捕食线虫真菌捕食器相关基因标记Ⅱ.捕食器基因不表达转化子的形态特征及核酸杂交分析

本文从利用质粒pBChygro转化少孢节丛孢YMF1．00544的2135个转化子中筛选到一株捕食器基因不表达的转化子YMF1．00110。该转化子的形态学特征与野生型菌株有明显区别,对该转化子的核酸杂交结果表明质粒DNA是以单拷贝的方式整合到真菌染色体上。此外,对部分转化子的杂交整合模式和标记率进行了杂交分析。     

捕食线虫真菌捕食器相关基因标记Ⅰ.REMI转化捕食线虫真菌及转化子特征分析

采用REMI技术转化了少孢节丛孢、指状节丛孢和贵州节丛孢3种捕食线虫真菌,并对转化条件、转化子的形态特征、胞外蛋白酶的分泌差异、抗性稳定性进行了测定,分析了转化子对线虫的致病性和对土壤抑菌作用的忍耐性。     

捕食线虫真菌捕食器相关基因标记Ⅰ.——REMI转化捕食线虫真菌及转化子特征分析

采用REMI技术转化了少孢节丛孢、指状节丛孢和贵州节丛孢3种捕食线虫真菌,并对转化条件、转化子的形态特征、胞外蛋白酶的分泌差异、抗性稳定性进行了测定,分析了转化子对线虫的致病性和对土壤抑菌作用的忍耐性。     

粟长蠕孢菌的原生质体转化

本文报道了利用具有潮霉素抗性标记的质粒(pAN7-1)对粟长蠕孢菌原生质体进行转化的结果。经pAN7-1质粒DNA转化处理的粟长蠕孢菌原生质体在含潮霉素(200μg/ml)的选择性培养基上出现两类转化子。一类是正常转化子,其转化率为2个转化子/μg DNA;另一类是流产转化子,其产生频率为500—600个转化子/μg DNA。DNA杂交分析结果表明,在正常转化子中质粒DNA以首尾相接、重复排列的形式整合入受体菌染色体DNA。初筛获得的转化子多数以异核状态存在,经单孢分离纯化后可通过有丝分裂稳定传代。     

以潮霉素B抗性为选择标记的深黄被孢霉原生质体转化

利用亚硝基胍(MNNG)诱变方法筛选了一株深黄被孢霉潮霉素B敏感型菌株M6-22-4。采用PEG介导的方法,将含有E.coli潮霉素B抗性标记的PD4质粒转入敏感株M6-22-4原生质体,并在潮霉素B浓度为400μg/mL的选择培养基上筛选转化子,获得了1.6~2.8个转化子/μg质粒DNA的转化频率。稳定性实验表明,质粒线性化后所获得的转化子在PDA培养基上传代10代以后,转接到选择平板上有31.6%仍具有HmB抗性;随机挑选了3个转化子,通过PCR方法检测到潮霉素抗性基因的存在,Southern杂交发现,潮霉素抗性基因已经以1~2拷贝数整合到深黄被孢霉M6-22-4染色体上,这是深黄被孢霉转化系统的首次报道。     

链霉菌质粒pSET152电转化稀有放线菌小单孢菌的研究

利用链霉菌(Streptomyces)噬菌体ΦC31所构建的整合型载体pSET152作为供体质粒,分别以小单孢菌(Micromonospora)40027菌株的萌发孢子和新鲜菌丝体作为受体菌,在不同的电场强度下进行电转化实验,结果表明:以小单孢菌40027菌株萌发孢子为受体菌,未获得电转化子;以小单孢菌40027菌株新鲜菌丝体为受体菌,获得了电转化子。电场强度为13kV/cm时可获得最高转化效率。Southern杂交结果表明:质粒pSET152可通过菌丝体电转化法导入小单孢菌40027菌株,并整合到小单孢菌40027菌株的染色体上,暗示链霉菌噬菌体ΦC31的整合酶基因和整合位点在异源宿主小单孢菌40027菌株中仍具有相同的功能。质粒稳定性检测实验表明:质粒pSET152可稳定地存在于小单孢菌40027菌株中。     

以潮霉素B抗性为选择标记的深黄被孢霉原生质体转化

利用亚硝基胍（MNNG）诱变方法筛选了一株深黄被孢霉潮霉素B敏感型菌株M6-22-4。采用PEG介导的方法,将含有E.coli潮霉素B抗性标记的PD4质粒转入敏感株M6-22-4原生质体,并在潮霉素B浓度为400μg/mL的选择培养基上筛选转化子,获得了1.6～2.8个转化子/μg质粒DNA的转化频率。稳定性实验表明,质粒线性化后所获得的转化子在PDA培养基上传代10代以后,转接到选择平板上有31.6%仍具有HmB抗性;随机挑选了3个转化子,通过PCR方法检测到潮霉素抗性基因的存在,Southern杂交发现,潮霉素抗性基因已经以1～2拷贝数整合到深黄被孢霉M6-22-4染色体上,这是深黄被孢霉转化系统的首次报道。     

糖多孢红霉菌同源片段长度与染色体重组率关系的研究

为了探索同源片段长度与糖多孢红霉菌染色体同源重组率的关系,化学合成或用重叠PCR合成带有突变位点、在突变位点两侧长度为（26bp+27bp）、（500bp+576bp）和（1908bp+1749bp）的同源序列,克隆于糖多孢红霉菌同源重组载体pWHM3后,分别构建了pWHM1113、 pWHM1116和 pWHM1119质粒。以PEG介导转化糖多孢红霉菌A226原生质体,3个质粒分别获得每皿30个、69个和170个转化子,但pWHM1113质粒不能与染色体有效整合,pWHM1116质粒与染色体整合率为转化子的2%,而pWHM1119质粒与染色体整合率达到转化子的19%。 pWHM1116和 pWHM1119质粒均可进行有效的染色体二次重组,将突变位位点引入染色体。因此,同源片段长度为（500bp+576bp）或更长时,可与糖多孢红霉菌染色体进行有效的单重组和双重组。     

糖多孢红霉菌A226 的原生质体转化和染色体同源整合

糖多孢红霉菌的原生质体转化和染色体同源整合,是红霉素生物合成基因改造的重要途径。本研究对糖多孢红霉菌A226原生质体制备和转化条件进行了优化,结果表明以对数生长后期和稳定期菌丝体制备的原生质体转化效率较高;质粒、原生质体和PEG－T缓冲液体积比例为15：40：200（μl)时转化效果较好;比重小原生本的转化效率虽高,但在转化子中有效整合的比例较低;PEG1000和PEG3350对转化效率没有显差异;而Yamamoto转化系统优于Weber转化系统。PCR鉴定、抑菌活性鉴定和质谱分析均表明,转化质粒已整合到染色体红霉素合成基因位点。     

高山被孢霉Δ~6-脂肪酸脱氢酶基因在红冬孢酵母中的表达

以绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)作为报告基因,将质粒pRH2304转化红冬孢酵母YM25235进行表达分析,荧光显微观察结果表明GFP在YM25235获得表达,建立了红冬孢酵母YM25235遗传转化方法。在此基础上,以高山被孢霉Δ6-脂肪酸脱氢酶基因取代pRH2304中的GFP基因,构建重组质粒pRH2304MAD6,将其转化红冬孢酵母YM25235进行表达分析。PCR结果表明,高山被孢霉Δ6-脂肪酸脱氢酶基因已经整合到YM25235基因组中,进一步的脂肪酸气相色谱分析结果表明,该基因编码产物催化n-6途径中的亚油酸转化成γ-亚麻酸,占细胞总脂肪酸的4.35%,但没有检测到催化n-3途径中的α-亚麻酸转化成十八碳四烯酸。     

Improvement on genetic transformation in the nematode-trapping fungus Arthrobotrys oligospora and its quantification on dung samples

An improved DNA-mediated transformation system for nematode-trapping fungus Arthrobotrys oligospora based on hygromycin B resistance was developed. The transformation frequency varied between 34 and 175 transformants per μg linearized DNA and 93% of the transformants were stable for drug resistance when tested 100 randomly selected transformants. More than 2000 transformants were obtained by transformation of the fungus with pBChygro in the presence of HindIII and among them, one, YMF1.00110, which lost its ability of forming predacious structure, was isolated. Southern analysis showed that the plasmid DNA had integrated into the genome of all tested transformants (including YMF 1.00110) except one. The transformant tagged with hph gene could be re-isolated and quantified from dung samples based on the resistance of hygromycin B. All the results suggested that the method of restriction enzyme mediated integration (REMI) should facilitate not only the insertional mutagenesis for tagging and analysis genes of interest but also the ecological investigation of tagged fungi in a given environment.     

人体胸苷激酶(TK)基因在共转染过程中结构改变的研究

用磷酸钙沉淀法,我们把带有人体TK基因片段的重组噬菌体DNA共转染小鼠Ltk~-细胞,得到TK~+转化细胞克隆。同时用HeLa细胞DNA转染Ltk~-细胞,得到第一代TK~+转化细胞,再进行第二轮、第三轮转染,得到第二代、第三代TK~+转化细胞。比较其转化效率,结果基因组DNA转化率大于基因两个片段的共转化率,更大于不加携带者DNA的共转化率。限制性内切酶消化各种TK~+转化细胞的DNA,与TK基因探针作Southern印迹杂交,结果表明两个TK基因片段共转染Ltk~-细胞时,它们可以在受体细胞里重建成一个具有完整功能的遗传单位,但在连接过程中结构可以发生改变。当用HeLa纽胞DNA转染Ltk~-细胞时,虽然连续三代转染,每一代TK~+转化细胞中人TK基因的结构未发现变化。但也不能排除基因结构改变的频率很低未能有效检出的可能性。     

发根农杆菌对骆驼刺的转化及转化组织的形态发生

将骆驼刺离体再生苗的茎切段经发根农杆菌A4菌株感染后,在含500mg/L头孢霉素的MS无激素培养基上培养,产生了转化的发根和愈伤组织.转化根在附加2mg/L2,4-D和0.5-1mg/L6BA的MS培养基上培养后,亦可诱导出愈伤组织.在含3mg/L6BA和0.5mg/LNAA的培养基上诱导出了苗的分化.冠瘿碱分析表明,在95%以上的发根和75%的转化愈伤组织及再生植株中都显示了T-DNA的整合和表达.染色体检查发现,约81%的发根细胞具有正常染色体数(2n=18),其余则存在染色体数目的变化,在继代培养一年之后,转化体仍维持旺盛的再生能力.     

棉花漆酶基因在转基因新疆杨中的表达及其对木质素合成的影响

以新疆杨叶柄为外植体,利用农杆菌法将棉花漆酶基因GaLAC1导入新疆杨.PCR,Soutllern杂交证明外源基因已经整合到杨树基因组中.漆酶活性分析表明转基因植株中漆酶活性较非转基因对照显著提高.与对照植株相比,转基因新疆杨茎段中总木质素的含量有不同程度的增加,最高达21.5%.木质素的组织化学染色进一步证实了GaLAC1的过量表达能够导致转基因植株中总木质素含量的增加.实验结果表明GaLAC1参与了植物体内木质素的合成,这是首次成功利用转基因植物证实植物漆酶基因参与木质素合成的报道.     

chiA基因在稻根联合固氮菌E26和NG13中的表达

将带有粘质沙雷氏菌几丁质酶基因 (chiA)的 1 8kbHinfⅠ片段分别克隆到表达载体pKK2 2 3 3和质粒pMC71A上 ,构建成几丁质酶表达质粒pKChiA和pMChiA。将这 2种质粒转化稻根联合固氮菌阴沟肠杆菌E2 6 (EnterobactercloacaeE2 6 )和催娩克氏菌NG1 3 (Klebsiellaoxy tocaNG1 3 ) ,chiA基因在这 2菌株中获得高效表达。对表达产物的细胞定位测定表明 ,几丁质酶不仅存在于细胞周间质和胞内 ,而且还分泌到培养物上清液中。在对数生长后期 ,胞外、胞间质和胞内的几丁质酶活性分布分别为 2 3 %～ 2 8%、45 %～ 5 1 %和 2 1 %～ 3 2 %。经SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳检测表明 ,表达的几丁质酶蛋白分子量为 5 8kD。在受体细胞内 ,质粒pMChiA的稳定性要比质粒pKChiA高。     

运用生色基因标记黄瓜根围促生菌(PGPR)筛选菌株

采用三亲交配方法 ,通过Tn7转座系统将lacZY标记基因导入黄瓜根围促生菌 (PG PR)筛选菌株PseudomonasfluorescensCN1 1 6和PseudomonascorrugataCN31的利福平抗性突变株中 ;标记假单胞菌菌株则被赋予了利用乳糖作为唯一碳源的能力 ,在只有乳糖的M9培养基上生长能分解X Gal,菌落显出特有的蓝色 ;经Southern杂交分析 ,证明标记基因lacZY存在于转化菌株的染色体上 ;经验证标记菌株标记性状稳定 ,与对应的野生菌株比较其它性状如培养性状、形态特征、生防效果等基本不变 ;PGPR菌株利福平抗性和生色基因标记的结合 (双标记 )能最大限度地将土壤中引入的PGPR菌株与土著细菌分开 ,检测下限可达 1 0CFU mL ,为PGPR在根围的分子生态学研究提供了一个较好的工具。     

维生素C混合发酵中产酸菌基因文库的构建

在对氧化葡萄糖酸杆菌ＳＣＢ３２９的纯培养方法进行了探索并获得了一定量的纯培养的ＳＣＢ３２９菌体的前提下,用常规方法抽提得到Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ　ｏｘｙｄａｎｓ　ＳＣＢ３２９染色体ＤＮＡ。选用质粒ｐＫＳ作为载体,该载体具有氨苄抗性以及ｌａｃＺ基因．用限制酶对染色体进行部分消化,将一定范围内的消化片段回收后与载体连接,连接产物转化Ｅ.ｃｏｌｉＤＨ５ａ感受态细胞,利用蓝白斑特性选出重组子构建ＳＣＢ３２９基因组文库。用低熔点琼脂糖将ＳＣＢ３２９菌体包埋起来,对包埋在凝胶块中的细菌     

mel基因在酿酒酵母菌中的克隆和表达*

构建了含mel基因的重组质粒pAJM,并转化到酿酒酵母菌中,获得了在平板上产生黑色表型的转化重组子,为酵母菌的遗传操作提供了一种新的选择标记。由于mel基因经酪氨酸产生的黑色素无毒、无害,安全稳定,无需另外加显色化合物或使用特殊的仪器设备,直接在平板上观察结果。因此,是一种便捷、价廉、无污染的新型报告基因。此外,实验中还发现含mel基因的酵母菌生长迅速,这不仅作为报告基因更能显示其优势,而且也为进一步研究其在酵母菌中的功能提出了新的内容。     

弱氧化醋杆菌阿拉伯糖醇脱氢酶基因克隆及其在大肠杆菌中的表达

The partial genomic library of Acetobacter suboxydans was constructed using Yeast\| E.coli shuttle plasmid YEp352 as vector.Two positive transformants,designated as DH5α(pAD91) and DH5α(pAD98),were obtained by screening the growth of transformants on the agar plate in which D\|arabitol was used as the sole carbon source.The results of Southern blot and restriction endonuclease analysis showed that the two recombinants are identical.The insert is about 2.3kb.Arabitol dehydrogenase activity assay indic…     

在大肠杆菌中人腺病毒5型及昆虫核多角体病毒晚期启动子表达CAT基因

本文证明,含有人5型腺病毒及苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒(AutograPha californica Nuclear Polyhedrosis Virus, AcNPV)启动子的DNA片段,可在大肠杆菌中起始氯霉素乙酰基转移酶(Chloramphenicol Acetyltransferase,CAT)基因的转录和表达,使转化宿主菌表现为氯霉素抗性型。这说明,除痘苗病毒启动子外,其它人类病毒及昆虫病毒的启动子也能有效地在大肠杆菌中工作。