鱼类染色体组工程及其应用

鱼类具有产卵量大、体外受精的特点,是进行染色体组工程(Genome Engineering)研究的理想材料。运用染色体组工程技术可诱导鱼类的雌核发育(Gynogenesis)、雄核发育(Androgenesis)和多倍体(Polyploid)。雌核发育、雄核发育不仅可以用于建立近交系、生物学基础理论研究,而且还可以用于鱼类的单性养殖。多倍体在提高鱼类的生长率、成活率、抗病力以及种群控制等方面具有很大潜力。     

鱼类雄核发育的研究进展

雄核发育是在雄核控制下发育的一种特殊的有性生殖方式,它是鱼类单性发育的重要组成部分。本文全面综述了国内外鱼类雄核发育研究的进展状况。主要包括雌核染色体灭活和雄核二倍化诱导技术。雌核染色体灭活主要通过γ、X和紫外线(UV)等辐射处理完成的,其辐射剂量和方法因研究者不同而不同。雄核的二倍化诱导则主要是采用静水压和温度休克阻止第一次有丝分裂来实现的,其二倍化诱导条件与研究的种类不同而有所差异。同时,本文对鱼类雄核发育在遗传育种中的应用前景作了评价。 Abstract：Fish andtogenesis is a kind of secial sexual development which is controlled by male nucleus and it is an important part of fish unisexual development. This paper summarizes the progress of fish androgenesis comprehensively in the world.It includes the techniques of inactive female nucleus of eggs and diploidization of male nucleus. The methods of inactive female nucleus are carride out by using γ,X and ultraviolet (UV)rays to irradiate the eggs,the irradiation dosages and methods are different based on the different researchers. The techniques of diploidization of male nucleus are carried out by using hydrostatic pressure, heat and cold shock to restrain the fish mitosis,the diploidization condition are different from species to species.Meanwhile,the paper evaluates the application perspectives of fish androgenesis on the genetics and breeding.     

虾夷扇贝雄核发育单倍体的人工诱导研究

人工雄核发育,是利用遗传失活的卵子与正常精子受精,再利用染色体加倍技术使受精卵恢复为二倍体的遗传操作技术。利用该技术可大大加速品系纯化的过程,对遗传育种学研究有重要意义。目前有关鱼类雄核发育的研究已见于鲤( Gyprnus carpio)1,2、虹鳟( Oncorhynchus mykiss)3、红点溪鳟(Salvelinus fontinalis)4、泥鳅(Misgurnus anguilicaudatus)5,6、斑马鱼(Danio rerio)7、马苏大麻哈鱼(Oncorhynchus masou)8等种类。人工诱导贝类雄核发育的研究资料在国内外都很少,目前只有栉孔扇贝和太平洋牡蛎雄核发育诱导条件及其发育早期荧光显微观察方面的报道9,10。虾夷扇贝(Patinopecten yessoensis) 原产于日本,目前已成为北方沿海地区一种重要的增养殖种类,具有很高的经济价值,同时也是目前海洋贝类育种研究的对象之一。本实验首次研究了紫外线照射对虾夷扇贝卵子遗传失活的影响,成功诱导出雄核发育单倍体,为今后开展虾夷扇贝雄核发育二倍体的人工诱导奠定了基础,现将其结果予以报道。       

人工诱导泥鳅与大鳞副泥鳅雄核发育单倍体子代的RAPD分析

用３０个经过筛选的随机引物对３组泥鳅雄核发育单倍体、２组大鳞副尼鳅雄核发育单倍体及其相应亲本进行了ＲＡＰＤ分析。结果表明,雄核发育倍体子代与其父本的ＲＡＰＤ谱带相似率为９７．０％－９７．８％,与母本相似率为３０．３％－５９．５％,子代中的非亲本谱眩为０－０．０２９,极少母本特异谱带。这一结果说明雄性发育鱼类单倍体的遗传信息主要来自父本,且存在着个体差异,雄核发育子代存在ＤＮＡ变异和母本ＤＮＡ非特异带,但并非其必要条件。     

小麦(Triticum aestivum)雄核发育的细胞学研究

本工作对小麦花粉胚和愈伤组织的诱导条件和雄核发育的细胞学现象作了研究。结果如下:(1)N_6培养基诱导花粉愈伤组织的效果显著优于 MS 培养基。外源激素对于雄核发育的启动不是必需的,但对愈伤组织进一步的生长却是不可缺少的。(2)用花药整体制片法研究了雄核发育的各种途径,结果表明,不均等分裂和均等分裂的小孢子都能形成花粉胚,但前者占较大比例。(3)在部分多细胞花粉和白化苗中观察到染色体断片和微核,推测白化或畸形的花粉植株可能起源于具微核的花粉。(4)细胞的核内再复制和游离核的融合是产生二倍体和多倍体花粉植株的重要原因。     

两种发育型鱼类卵母细胞成熟过程中促精核发育现象的研究

采用实验细胞学技术,比较研究了红鲤精核在雌核发育鱼类(银鲫)和两性融合发育鱼类(红鲤、彩鲫)卵母细胞成熟各阶段中的发育状况,结果表明:在两性融合发育鱼类中,当卵母细胞发育到胚泡破裂期吋,精核开始解凝发育,及至第一次成熟分裂中期后阶段,高度解凝的精核才开始原核化,相应地,在雌核发育银鲫中,精核也只有在与胚泡物质接触后,才能开始解凝,并且在三极纺锤体形成后期初步原核化,但与两性融合发育鱼类相比,精核的原核化程度明显降低。这些实验结果初步揭示,在两性融合和雌核发育鱼类卵中均可产生促精核解凝和原核化的两类因子(SNDFs和SPDFs),其中SNDFs的活性表达起始于卵母细胞胚泡破裂时期,而SPDFs活性则产生于第一次成熟分裂中期后或三极纺锤体形成后阶段,并且两性融合发育鱼类卵中的SPDFs活性远远高于雌核发育鱼类卵母细胞。     

鱼类性别控制在水产养殖上的应用

近十年来,生物技术在水产养殖上的应用日益受到重视,并已见初效.现就鱼类性别的控制,包括性反转法、人工雌核发育、雄核发育、种间杂交法、三倍体不育性的利用,简述如下:一、性反转法首先,Yamamoto(1968)在金鱼上用甲基睾丸素进行性反转的试验,并证明金鱼的性决定为XY型.Schreck(1974)综述了在鱼类上用性激素来处理控制性别是有效的.Hunter(1983)也总结了性反转法及其在鱼类养殖上的应用.菲律宾的Guerrero     

大麦的花药培养与雄核发育

本实验初步研究了影响大麦花药培养的各种因素,比较了不同类型品种诱导频率的变化规律,并对花粉雄核发育的途径与类型进行了细胞学观察。最后,作者就大麦花药培养与雄核发育的某些特点与问题提出了见解。     

水稻雄核发育途径及游离花粉粒培养的活体观察

(1)在水稻雄核发育中,观察到 A—V、A—G、A—GV 和 B 途径,通常 B 途径占优势。在雄核发育早期,各种发育途径的花粉均有退化现象发生。(2)观察和统计表明,游离核型的多核花粉在发育过程中可转变为多细胞花粉,因而也是有发育前途的。(3)能够启动雄核发育的花粉通常是原生质稠密,在花粉群体中属中等大小(35—40μ)的花粉。多细胞花粉在突破花粉壁前。其细胞壁常常加厚,破壁时整个花粉有突然收缩的现象。(4)多细胞花粉内通常含有一些缓慢运动的小淀粉粒,它们可能积极参与了花粉雄核发育过程中的代谢活动。     

人工培养条件下君子兰雄配子体发育与核酸、蛋白质合成的研究

作者建立了离体培养君子兰雄配子体的简易方法并观察了其发育过程。应用核酸、蛋白质合成抑制剂和放射自显影技术,研究不同发育阶段雄配子体的核酸和蛋白质的合成。发现四分孢子释放以后,DNA 的合成仅在有丝分裂间期的细胞核内进行;散粉前96小时至精细胞形成,营养核、生殖核和精于核中均未见~3H-胸苷掺入。RNA 和蛋白质合成的动态相似,各有三次高峰和两次停顿。抑制剂的种类和加入的时间、数量对发育的影响不同,显示了 DNA、RNA 和蛋白质合成间及生物大分子合成与雄配子体形态发育间的相关性。     

鱼类遗传育种中生物学方法的应用及研究进展

鱼类遗传育种是指利用生物学方法对鱼类进行遗传选择或改造,从而获得新型改良鱼类的过程;它可以通过人为选择优势遗传性状或者通过整合或改变已有的遗传性状而达到遗传改良的目的.鱼类遗传育种是一个从稳定品系中筛选或研制变异品系,再从变异品系中培育稳定品系的循环过程.鱼类良种的培育成功将在很大程度上带动良种的饲养、加工、销售、休闲等后续产业的发展,这在渔业经济发展中具有重要意义.本文系统地总结了包括传统选择育种、分子标记辅助育种、全基因组选择育种和单性控制育种在内的选择育种技术,综述了杂交育种(近缘和远缘杂交)、细胞核移植、生殖干细胞和生殖细胞移植、人工雌核发育和雄核发育技术、多倍体育种在内的性状整合育种技术,以及以转基因育种为代表的性状改造育种技术,乃至这些育种技术在鱼类育种中的应用情况,同时结合本实验室在鱼类远缘杂交、雌核发育和雄核发育等染色体倍性育种方面的研究成果,对国内外鱼类育种的研究现状以及存在的问题进行了系统的概述.     

同源四倍体萝卜雄配子体发育

利用爱氏苏木精染色-冬青油透明"技术,首次报道了同源四倍体萝卜(2n=4x=36)雄配子体的动态发育过程.结果表明:同源四倍体萝卜小孢子核经一次有丝分裂产生营养核与生殖核,生殖核再经一次有丝分裂形成两个精核,最终形成3-细胞型成熟花粉,与相应的二倍体雄配子体的整个发育过程相似;四倍体花粉具2个、3个或4个萌发孔,二倍体多为3孔花粉;四倍体雄配子体发育过程中异常频率为32%,比二倍体高20%,败育主要发生在四分体时期和单核期.     

Cytological Mechanism on the Integration of Heterologous Genome or Chromosomes in the Unique Gynogenetic Carassius auratus gibelio

银鲫（ＣａｒａｓｉｕｓａｕｒａｔｕｓｇｉｂｅｌｉｏＢｌｏｃｈ）是行天然雌核发育生殖的两性型三倍体鱼类,与普通两性融合生殖鱼类相比,具有独特的育种优势。八十年代以来,异育银鲫、复合四倍体异育银鲫的发现表明,雌核发育卵子不但具有保持自身全部染色体的能力,还能整合异源精子的部分遗传物质或整个基因组,影响雌核发育后代的性状。因此,搞清楚异源基因组的整合机制对于进一步弄清其发育模式以及诱导复合多倍体银鲫均具有十分重要的作用。两性融合发育鱼类的精子入卵后,精核在促精核活化因子的诱导下,可以逐渐解凝并形成雄性原核;而在天然雌核发育银鲫受精卵中,精核的解凝和原核化却被抑制。去掉卵壳的控制作用后,精核虽能在卵质中解凝却仍不能形成雄性原核（Ｆｉｇ．１）。可见,雌核发育银鲫与两性融合发育鱼类的卵质间必定存在某些差异。对哺乳类和两栖类卵质诱导精核原核化作用的研究表明,ＤＴＴ和蛋白水解酶能够分别还原精核组蛋白中ＳＳ和水解精核组蛋白,从而诱导精核在卵质中形成雄性原核。本文通过显微注射以及冷休克处理等诱导方法,探讨了人工诱导外源精核在银鲫卵中解凝和原核化,培育银鲫复合种的细胞学机制。实验结果显示,向银鲫卵质中注入胰蛋白酶、ＤＴＴ和     

八倍体小偃麦与普通小麦杂交后代花药培养的研究

本试验研究了八倍体小偃麦与普通小麦杂交后代愈伤组织的诱导频率、雄核发育和秋水仙碱诱导小孢子染色体加倍的效果。结果表明:八倍体小偃麦与普通小麦杂种F_1愈伤组织的产量具有明显的杂种优势;其雄核发育存在均等分裂和不均等分裂等类型,这与小麦中的观察结果相似;在培养基中加入秋水仙碱可以有效地诱导小孢子第一次有丝分裂时染色体加倍。     

禾本科牧草和草坪草雄核发育与单倍体育种研究进展

禾本科牧草与草坪草在农业可持续发展、城市绿化和生态环境保护方面起着至关重要的作用。近年来, 随着生物技术的发展, 国内外在牧草及草坪草雄核发育与单倍体育种研究方面取得了较大进展。该文在归纳总结该领域研究成果的基础上, 对影响禾本科牧草及草坪草雄核发育与单倍体育种的几个主要因素进行了探讨。大量研究结果表明, 供试材料的基因型是影响培养效率的最主要因素。小孢子发育到单核中期至晚期时有利于提高培养效率。培养前花药经过低温和甘露醇等预处理不但可以提高愈伤组织的诱导效率, 还可提高愈伤组织的质量。适宜的激素种类和配比也是影响培养成败的关键因素。同时, 总结了雄核发育再生植株的倍性鉴定方法和加倍技术, 对单倍体育种技术在禾本科牧草及草坪草育种中的应用前景进行了展望。     

在人工培养条件下君子兰(Clivia nobilis)雄配子体发育过程中营养核与生殖细胞的动态——显微缩时电影记录与一般细胞学观察

作者研究了君子兰(Clivia nobilis)营养细胞与生殖细胞的动态。用自行改良的显微培养室法和15%蔗糖加10ppm 硼酸的液体培养基,萌发了君子兰的花粉,并用暗视野显微电影记录了其雄配子体的发育过程。发现在一般情况下,营养核总是首先进入花粉管,然后生殖细胞入管,并以较快速度向管端移动,追上先入管的营养核。在生殖细胞进入早中期之前与营养核贴合,历时3—5小时才完全分开。分开后生殖细胞的核变大,并由前期进入早中期,通过赤道板阶段过渡到后期、末期,最终形成两个精子。用脱水处理和染色方法都可证明在生殖细胞分裂过程中,营养核在它的附近,直到两个精子形成之后,营养核仍存在。因此,作者认为营养核在整个雄配子体发育过程中,特别在精子形成中,是起一定作用的结构。其次,营养核、生殖细胞和精子在雄配子体发育过程中自始至终处于运动状态。其运动形式基本上可分三类:位移,旋转和变形。前二种运动常同时并存,但在不同的发育阶段中有一个为主要形式,另一个为次要形式。后一种运动的剧烈表现形式(如营养核成“变形虫状”,生殖细胞变形入管,生殖细胞和营养核的贴合以及生殖细胞分裂等)只是在特定的生理状态下才发生;轻微的变形可能与周围原生质压力的改变有关。作者根据营养核和生殖细胞在整个雄配子体发育过程中的动态得出结论:营养核、生殖细胞(后为精子)在花粉粒或花粉管中的运动,从本质上说是一种受内因制约向管端运动,但周围的原生质流作为外因,对它们的运动速度乃至于运动方向有暂时的影响。     

6-DMAP诱导PM胚胎形成过程中核纤层蛋白B的动力学变化

我们的前期研究发现:被微管抑制剂nocodazole抑制在第一次有丝分裂中期的小鼠受精卵在加入6-DMAP处理后核膜重新出现,并且父、母本的基因组未发生融合,分别形成了类似雌、雄原核的两个细胞核,它们共存于卵细胞质中,我们把这种特殊的胚胎称之为PM胚胎(post-mitoticembryo)。本研究表明:在去除抑制剂3h后未能形成核膜的胚胎进一步卵裂,而形成核膜的PM胚胎培养24h未见进一步发育。此外,我们采用免疫荧光染色观察PM胚胎核膜重现过程中核纤层蛋白B的动力学变化,结果显示:在加入6-DMAP后核纤层蛋白B在染色体周围逐渐聚集,约3h后核膜完全形成,此时核纤层蛋白B在染色体周围的聚集达到最高峰。文中还对6-DMAP诱导核膜形成的机制进行了探讨。     

人二倍体化合子的DNA 甲基化变化模式

目的:探讨人类三原核合子及二倍体化合子中DNA甲基化模式的变化情况。方法:我们采用显微操作技术去除三原核合子中两个雄原核中的一个,观察恢复了二倍体状态的胚胎的发育情况,并检测了三原核和二倍体化的合子及早期胚胎中DNA甲基化模式的动态变化。结果:二倍体化的合子的囊胚形成率与三原核合子的囊胚形成率无显著性差异;在人三原核合子中两个雄原核发生主动地DNA去甲基化而雌原核在受精后的20h后仍保持甲基化。三原核与二倍体化合子中,DNA甲基化模式没有差别。结论:去除一个雄原核不会影响合子和胚胎的DNA甲基化模式。去除多余雄原核并不能改善胚胎的发育。     

天然雌核发育银鲫卵子控制异源精核发育的受精学机制

作者对两性融合生殖鱼和雌核发育银鲫脱膜卵受精的精核发育进行了观察,并采用鱼类卵子无细胞系对以上两类卵质提取物体外诱导经Ｔｒｉｔｏｎ—Ｘ１００处理的精子及其发育进行了初步研究,结果表明在两性融合生殖型脱膜鱼卵中精核通过解凝最终形成原核,而在雌核发育的银鲫脱膜卵子中部分精核体积虽有一定程度的增加,但始终没有观察到原核的发育;在体外诱导实验中,经Ｔｒｉｔｏｎ—Ｘ１００处理的精子在两类卵质提取物中充分发育,都出现了类似体内原核的状态。该现象提示在银鲫卵质中存在有促使精核形成原核的因子,但在正常受精状态下,由于银鲫卵质促使精核核膜解体的功能的异常,使覆盖精子头部的核膜不能象在两性融合生殖受精卵子中进行崩解,精核进一步的原核发育受到抑制。另外,建立体外诱导系统的重要意义,在于它为研究雌核发育调控的分子学机制提供了一条有效途径。     

用雄核发育方法制备改良异源四倍体鲫鲤群体

用UV照射金鱼的卵子使其卵核的遗传物质失活, 再与异源四倍体鲫鲤(AT)产生的二倍体精子受精, 在无雄核染色体加倍处理情况下, 成功地获得了两性可育的二倍体雄核发育鱼(A₀). Ⅱ龄性成熟的A₀自交形成了雄核发育鱼自交子一代(A₁). 本研究对10月龄A₁的染色体数目、性腺的显微和亚显微结构以及外型特征进行了观察, 实验结果表明: (ⅰ) A₁中包含有四倍体(A₁-4n)、三倍体(A₁-3n)以及二倍体后代(A₁-2n), 他们所占比例分别为85%, 10%和5%, 其染色体数目分别为4n=200, 3n=150和2n=100. 其中四倍体和三倍体的形成证明二倍体A₀能产生二倍体配子. 二倍体雄核发育鲫鲤杂交鱼产生二倍体配子的原因与早期生殖细胞的核内复制机制有关. (ⅱ) A₁-4n的性腺为两性型且发育正常. 其中雄性个体能挤出白色精液, 其中的二倍体精子头部明显比红鲫的单倍体精子头部大. 这些二倍体精子具有正常结构, 由头部和尾部组成, 头部与尾部交接处有多个线粒体, 精子尾巴的中央轴有典型的“9+2”微管结构. A₁-4n雌性个体的卵巢发育饱满, 其中含有大量Ⅱ, Ⅲ和Ⅳ时相的卵母细胞. 在Ⅳ时相卵母细胞的放射膜上能观察到受精孔. 同时期的A₁-2n, A₁-3n的性腺发育异常, 均表现为不育. A₁-2n的不育性与其为远源杂交二倍体有关, A₁-3n的不育性与其为远源杂交三倍体有关. (ⅲ) 与AT相比, A₁-4n不仅具有生长速度快、抗逆性强的优点, 而且在外型上具有体背高、尾柄短、头部小等优良性状. 本实验说明运用雄核发育技术不仅能获得两性可育的四倍体鱼, 而且能对异源四倍体鲫鲤进行有效的遗传改良, 这在细胞遗传研究和鱼类育种方面都具有重要意义.