomerase,D-LIase)共表达于大肠杆菌细胞生产D-甘露糖的工艺条件。【方法】将D-GIase和D-LIase基因片段合成后酶切连接到载体p CDFDuet-1上,构建p CDFDuet-Acce-DGI/Peba-DLI重组质粒并导入到大肠杆菌BL21(DE3)中共表达,通过摇瓶培养得到产D-GIase和D-LIase的菌体,测定该共表达细胞体系的反应条件。【结果】添加1 mmol/L Co~(2+),共表达体系酶的最适温度和p H分别为70°C和6.0。以浓度分别为100、300、500 g/L的D-葡萄糖为底物生产D-甘露糖,平衡后D-甘露糖质量浓度分别为13.8、38.1、62.6 g/L,相应的转化率分别为13.8%、12.7%、12.5%,D-葡萄糖、D-果糖和D-甘露糖的平衡比约为50:37.5:12.5。【结论】D-GIase和D-LIase在大肠杆菌细胞中组成的共表达体系通过一锅法可利用D-葡萄糖为底物生产D-甘露糖。     

白地霉中甘露醇的鉴定及其形成机制的研究

(1)白地霉菌絲中含有大量的多元醇,經紙层析、紙电泳及提純結晶制备衍生物等方法鉴定为甘露醇。(2)白地霉无細胞提取液中有NADP-甘露醇脫氫酶存在,催化甘露醇被NADP氧化为果糖或相反地果糖被NADPH_2还原为甘露醇。(3)白地霉无細胞提取液中有磷酸酯酶,催化果糖磷酸酯水解为自由果糖及无机磷酸。(4)白地霉中測不出果糖-6-磷酸还原酶活力。(5)确定了甘露醇的形成途径为: D-果糖磷酸→Pi→D-果糖←NADPH_2 NADP→D-甘露醇(6)D-木糖培养的白地霉适应形成了NAD-艾杜糖醇脫氫酶,催化: 木糖醇←NAD NADH_2→D-木酮糖D-山梨醇←NAD NADH_2→D-果糖     

酮古龙酸菌与呼吸链偶联的2-KGA代谢途径研究进展

酮古龙酸菌可将底物L-山梨糖转化为维生素C的前体2-酮基-L-古龙酸(2-KGA)。该菌共存在5种反应参与2-KGA代谢,包括:1D-山梨醇氧化为L-山梨糖;2L-山梨糖氧化为L-山梨酮;3L-山梨酮(吡喃型)氧化为2-KGA;4L-山梨酮(呋喃型)氧化为维生素C。52-KGA还原为L-艾杜糖酸。其中L-山梨糖/L-山梨酮脱氢酶(SSDH)参与反应123,L-山梨糖脱氢酶(SDH)参与反应23,L-山梨酮脱氢酶(SNDH)参与反应34,醛脱氢酶(ALDH)参与反应3,2-KGA还原酶(2-KGR)参与反应5。SDH/SSDH/ALDH属于Ⅰ型醌酶,其辅酶为1分子PQQ;SNDH属Ⅱ型醌酶,与PQQ、heme C共同构成quinohemoproteins,2种醌酶均分布于周质空间中与呼吸链相偶联,意味着这种膜上直接氧化过程伴随ATP产生,使得菌体可以利用环境中的底物实现快速供能。     

D-氨基酰化酶拆分D,L-苯丙氨酸制备D-苯丙氨酸

进行了以D,L-苯丙氨酸为原料经D-氨基酰化酶制备D-苯丙氨酸的研究。乙酰-D,L-苯丙氨酸浓度为0.5mol.L-1,给酶量为3×104U.L-1时,24 h拆分率可达到97%。采用阳离子交换树脂进行了拆分液中的D-苯丙氨酸的分离,D-苯丙氨酸的收率为95.4%。采用醋酸酐作为催化剂,在145℃的条件下,乙酰-L-苯丙氨酸可以消旋成乙酰-D,L-苯丙氨酸继续拆分。     

果糖-2,6-二磷酸对番茄果实PFP酶活化效应的巯基依赖性

在无二硫苏糖醇(DTT)存在下得到部份纯化的氧化型PFP酶,在广泛的pH范围内(pH6.0～9.0)失去其大部分对果糖2,6-二磷酸的敏感性。活化效应可藉与DTT保温得到恢复而不改变其最适pH值。在与DTT保温过程中,酶对果糖2,6-二磷酸的亲和力逐步增加。氧化型酶的K_a值(对果糖2,6-二磷酸)在酶与DTT保温(pH8)1h之后从1400nmol/L下降到约50nmol/L。 在DTT存在下纯化的酶(还原型)经低浓度5,5′-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)处理,在使酶活性迅速失活的同时引起酶对果糖2,6-二磷酸脱敏。这一过程可为DTT处理所回复。从小麦胚中纯化的硫氧还蛋白h在恢复酶活性和酶的果糖2,6-二磷酸敏感性的效应中表明,细胞内的氧化还原状态可能藉以改变酶对果糖2,6-二磷酸的亲和力而调节PFP酶的活性。     

基于双酶级联协调表达策略高效催化合成D-甘露醇北大核心CSCD

D-甘露醇(D-mannitol)作为合成抗肿瘤药和免疫刺激剂的重要前体被广泛应用于制药和医疗等行业,酶法合成D-甘露醇反应成本昂贵无法满足工业化生产。本研究首先筛选关键酶获得较优性能的甘露醇脱氢酶Lp MDH和用于辅因子NADH再生的葡萄糖脱氢酶Ba GDH,在大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中共表达,实现了基于双酶级联反应催化底物D-果糖合成D-甘露醇,D-甘露醇的初步摩尔转化率为59.7%。针对双酶级联催化反应中辅酶再生用酶与催化用酶表达量不协调的问题,通过增加Bagdh拷贝量来提高辅因子循环能力,获得了双酶催化速率平衡的重组大肠杆菌E.coli BL21/pETDuet-Lpmdh-Bagdh-Bagdh。进一步对重组菌的全细胞转化条件进行优化,确定了最适转化条件为反应温度30℃,初始pH值6.5,菌体量OD600=30,底物D-果糖100.0 g/L,辅底物葡萄糖与底物1︰1摩尔当量。于最优转化条件下5 L发酵罐转化24 h,D-甘露醇的最高产量为81.9g/L,摩尔转化率为81.9%。本研究提供了一种绿色、高效生物催化生产D-甘露醇的方法,为实现其规模化生产奠定了基础,同时也对其他相关稀有糖醇的研究具有指导意义。     

蛇肌果糖1,6-二磷酸酯酶的低底物浓度动力学

本文报道了对蛇肌果糖1,6-二磷酸酯酶的低底物浓度的动力学研究,采用酸碱指示剂方法能在0.25μmol/L的低底物浓度下对酶活力进行准确的测定。通过对动力学行为的分析,提出了蛇肌果糖1,6-二磷酸酯酶的作用机制的模型,认为在低底物浓度和高底物浓度的情况下,酶催化水解果糖1,6-二磷酸的机制不同。推导得到了酶的初速度方程,用电子计算机拟合求得了七个表观动力学参数。统计检验表明,本文提出的机制能够较好地拟合实验结果。     

分枝犁头霉a-半乳糖苷酶的底物特异性

测定了43种碳水化合物对酶活力的影啊。其中半乳糖、甘油醛及纤维二糖使酶活力下降50％以上,D-阿拉伯糖、塔格糖、半乳糖醛酸、D-枝糖、L-阿拉伯糖、D-葡萄糖酸内酯．乳糖及蔗糖使酶活下降到70％左右;而二羟丙酮、2-脱氧-D-半乳糖及异丙基β-D-硫代半乳糖苷使酶话提高50％左右;其余的碳水化合物对酶活无明显影响。测定了Hg2+、甘油醛及半乳糖对酶的抑制类型。结果表明,Hg2+是a-半乳糖苷酶的非竞争性抑制剂,半乳糖及甘油醛是酶的竞争性抑制剂,后两者的K,值分别为8．3及12．5 mmol／L。     

联合β-半乳糖苷酶和L-阿拉伯糖异构酶法合成D-塔格糖的研究

将大肠杆菌K-12中的B-半乳糖苷酶基因lacZ和L-阿拉伯糖异构酶基因araA以串联方式克隆到载体pET-28a（＋）上,并转入大肠杆菌BL21（DE3）中进行表达。通过SDS—PAGE分析发现,重组菌株能表达出大量可溶性B．半乳糖苷酶蛋白和L-阿拉伯糖异构酶蛋白。以重悬菌液为酶源,可将乳糖降解为D-半乳糖,并将D-半乳糖转化为D-塔格糖。在温度为50℃,pH7．0的缓冲液中,经一段时间反应后,D-塔格糖的转化率可达21％以上。加入Mn^2＋、Co^2＋和Fe^2＋均能够使D-塔格糖的转化率提高。     

D-天冬酰胺和D-高丝氨酸的制备研究

在以L-天冬氨酸为原料制备D-天冬氨酸的基础上,设计了D-天冬酰胺和D-高丝氨酸的合成新方法。即以L-天冬氨酸为原料,经酯化、消旋、拆分后得到D-天冬氨酸甲酯;D-天冬氨酸甲酯盐酸盐氨解、精制可得到D-天冬酰胺,总收率为49.9%,光学纯度达到99%以上;由D-天冬氨酸甲酯经还原、精制可得到D-高丝氨酸,总收率为64.7%,旋光纯度达到99%以上。     

细菌把L-山梨糖醇氧化成为L-果糖

美国Nabisco Brands公司R.O.Horwath认为,L-果糖本是作为种饮料中的甜味剂使用的,也可以供糖尿病患者食用的,但由于L-糖类不被代谢,不产生后味,所以他们从一种荧光假单胞菌(Preudomonas fluorescens)的突变株中分离出L-伊地醇脱氢酶,用这种酶来氧化L-山梨糖醇,生产L-果糖。把L-阿拉伯糖缩合,形成L-葡     

酶法生产稀少糖的研究进展

稀少糖是指自然界中存在稀少的单糖及其衍生物,可应用于食品、制药和营养等许多领域,同时也可以作为各种天然产品和候选药物的原料。目前大多数稀少糖因其在自然界中含量稀少而非常昂贵,而且这些稀少糖的化学合成原料价格高昂,不利于其大量生产。由于酶催化反应具有反应条件温和、特异性强、效率高、可持续性强等优点,稀少糖酶法生物合成已成为这一领域的有力工具。文中就稀少糖,包括D-阿洛酮糖、D-塔格糖、D-山梨糖、L-果糖、D-阿洛糖等其他稀少糖的生物学功能及应用,以及稀少糖相关酶的研究和酶法生产进行综述。     

蛇肌果糖1,6-二磷酸酯酶的冷失活

蛇肌果糖1,6-二磷酸酯酶在0℃左右很易失活。这是它不同于兔肌果糖1,6-二磷酸酯酶的一个特性。这种冷失活可被底物保护,提高溶液中酶蛋白的浓度可降低其失活程度。现有的结果表明,这一失活是不可逆的,且不伴随有亚基的解离或整个分子结构的松散;但用1-苯胺萘-8-磺酸作萤光探剂和用5,5'-硫-二(2-硝基苯甲酸)与巯基反应可探测到酶分子在低温诱导下发生了比较小的构象变化。