导入三叶草根瘤菌寄主范围基因对豌豆根瘤菌侵染白三叶草的影响

将带有三叶草根瘤菌寄主范围基因的豌豆根瘤菌（转移接合子182和290）接种白三叶草,观察比较它们对白三叶草早期侵染特征和结瘤情况。转移接合子182虽然诱导白三叶草很毛细胞弯曲,但未观察到侵染,也无侵染线形成;而转移接合子290能诱导白三叶草根毛形成紧密的弯曲,溶解根毛细胞壁和侵染白三叶草。结瘤试验表明,白三叶草接种转移接合子290所诱导的结瘤情况与接种三叶草根瘤菌野生型菌株ANU843的情况很相似。转移接合子182只能诱导个别无效瘤,290和ANU843一样都能在白三叶草上结瘤。由此说明转移接合子如果只携带三叶草根瘤菌的部分寄主范围基因(FEL）仍不能在白三叶草上诱导侵染和正常结瘤,而必需携带全部寄主范围基因（FELMN）才能在白三叶草上正常结瘤。     

转座子Tn5诱变对三叶草根瘤菌早期侵染和结瘤的影响

对三叶草根瘤菌Rhizobium trifolii野生型菌株ANU843及其转座子Tn5诱导的突变株nod258和nod261的侵染和结瘤能力进行了比较。Ⅲ医结瘤基因nodFE的突变林(nod258)能在地三叶草(Subterranean clover)上正常侵染和结瘤,但瘤数比ANU843所诱导的略有减少。而Ⅱ区结瘤基因nodIJ的突变株(nod261)却表现侵染力减弱,诱导无效瘤和瘤数大大减少。显微镜强察和超微结构研究表明菌株ANU843在接种后24h侵染已经从植物根毛开始,48h侵染线,(infeetioa thread)发展到表皮细胞并开始分支,接种后72h侵染线进一步发展,深入皮层细胞,这时皮层细胞已经大量分裂增生,形成瘤的分生组织。成熟的瘤细胞内充满了类菌体。而nod261突变株侵染植物比ANU843推迟了24h,侵染线的发展受阻碍,接种后72h侵染线仍然停留在根毛细胞中。Nod26l突变株所诱导的瘤细胞内没有或仅有个别类菌体,是无效瘤。这表明结瘤基因nodIJ与侵染线的正常形成和发展密切相关。     

豇豆根瘤菌NGR234和紫云英根瘤菌109感染紫云英的比较研究

利用光学和电子显微镜对紫云英根瘤菌菌株109和广宿主的快生型根瘤菌菌株NGR234感染温带型豆科植物紫云英进行了研究,结果表明根瘤菌感染紫云英是通过在根毛中形成侵染线的途径。电子显微镜研究揭示了固氮根瘤中细胞内侵染线的存在。接种二天后,首先可观察到根毛的卷曲或分枝。接种四至五天后,在每株植物卷曲的根毛中可看到侵染线。接种八至十天后的植株出现肉眼可见的根瘤。菌株NGR234能够在紫云英上诱导根毛的卷曲,侵染线和根瘤的形成,但所形成的根瘤却未能固氮,根瘤中无明显的类菌体区,但有少数包有细菌的侵染线。NGR234抗抗菌素的衍生菌均未能使紫云英结瘤。将NGR234的共生质粒转移至三叶草、苜蓿、豌豆、快生型大豆根瘤菌和农杆菌,亦未能使这些细菌获得紫云英上结瘤的能力。     

紫云英根瘤菌基因文库的构建及含完整结瘤基因的重组质粒pRaZ15的分离

以紫云英根瘤菌菌株7653R为材料,制备总DNA,经EcoRⅠ限制酶部分酶解,通过10—50％蔗糖梯度离心,分离到20一30 kb的DNA片段。利用能在革兰氏阴性菌中转移和复制的广谱寄主载体——pLAFRl质粒,构建了紫云英根瘤菌基因文库。通过与苜蓿根瘤菌102l菌株中8．7kb的共同结瘤基因(作探针DNA)杂交,从基因文库中分离到紫云英根瘤菌共同结瘤基因片段。以紫云英根瘤菌不结瘤突变株7653R+1(7653R消除共生质粒)为受体、构建的7653R基因文库(E．Coli C600)为供体,通过协助转移质粒pRK2013(LE392)进行三亲交配,在含四环素的根瘤菌台成培养基(sM)上选择接合转移子。将得到的所有接台转移子混合在一起接种植物,通过植物结瘤试验,分离到含紫云英根瘤菌结瘤基因的重组质粒pRaz15。将该质粒用EcoRⅠ完全酶切,得到25kb左右的外源DNA片段,该片段携带完整的结瘤基因簇。     

氮源对紫云英根瘤菌nod基因表达的作用

高浓度的硫酸铵阻碍了紫云英根瘤菌诱导紫云英根毛发生典型的根毛变形并明显抑制了紫云英结瘤能力。通过对融合子的β-半乳精苷酶活性的测定进一步表明高浓度的硫酸铵对紫云英的结瘤调节基因nodDZ、共同结瘤基因nodA及nodBC的表达有抑制作用而对结瘤调节基因nodD1的表达无抑制作用。     

几类快生型根瘤菌质粒的研究

用一种重现性好而较简便的方法,对国内的紫云英、豌豆、三叶草、大豆等快生型根瘤菌及根癌农杆菌共40多号菌进行了质粒分离,所得质粒图谱具有一定的菌株特异性。每株菌有1—3个质粒,其中至少有一个大质粒或巨大质粒。用质粒消除法获得失去结瘤(或致癌)能力的变异株,均缺少一个大质粒。快生型根瘤菌的结瘤基因定位在大质粒或巨大质粒上。用接合法将Rpl：：Tn501等质粒转入根瘤菌中,能诱动根瘤菌的结瘤基因转移给失去结瘤能力的变异株,可表达功能,质粒图谱也发生变化,与供体或受体都不同。     

菜豆根瘤菌sym和mel基因在农杆菌中的转移和表达

豆根瘤菌(Rhizobium phaseoli)共生质粒pSYM3622具有诱导宿主植物(phaseolusvulgaris cv."Jamapa")结瘤固氮的有效基因,以及菜豆根瘤菌特征性的产黑素基因(Melanin production gene)。在诱动因子RP4的存在下,共生质粒能够有效地向三叶草根瘤菌和农杆菌转移。种间和属间杂交子都能诱导菜豆植物形成无效根瘤,并且具备在特定培养基上产生黑素的能力。pSYM3622在三叶草根瘤菌菌株RCR226中具有明显的不亲和性,但是在农杆菌杂交子中,这些结癌和产生黑素的特征在植物根瘤分离菌中能够稳定地保持下去。试验同时研究了pSYM3622向假单胞菌和大肠杆菌的诱动转移。     

紫云英根瘤菌结瘤因子的初步研究

最近的研究结果表明,豆科植物与根瘤菌的共生识别是一种双向的信号物质交换过程.首先是豆科植物的根或种子分泌类黄酮物质,诱导根瘤菌的结瘤基因(nod genes)产生结瘤因子(nod factors),分泌到胞外,为植物所接受,从而引发植物某些基因表达,细胞分化,细胞壁形成,最终导致根毛变形等一系列变化.已经测定了几种苜蓿根瘤菌(Rhizobium meliloti)和豌豆根瘤菌(R.leguminosarum bv.viciae)结瘤因子的分子结构式,它们均属于寡糖胺类物质,在没有根瘤菌存在的条件下,结瘤因子能独立地促使根毛发生变形,这是检测结瘤因子是否存在的重要手段,即根毛变形试验(Root hairdeformation assay,简称Had试验).高浓度的结瘤因子甚至能诱导植物产生空瘤,其组织结构与典型的根瘤相同.     

携带编码苜蓿根瘤菌结瘤基因的根癌农杆菌和大肠埃希氏菌,可在苜蓿根上形成类根瘤

将编码苜蓿根瘤菌(Rhizobium meliloti)结瘤基因(nod)的质粒,通过接合作用转移到根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)和大肠埃希氏杆菌(Eschrichia coli)里,分别形成转移接合体。这两种转移接合体都能诱导苜蓿根毛卷曲,并形成类根瘤。在由根癌农杆菌转移接合体形成的类根瘤里,可看到典型的根瘤分     

丛枝菌根真菌和根瘤菌对白三叶氮同化的影响

为揭示丛枝菌根真菌(AMF)和根瘤菌在白三叶氮(N)同化中的作用,该研究对白三叶进行单一或联合接种隐类球囊霉(Paraglomus occultum)和三叶草根瘤菌(Rhizobium trifolii),分析其对白三叶的生长、光合作用、叶片N和氨基酸含量以及N同化相关酶活性的影响。结果表明:(1)单一接种AMF或根瘤菌以及联合接种AMF和根瘤菌均显著增加了白三叶的株高、匍匐茎长度、叶片数、地上部生物量、总生物量、叶绿素b和总叶绿素含量、稳态光量子效率和叶片N含量,这种增强效应是联合接种>单一AMF>单一根瘤菌>未接种处理。(2)联合接种AMF和根瘤菌显著增加了白三叶叶片中丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸和组氨酸的含量,显著提升了叶片N同化相关酶如硝酸还原酶、亚硝酸还原酶、谷氨酰胺合成酶、谷氨酸合成酶、谷氨酸脱氢酶、天冬酰胺合成酶和天冬氨酸转氨酶的活性,显著促进AMF对白三叶根系的侵染。综上认为,联合接种AMF和根瘤菌通过激活N同化相关酶活性有效促进N同化,产生更多氨基酸,进一步促进白三叶植株生长; 联合接种AMF和根瘤菌具有协同作用,有效促进了白三叶的N同化。     

三叶草素基因(tfx)在快生型大豆根瘤菌(Sinorhizobium fredii)H12-2中的表达与稳定性测定

将含有三叶草条基因的重组质粒pT2TFXK和pT2TX3K以接合转移的方式导入快生型大豆根瘤菌H12－2。转移接合子H12－2（pXK）能产三叶草素并具有抑菌活性;H12－2（P3K）表现出对三叶草素的抗性。抑菌谱试验结果表明：82％的供试快生型大豆根瘤菌菌株对三叶草素敏感;所有供试慢生型大豆根瘤菌则表现抗性。稳定性检测结果表明：在共生与人工培养条件下,导入的pXK和p3K质粒均可在宿主菌中稳定存在和表达。     

慢生根瘤菌属结瘤基因的进化及遗传分析

根瘤菌中存在一系列控制固氮结瘤因子(lipo-chito-oligosaccharides)合成的结瘤基因(nodulation genes)。其中, nodA基因是合成结瘤因子所必需的, 该基因负责酰基转移酶的合成, 能将不饱和脂肪酸转移到结瘤因子寡聚糖骨架上; 基因nodZ, nolL和noeI为宿主专一性结瘤基因, 分别转录合成岩藻糖基转移酶, 岩藻糖乙酰化酶和岩藻糖甲基化酶。通过GenBank调取慢生根瘤菌属及其他根瘤菌属的结瘤基因nodA, nodZ, nolL和noeI, 构建系统发育树, 进行进化和遗传分析。结果表明, 慢生根瘤菌属各个菌株的nodA, nodZ, nolL和noeI具有很高的相关性, 但是与根据保守基因16S rDNA和dnaK分类情况不完全相符。这表明慢生根瘤菌属的结瘤基因主要是通过直系遗传的, 同时可能为适应宿主及环境条件, 结瘤基因有少量的平行转移。结果表明, 慢生根瘤菌属各个菌株的nodA, nodZ, nolL和noeI具有很高的同源性, 同时发现基于保守基因16S rDNA和dnaK对慢生根瘤菌的分类情况与慢生根瘤菌属各菌株在nodA, nodZ, nolL和noeI具有较高同源性的事实不完全相符。这表明慢生根瘤菌属的结瘤基因主要是通过直系遗传的, 同时可能为适应宿主及环境条件, 结瘤基因有少量的平行转移。     

导入dctABD和nifA基因对费氏中华根瘤菌共生固氮的影响研究

以pTR102为载体构建重组质粒pHN307,其上克隆有来自昔蓿中华根瘤菌（Sinorthizobium meliloti）的四碳二羧酸转移酶基因dctABD、来自肺炎克氏杆菌(Klebsiella pneumoniae）的nifA基因和来自pDB30所含的发光酶基因lux-AB。经三亲本接合转移,将pHN307导入费氏中华根瘤菌（S.fredii)NH01、YC4和GR3,并考察了转移接合子中pHN307在传代培养和共生条件下的稳定性。与出发菌相比较的植物盆栽试验结果表明,在与大豆黑农33共生时,导入pHN307后的转移接合子均可显著提高结瘤植株的瘤重、地上部分干重和地上部分总氮量。在与大豆川早一号共生时,转移接合子HN01（pHN307）可显著提高结瘤植株的瘤数和瘤重;GR3（pHN307）可显著提高结瘤植株的瘤数、瘤重、地上部分干重和地上部分总氮量;导入pHN307的YC4却呈现出负作用。本研究表明,导入dctABD可提高固氮效率     

豆科植物凝集素及其对根瘤菌的识别作用

本文讨论了豆科植物凝集素的性质、分布、基因及其表达;近年来研究表明识别根瘤菌的因子是豆科植物根上的凝集素。将一种豆科植物的凝集素基因转化到另一种豆科植物后,再接种前一种豆科植物的根瘤菌,可以使其被侵染和结瘤。由此人们提出了扩大根瘤菌宿主范围到非豆科植物,特别是粮食作物范围的可能性。     

紫云英根瘤菌Ra159的巨大质粒上存在有nod和nif基因的证明

在紫云英根瘤菌(Rhizobium astragali)Ra159中存在有两个分子量分别约为300Md(pRal59a)及大于300Md(pRal59b)的巨大质粒。以肺炎克氏杆菌的固氮酶结构基因nifHDK片段和苜蓿根瘤菌共同结瘤基因nod ABCD片段作探针进行的杂交试验证明了紫云英根瘤菌的大质粒pRal59b上存在有nod基因和nif基因。将这些大质粒转移到nod—nif基因缺失的苜蓿根瘤菌突变株Rm627—1,只有带pRal59b的转移接合子能在紫云英植物上形成根瘤,但这些根瘤均不能还原乙炔。     

豌豆根瘤菌共生基因pJB5JI与华癸中生根瘤菌7653R共生质粒的相互关系

华癸中生根瘤菌(Mesorhizobium huakuii)7653R是分离自我国南方水稻田的一株根瘤菌,含有2个内源质粒:p7653Ra和p7653Rb,其中7653Rb是共生质粒.通过Tn5-sacB的插入方法来消除质粒,获得7653Rb消除的突变株7653RD.将豌豆根瘤菌T83K3的共生质粒pJB5JI导入7653R和7653RD中,盆栽结果表明含有pJB5JI的转移接合子7653R-197的竞争结瘤能力和共生固氮能力均高于7653R.pJB5JI不能恢复7653RD在紫云英上的结瘤能力.含有pJB5JI的7653RD可以在豌豆上结无效瘤,表明pJB5JI可以在7653R的染色体背景下表达其功能.对转移接合子中的质粒稳定性进行检测,结果表明pJB5JI在人工传代的情况下可以稳定存在,但经过共生之后发生了遗传分离,对转移接合子和出发菌株及分离菌株进行kan基因的PCR扩增,除了受体菌外其他菌株都可得到PCR产物,由此推测,pJB5JI可能部分或全部整合到了受体菌的染色体基因组中.     

豆科植物凝集素及其对根瘤菌的识别作用

本文讨论了豆科植物凝集素的性质、分布、基因及其表达;近年来研究表明识别根瘤菌的因子是豆科植物根上的凝集素。将一种豆科植物的凝集素基因转化到另一种豆科植物后,再接种前一种豆科植物的根瘤菌,可以使其被侵染和结瘤。由此人们提出了扩大根瘤菌宿主范围到非豆科植物,特别是粮食作物范围的可能性。     

紫云英根瘤菌的exo与nod基因在宿主结瘤过程中的协同作用

紫云英根瘤菌菌株107经转座子Tn5诱变的胞外多糖合成缺陷型变种(Exo~-),在共生性状方面的改变有四种类型。我们选用了仅在宿主根部形成瘤状突起(Calli)的A类(NA-01,NA-02)、形成无效瘤(Nod~ ,Fix~-)的B类(NA-12)及不结瘤的(Nod~-)D类(NA-14)中的四个突变株分别与消除了共生质粒的Exo~ Nod~-变种(热处理变种及ANU-1116)混合接种紫云英幼苗,观察到与D类变种配合的接种组仍不能结瘤,而与A,B两类变种配合的接种组均诱导宿主产生形态正常的无效根瘤,并且该无效瘤全部被Nod~-变种侵占。说明一个表型仍为Exo~ ,但失去共生质粒的Nod~-变种,可在一个含有该质粒的Exo~-变种的帮助下进入根瘤。这提示共生质粒上的结瘤基因(nod)仅与侵染过程的早期有关,瘤的发育尚需根瘤菌的其他基因,其中包括exo基因的参与。 此外,共生质粒缺失的三个异种根瘤菌突变株分别与紫云英根瘤菌Exo~-变种混合接种时,也都在紫云英根部诱导出无效瘤,并且从瘤中能分离到这三个异种菌。表明在最初的识别作用发生后,植物对共生菌的专一性要求有所降低。     

转反义磷脂酶Dγ基因白三叶草的获得

利用根癌农杆菌介导法将反义磷脂酶Dγ基因 (PLDγ)转入白三叶草。建立了白三叶草的继代及高频再生系统 ,对传统农杆菌侵染方法进行了改良 ,通过抗生素筛选获得大量抗性植株。对抗性植株进行了PCR和PCR Southern杂交鉴定 ,证实PLDγ基因已整合入白三叶草核基因组中。     

Rpfan37在刺槐共生结瘤过程中的功能探究

目的:研究刺槐中与磷脂酰肌醇转运蛋白有较高同源性的基因Rpfan37的功能,为探究相关基因参与豆科植物与根瘤菌共生结瘤过程提供新的思路。方法:通过前期研究,建立豆科植物刺槐与共生根瘤菌互作的抑制差减杂交反交文库,筛选疑似与共生结瘤相关的基因。利用PCR技术快速克隆经实时荧光定量PCR技术(qRT-PCR)分析基因在不同接菌时间及不同植物组织的表达。构建RNA干扰(RNAi)重组载体,转农杆菌介导转化植物根部,接种根瘤菌后验证该基因在刺槐共生结瘤过程的功能。结果:基因表达分析显示,在接菌与未接菌的刺槐根中,处理后第15天,Rpfan37表达均显著上调,但接菌与未接菌处理对该基因表达无显著影响;在成熟的根瘤中,该基因仅为低水平表达。RNAi转化植株的鲜重、株高、根长及结瘤数较对照组显著降低。在显微镜下观察到RNAi植株根毛发育异常;与对照相比,RNAi转化植株形成的根毛卷曲、根毛侵染线及根瘤原基数目均显著降低。根瘤石蜡切片结果显示RNAi植株根瘤中的侵染细胞与对照相比明显减少,分析豆血红蛋白表达发现,RNAi植株中根瘤发育成熟过程明显受阻。结论:在豆科植物刺槐中发现的相关基因Rpfan37能够参与刺槐共生结瘤过程,为研究磷脂酰肌醇转运蛋白在共生结瘤过程中的作用提供了新的理论基础。