小麦丛矮病毒核衣壳的分离及其核酸、蛋白质组成的研究

结合有机溶剂沉淀、聚乙二醇沉淀及差速离心和等电点沉淀等方法可以获得小麦丛矮病毒核衣壳的纯化制剂。应用多种分离方法可以把核酸或蛋白质从核衣壳分离出来。碱水解及S_1核糖核酸酶酶解实验证明小麦丛矮病毒的基因组为单链RNA,双向纸电泳及层析方法测定其碱基组成比例为A=30.3,G=16.3,C=16.7,U=36.6。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳可分离到6～7个蛋白组分,其中相应于一般弹状病毒的核衣壳组分为L,分子量140,000,N分子量46,000,NS分子量40,000。     

小麦丛矮病毒核衣壳的分离及其核酸、蛋白质组成的研究

结合有机溶剂沉淀、聚乙二醇沉淀及差速离心和等电点沉淀等方法可以获得小麦丛矮病毒核衣壳的纯化制剂。应用多种分离方法可以把核酸或蛋白质从核衣壳分离出来。碱水解及S_1核糖核酸酶酶解实验证明小麦丛矮病毒的基因组为单链RNA,双向纸电泳及层析方法测定其碱基组成比例为A=30.3,G=16.3,C=16.7,U=36.6。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳可分离到6～7个蛋白组分,其中相应于一般弹状病毒的核衣壳组分为L,分子量140,000,N分子量46,000,NS分子量40,000。     

中国对虾非包涵体型杆状病毒核衣壳的分离纯化

An effective procedure for isolation and purification of nucleocapsids of Penaeus chinensis non-occluded baculovirus (PcNOBV) which has destroyed the Chinese shrimp industry since 1993 was described. Gill, stomach, gut and cuticle epidermis under exoskeleton were excised from cultured P. chinensis diseased with typical white spot syndrome and homogenized in liquid nitrogen with TNE buffer containing PMSF and β-ME. The homogenized mixture was filtered through a 0.45μm millipore filter membrane to remove cell debris and ultracentrifuged to pellet the remaining material.The pellet was suspended in PMTNE buffer and laid onto a handmade CsCl gradient. An obvious viral band was observed in the middle of the gradient. Large amounts of virus nucleocapsids were visualized under electron microscope consistently corresponding to the milk-colored viral band. The viral envelope was all lost after purification. The nucleocapsid was bacilliform averaging 80±13nm×380±24nm in size. The negatively stained PcNOBV nucleocapsids revealed 13-16 conspicuous stripes located periodically perpendicular to the longitudinal axis of the nucleocapsids. Six to seven capsomers of 9 nm in diameter were visualized on each side of the stripe.     

SARS病毒核衣壳蛋白、膜蛋白在大肠杆菌中的高效表达和纯化

通过反转录PCR获得了SARS冠状病毒核衣壳蛋白(N)和膜蛋白(M)基因,其序列分析结果与加拿大多伦多株完全一致。将M基因和N基因克隆到大肠杆菌表达载体pET22b和pBV222上,并在大肠杆菌中以包涵体及可溶形式获得高效表达。通过离子交换、金属螯合层析纯化获得电泳纯制品。所获得的核衣壳蛋白具有良好的抗原性,可用于抗SARS抗体检测及亚单位疫苗研究。     

水痘—带状疱疹病毒分离株核衣壳的形态特征

本文用超萍切片电镜技术对水痘－带状疱疹病毒（VZV）分离株J1的核衣壳进行了形态学研究。结果表明,在病毒感染后5小时即可观察到细胞核内大量的病毒核心相关颗粒和少量核衣壳。在细胞核内和细胞浆内均可见到病毒基质或毒浆结构。VZVJ1株具有三种类型的核衣壳,命名为A型、B型、C型核衣壳。A型具有电子致密核心,B型的核心呈颗粒状,C型具有电子透明核心。三种核衣壳大小一致,直径75－100nm,核心为35－55nm。将VZV的核衣壳与疱疹病毒科其它成员作了比较分析,并对各种核衣壳在病毒成熟过程中的作用进行了探讨。     

猪传染性胃肠炎病毒重组核衣壳(N)蛋白的纯化

通过对大肠杆菌表达,经载体pPROEXHTb克隆的TGEV重组N蛋白纯化方法中一系列条件的探索,最终得到了纯化融合蛋白的最佳优化方法。即在裂解液中含有1mM PMSF的条件下,分别经过2倍体积的bufferA和bufferB洗脱后,再收集pH5．9,含有80mM咪唑的1倍体积bufferC洗脱液,在波长280nm处检测蛋白吸收值A,再将峰值经SDS－PAGE电泳分析,可得到纯度较高的融合蛋白。     

核酸分离纯化实验指南

总RNA提取常见问题分析Q:RNA降解A:1.新鲜细胞:如果试剂没有问题,且外源性污染也可以排除,那么降解几乎都来自裂解液的用量不足。如果将裂解液直接加入培养吼中裂解细胞,一定要使裂解液能覆盖住细胞。2.新鲜组织:某些富含内源核酸酶的样品(如肝脏,胸腺等),即使使用电     

高分子量尿激酶和低分子量尿激酶的分离、纯化及其某些性质的比较

就分子量而言尿激酶以两种形式存在,即高分子量尿激酶(H-UK)和低分子量尿激酶(L-UK)。分子量分别为54,000和33,000。临床实践表明H-UK治疗血栓症的效果明显比L-UK好。动力学的研究也证明H-UK激活其天然底物溶纤酶原(PG)     

火菇素的分离纯化及其分子量的测定

火菇素是一种从金针菇Flammulina Velutipes中分离纯化出来的具有抗癌活性的简单蛋白。用SDS-PAGE系统,通过与已知分子量的标准参照蛋白比较,确定火菇素的分子量为24kDa．这一结果与其氨基酸组成分析相比偏大,进一步通过电喷雾离子化质谱法(ESIMS)分析,精确测定火菇素的分子量为19891．13Da。推测由于火菇素蛋白与SDS的非正常结合是造成蛋白质在SDS-PAGE中迁移变慢导致偏差的原因。     

罗氏沼虾体内两种病毒颗粒的分离、纯化与核酸特性

从患肌肉白浊症状的罗氏沼虾幼苗体内分离纯化得到两种大小不同的病毒颗粒.这两种病毒颗粒均为对称的20面体结构,表面光滑,无囊膜,对氯仿不敏感.一种是直径为26nm～27nm的颗粒,在氯化铯中的密度为132g/cm3,病毒基因组含两段单链的RNA,分别为30kb和12kb,具有诺达病毒科成员的特征.一种是直径为14nm～16nm的颗粒,在氯化铯中的密度为133g/cm3,含有一段大小为09kb的单链RNA,拟为卫星病毒样颗粒或辅助病毒.     

腮腺炎病毒的结构多肽——分子量的电泳测定

腮腺炎病毒感染鸡胚后收集尿液和羊水,通过差异离心和蔗糖密度梯度离心提纯宥毒。经SDS—PAGE分离,以铬银染色法结合溴化乙锭和考马斯亮兰染色,发现病毒含有13种结构多肽,分子量分别为79,74,70,65,61,59,56,53,50,45,41,34和31 x103d。     

鳜血清免疫球蛋白的分离纯化及其亚单位分子量的测定

免疫球蛋白(Immunoglobulin,Ig)在脊椎动物体液免疫中起着十分重要的作用.近年来,鱼类屹的研究已受到免疫学家的广泛关注。大多数硬骨鱼类只发现有一种Ig,类似于哺乳动物的IgM,但不是五聚体,而是由8条重链(H链)和8条轻链(L链)组成的四聚体.然而,IgM的结构在不同鱼类甚至同一种鱼的不同部位(如血液、粘液和胆汁等)有所差异。       

蜱传脑炎病毒衣壳蛋白的可溶性表达、纯化及初步应用

目的 构建蜱传脑炎病毒(tick-borne encephalitis virus, TBEV)衣壳蛋白(capsid protein, C)原核表达质粒,并以其表达、纯化的C蛋白作为抗原检测临床血清,评价其在蜱传脑炎(tick-borne encephalitis, TBE)临床血清学诊断中的应用。方法 登录Genbank对TBEV“森张”株C蛋白基因序列设计扩增引物,以PCR扩增C蛋白目的基因并克隆至原核表达载体pET-32a(+)后,构建重组表达质粒pET-32a-C。再将其转化至大肠埃希菌BL21(DE3)感受态细胞,采用IPTG诱导剂诱导表达,表达产物经Ni-NTA亲和层析纯化后,Western blot检测其反应原性;以制备的C蛋白作为包被抗原,用间接ELISA分别检测20份TBEV IgG抗体阳性临床血清、10份流行性乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus, JEV)阳性临床血清及20份阴性血清,并计算检测的特异性和敏感度。结果 重组表达质粒pET-32a-C序列测定正确;经12%SDS-PAGE电泳分析,重组C蛋白主要为可溶性蛋白表达;纯化...     

家蚕核型多角体病毒及核衣壳的纯化和其结构蛋白的凝胶电泳分析

 用差速离心和蔗糖密度梯度离心提纯了家蚕核型多角体病毒及其核衣壳,并用SDS聚丙烯酰胺凝胶(均一胶和梯度胶)电泳分析了它们的结构蛋白。测量使用游标卡尺,计算使用微型计算机。凝胶用很染色方法染色。 结果表明,家蚕核型多角体病毒长381.2±17.81纳米,直径88.86±9.605纳米;核衣壳长328.9±5.917纳米,直径41.36±1.167纳米。两种凝胶电泳所得数据显示病毒粒子至少含有20组分子量不同的结构多肽,含量较多的是P31、P40、P28和P20。P45和一些小分子多肽看来主要存于囊膜上。P31的分子量与多角体蛋白相同,我们的实验表明它可能是病毒粒子和核衣壳的结构组分。     

构建一种新型腮腺炎病毒核酸检测阳性对照品

为快速鉴定腮腺炎病毒核酸检测中由阳性对照引起的交叉污染问题,本研究建立了一种新型腮腺炎病毒核酸检测阳性对照。该阳性对照为合成的RNA转录产物,在使用相同的引物和反应条件下,该阳性对照在RT-PCR和巢式PCR试验中产生的PCR产物和正常腮腺炎病毒核酸阳性标本的PCR产物片段长度不同,通过比较PCR产物的大小可快速鉴定由阳性对照引起实验室交叉污染。这种新型腮腺炎病毒RNA阳性对照可广泛应用于腮腺炎病毒实验室诊断和基因定型中,对腮腺炎病毒核酸检测可进行良好的实验室质量控制。     

EB病毒核抗原1羧基端的原核表达、纯化及其免疫学特性

为进一步研究EB病毒核抗原 1(EBNA1)的功能及提高EB病毒 (EBV)相关疾病辅助诊断的特异性 ,对EBNA1基因 3′端的部分片段进行了原核表达、纯化并初步研究其免疫学特性 .采用PCR法扩增了EBNA1基因编码区 ,经酶切鉴定、序列分析后 ,将其 3′端 5 73bp片段克隆至原核表达载体pET30a中 ,得到重组质粒pET30a SS5 80 .该重组质粒转化大肠杆菌BL2 1(DE3)感受态细胞并经异丙基 β D 硫代半乳糖苷 (IPTG)诱导表达出分子量约 2 5kD的融合蛋白 (2 5 kDEBNA1) .该蛋白以包涵体和可溶形式存在 ,均可用Ni2 + 离子亲和柱纯化 .Western印迹结果显示 ,该蛋白能与鼻咽癌 (NPC)病人血清发生特异性反应 .纯化的 2 5kDEBNA1蛋白免疫BALB c小鼠后 ,经ELISA检测获得了高效价的多克隆抗体 .免疫印迹和间接免疫荧光结果显示制备的免疫小鼠血清能够与HeLa细胞中瞬时表达的EBNA1蛋白发生特异性反应 ,且特异性优于鼻咽癌病人血清 .以上结果表明成功构建了EBNA1羧基端的原核表达质粒 ,并在大肠杆菌中高效表达了 2 5kDEBNA1蛋白 ,该蛋白具有良好的抗原性和免疫原性     

黄粉虫幼虫小分子量抗茵肽的分离纯化

昆虫抗菌肽具有良好的抑菌效果,有望开发成新一代抗生素。本文以金黄色葡萄球菌和大肠杆菌混合液作为诱导源,采用针刺法使黄粉虫TenebriomolitorL．幼虫感染微生物产生抗菌肽,并对抗菌肽进行了提取、色谱分离纯化及抑菌活性检测。结果显示,诱导组和对照组的三氟乙酸粗提物无抑菌活性;经SephadexG50、SuperdexPeptide凝胶色谱分离后,从诱导组和对照组均可获得对革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌有抑菌作用的组分,而且诱导组活性明显高于对照组;通过Resource15RPC反相色谱分离纯化,从诱导组获得一具有明显抑制革兰氏阳性菌的组分,质谱检测该组分为混合肽,主要由分子量为1876．21u、1904．21u的小肽组成,可能是一种比Thanatin分子量更低的昆虫抗菌肽。     

小鼠诺如病毒分离鉴定及病毒衣壳蛋白基因序列分析

目的了解广东地区小鼠诺如病毒（murine norovirus,MNV）的分子遗传特征和进化来源。方法采用小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞对RT-PCR检测为阳性的小鼠样本进行病毒分离,通过细胞病变、RT-PCR、间接免疫荧光试验、测序方法对病毒分离株进行鉴定。应用RT-PCR技术针对15株MNV分离株的VP1基因的1626个核苷酸片段进行基因扩增,将扩增产物连接在pMD18-T载体后转化到大肠杆菌中进行克隆。通过氨苄青霉素平皿筛选,将鉴定为阳性的克隆菌进行核苷酸序列测定及序列分析。将这15株MNV分离株与从GenBank获得的19株MNV参考株进行序列比较分析,基于VP1基因的1626核苷酸片段构建系统发生进化树,一起进行分子流行病学研究。结果从80个小鼠样本中分离到了15株MNV病毒,通过细胞病变试验、RT-PCR试验、间接免疫荧光试验和测序分析鉴定确认分离到的病毒为MNV。序列分析结果显示MNV分离株的VP1蛋白基因全长均为1626个核苷酸,广东地区15株MNV分离株的核苷酸和氨基酸同源性分别在89.7%~100%和94.8%~100%之间,15株MNV分离株与其他19株MNV参考毒株核苷酸和氨基酸同源性分别在87.5%~92.9%和92.4%~98.2%之间。进化树分析表明来自设施A和设施D的13株病毒之间的亲缘关系较近,同属一个进化分支。来自设施B的ZD-1毒株和设施C的ZYY-163毒株与来自广东（K162）、日本（S7-P2、S7-PP3）、韩国（K4）和德国（Berlin/04/06/DE、Berlin/05/06/DE）同属另一个进化分支。结论成功分离到15株MNV病毒。遗传进化分析表明广东地区的MNV分离株来源并不相同,来自设施B和设施C的MNV分离株与国外分离株的亲缘关系较近,而来自设施A和设施D的13株MNV分离株可能是本地固有的毒株。