Ⅱ型限制性核酸内切酶NcrⅠ的研究

 在肉色诺卡氏菌C-212株Nocardia carnea C-212中筛选到一种Ⅱ型限制性核酸内切酶NcrⅠ,经与BglⅡ的λDNA降解物的酶谱比较,以及酶识别特异性和切割位点的检测,证明了NcrⅠ是已知的限制酶BglⅡ的同切限制酶,而且其切割位点也与BglⅡ相同,其为:     

II型限制性核酸内切酶在真核生物染色体显带中的应用

限制性核酸内切酶（简称限制酶)能切割DNA双链。已知的限制酶有I, II和III型三类。II型限制酶能识别专一核普酸序列,并在识别序列内有固定切割点,是分子生物学研究和基因工程重要工具酶。1980年,以II型限制酶处理印度鹿染色体,沿染色体纵轴得到选择消化结果^[16]。目前,限制酶这一应用研究发展成称为限制性核酸内切酶显带（Restriction endonuclease banding）的最新显带技术,已应用于哺乳类、鸟类、两栖类、鱼类和昆虫等真核生物。限制酶显带与其他显带法相比有其特点,特别在揭示异染色质的异质性方面有其独到之处。本文介绍此项技术的发展与现状,并指出需要进一步探索的几个主要方面。     

大熊猫线粒体DNA的九种限制酶图谱

本文用9种限制性内切酶（BamHⅠ,BglⅠ,BglⅡ,EcoRⅠ,EcoRⅤ,PstⅠ,PvuⅡ,SalⅠ,XhoⅠ）分析大熊猫的线粒体DNA（mtDNA）。构建其中5种酶（BamHⅠ,EcoRⅠ,EcoRⅤ,PstⅠ,PvuⅡ）的mtDNA物理图谱。大熊猫mtDNA的分子大小约为16.4 Kb,酶切位点是随机分布。我们的结果为进一步研究大熊猫mtDNA进化提供了基础资料。     

介绍质粒DNA快速微量制备法

关于质粒制备,已有一些方法可以采用,经采用德是CsCl-溴化乙锭密度梯度离心^[2],其他还有Hirt^[6],Currier^[5],Colman^[3].Michael Zasloft^[7],Birnboin^[1].以及Cornelis^[4]等人的方法。但所有这些方法都太花时间。本文介绍一种快速质粒DNA微量制备的方法,能在2小时内制备出可被限制性内切酶切割并可用于绘制物理图谱的DNA制剂。     

鳜及大眼鳜线粒体DNA比较研究

采用10种限制性内切酶HindⅢ、EcoRⅠ、BglⅠ、BglⅡ、BamHⅠ、PvuⅡ、PstⅠ、SalⅠ、XbaⅠ、XhoⅠ对鳜及大眼鳜肝脏线粒体DNA（mtDNA）进行了分析。鳜鱼mtDNA分子量为9.703×106u,大小为16．19kb;大眼鳜mtDNA分子量为9．603×106u,大小为16．02kb。根据单、双酶切结果构建了鳜及大眼鳜mtDNA10种酶限制性酶切图谱,并对两种鱼的mtDNA酶切图谱进行了比较。     

滑鼠蛇肝线粒体DNA的限制酶图谱

用六种限制性内切酶BamHⅠ、EcoRⅠ、PstⅠ、BglⅠ、BglⅡ和SalⅠ对滑鼠蛇肝脏线粒体DNA(mtDNA)进行酶解。发现BglⅡ、PstⅠ、BamHⅠ、BglⅠ和EcoRⅠ在滑鼠蛇肝mtDNA上分别有1、2、3、3和4个切点。SalⅠ不能切割滑鼠蛇肝mtDNA。根据滑鼠蛇肝mtDNA的单酶、双酶完全酶解及部分酶解片段的数目和分子量,建立了滑鼠蛇肝mtDNA的限制酶图谱。     

分子信标检测限制性内切酶活性的新型荧光分析方法

利用分子信标被切割后荧光信号的变化.发展了一种简便的检测限制性内切酶活性的新型荧光分析方法.以限制性内切酶Xsp I为例.将其识别位点嵌入具有茎环结构的分子信标探针(Molecular Beacon,MB)的环状部分,利用这种分子信标在溶液中形成的瞬时二聚体结构,实现了限制性内切酶对分子信标的切割.在优化的条件下,反应初速度与酶的浓度成正比,线性范围为0.05～50 U/mL,检测限为0.05 U/mL.通过改变分子信标环部的识别位点的序列.还可以检测其他限制性内切酶如Alu I的活性.     

人乙型肝炎病毒(HBV)adr亚型基因组的多态性

由乙型肝炎adr亚型病毒(HBVadr)携带者26人的混合血清,得到了HBVadr基因组克隆株(PADR)158株,对这些克隆株进行四种限制性内切酶(BglⅡ,HindⅢ,PstⅠ,XhoⅠ)切点测定,并对其中S株的13种限制性内切酶图谱进行比较研究,发现同为adr亚型病毒,其基因组的限制性酶切图谱存在差异。另外,通过HindⅢ)切点得到的12个克隆株(PADR-H),也进行了酶切图谱分析。在这170个克隆株中,已经发现了5种类型的HBVadr基因组限制性酶切图谱,其中有6种酶(AvaⅠ,EglⅠ,BglⅡ,HincⅡ,HindⅢ,HpaⅠ)的7个变异点。本文报道了HBVadr基因组的多态性现象。     

鲤鱼肝组织线粒体DNA的限制性内切酶分析

用EcoRⅠI,HindⅢ,PstⅠ,BglⅡ,BamHⅠ,Xho Ⅰ, Xba Ⅰ, Sal Ⅰ和Kpn Ⅰ共9种限制性内切酶酶切对鲤鱼肝组织的mtDNA进行酶解,利用Gel-Pro Analyzer算出各酶切片段长度及mtDNA大小,测出其大小约为16．61kb(1kb=1×103b),另外,对电泳条件的优化进行了探讨,并将实骚结果与以前报道的有关酶切实验结果进行了比较,表明鲤鱼mtDNA的长度及限制性酶切位点均存在地域差异．     

猪流感病毒HA基因的克隆及杆状病毒转移载体的构建

猪流感病毒(swine influenza virus, SIV)不仅给养猪业造成重大经济损失,而且威胁人类健康.血凝素(hemagglutinin,HA)是SIV囊膜上的重要免疫原,介导病毒吸附和膜融合.针对流感病毒的中和抗体主要以HA靶标阻断受体结合,本研究通过RT-PCR扩增了猪流感病毒A/Swine/Inner Mongolia/547/01(H3N2)的HA基因,并将其克隆入pMD18-T载体.重组pMD18-T经Kpn I 和 Pst I 酶切后得到的HA基因插入pMelBacA载体的Kpn I/Pst I位点.PCR和限制性内切酶分析鉴定表明成功构建了pMelBacA-HA转移载体.这为开发HA亚单位疫苗奠定了基础.     

四个鲫鱼品系线粒体DNA的限制性酶切分析

用差速离心和核酸酶消化法从红鲫 (C auratusredvar .)、湘鲫 [F1hybridsofredcruciancarp (♀ )×commoncarp (♂ ) ]、野鲫 (C auratusauratus)和白鲫 (C auratuscuvieri)的肝组织及白鲫的卵巢中提取和纯化线粒体DNA。用 9种内切酶 (EcoRⅠ、HindⅢ、PstⅠ、BglⅡ、BamHⅠ、XhoⅠ、XbaⅠ、SalⅠ和KpnⅠ )进行单酶酶解 ,经琼脂糖凝胶电泳分析 ,检测出PstⅠ、KpnⅠ和BglⅡ 3种酶在品系间存在限制性片段长度多态性 ,但并未检测出品系内的限制性片段长度多态性。计算出红鲫、湘鲫、白鲫和野鲫的mtDNA大小分别约为 16 19、 16 0 2、 16 6 0和 16 0 6kb。根据限制性酶切片段共享度 ,计算出 4个品系间的遗传距离 ,结果表明存在直接亲缘关系的红鲫与湘鲫之间的遗传差异最小 ,证实了红鲫与子代湘鲫之间mtDNA遵循母系遗传的特性。     

分子生物学技术讲座（二）——分子克隆中所用的酶

限制性内切酶及其它DNA与RNA修饰酶是分子克隆技术的基本工具。1限制性内切醉和DNA甲基化酶限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性内切酶识别序列的特定的DNA序列或附近的序列,并在此切割DNA双链。它可以分成3类：Ⅰ类和Ⅲ类在同一蛋白分子中兼有修饰（甲基化）作用及依赖于ATP的限制（切割）活性。Ⅰ类酶结合于识别序列,但随机切割DNA;Ⅲ类酶能在识别序列位点切割DNA。在分子克隆中1类和皿类酶都不常用。D类限制一修饰系统限制性内切醇和修饰（甲基化）酶不在同一蛋白分子中,限制性内切酶能专一地切割识别序列,并不依…     

分离纯化限制性核酸内切酶的基本方法和纯度鉴定

为了适应研究工作需要,我们完成了BamHl、EcoRl、PstⅠ、AluⅠ、BglⅡ、SaiⅠ等十几种限制性核酸内切酶的分离纯化工作,样品在质量上达到国外同类产品的水平。这些酶制剂用于遗传工程及核酸结构功能研究已能取代相应的进口酶,促进了科研工作的发展。本文报道我们在制备限制性核酸内切酶中常用的几种方法,以及有实用意义的鉴定酶纯度的分析方法。一、材料与试剂 1.菌株:Arthrobacter luteus(ATCC21606),Bacillus globigii,Streptomyces albus G.     

限制性核酸内切酶Asc I蛋白质的表达纯化、酶活测定及小角散射结构解析

限制-修饰系统(RMS)是细菌为了防御外来DNA入侵而进化产生的一种保护机制。RMS系统可分为Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型和Ⅳ型。Asc I是一种Ⅱ型限制性核酸内切酶，能识别8-bp DNA基序。尽管Asc I已经被广泛应用于分子克隆研究中，然而目前尚无关于Asc I蛋白质的表达、纯化以及结构机制等方面的研究报道。本研究基于大肠杆菌重组表达体系建立了Asc I重组蛋白质的高效表达和纯化方法，从每升细菌培养物中可获得约2.5 mg纯度大于95%的Asc I蛋白质。进一步的酶学性质研究表明，Asc I酶切反应的最适温度是37℃,最适pH为7.5～8.5,反应依赖于Mg²⁺和Mn²⁺等二价金属离子。基于小角X射线散射(SAXS)分析技术，我们还建立了Asc I蛋白质及其与底物DNA复合物在溶液状态下的三维空间模型，并结合点突变对该模型进行了验证。总之，本研究对Asc I蛋白质的重组表达、纯化、酶活性质以及结构机制进行了比较系统地研究，为了解RMS系统的工作机制提供了结构基础，同时也为Asc I作为分子克隆工具酶的进一步开发和改造提供了理论依据。     

树qumtDNA限制性内切酶图谱及其与小家鼠褐家鼠的新缘关系

本实验用ApaⅠ,AvaⅠ,BamHⅠ,BclⅠ,BglⅠ,ClaⅠ,EcoRⅠ,EcoRⅤ,HpaⅠ,PstⅠ,PvuⅡ,ScaⅠ,XbaⅠ等13种限制性内切酶分析树qu(Chiromyscus chiropus) 的mtDNA限制性片段长度多态性,并用双酶解法构建了其中8种酶的限制性内切酶图谱。根据限制性片段差异法和分子钟,计算并讨论树qu和小家鼠(Mus musculus)、褐家鼠(Rattus norvegicus)的mtDNA遗传距离和亲缘关系。结果表明树qu与褐家鼠的关系较接近,两者的分歧时间在距今1500-2000万年前,即处于中新世早中期。     

谷氨酸棒状杆菌质粒pXZ 10145的限制酶图谱和嵌合质粒的组建

从谷氨酸棒状杆菌中已经分离到质粒pxzl0145,该质粒带有氯霉素抗性。通过电子显微镜和BamH I酵切后在1％琼脂糖凝胶电泳上测定pXZl0145质粒的大小为5．3kb。用Bam—HI、PstI、EcoRI、saII等限制酶进行酶切,并用BamH I+sa1 I、BamH I+Pst I、Pst I+sal I、EcoR I+Pst I、EcOR I+BamH I等双重酶切,得到pxzlol45限制性内切酶的图谱。证明BamH I和Pst I为单一酶切点。将pxzl0 145与pBR322利用BamH I切点连接得到一嵌台质粒pxz34。这一质粒能在大肠杆菌中复制,在大肠杆菌中表现有氨苄青霉素和氯霉素的抗性,但是抗氯霉素的能力大大降低,只抗2Y／ml。     

限制性酶

核酸限制性内切酶是识别双链DNA中专一序列的酶,主要从原核生物中提取。限制性内切酶可分为三类:第Ⅰ和第Ⅲ类酶在同一旦白中具有修饰作用(甲基化作用)和需要ATP的限制性裂解的活性。这两种酶都识别底物DNA中非甲基化的序列,不过第Ⅰ类酶的作用是随机的,第Ⅲ类酶则切DNA的专一位点。     

一种简便、通用的PCR产物克隆系统

目前应用PCR技术扩增目的基因进而得到克隆化基因的方法已被广泛地应用于分子生物学研究的各个领域。尽管在引物两端引入限制性内切酶识别位点定向高效地克隆目的基因这一设计思路极富魅力,但在实践这个思路的过程中经常遇到困难,其主要原因是由于当多种限制性内切酶的识别序列位于DNA片段的两端时,其酶切效率变得很低。这是因为限制性内切酶的切割效率同其识别位点两侧DNA的长度有很     

嗜热古菌Sulfolobus acidocaldarius核酸内切酶V的重组表达与酶学特征

[目的] 表达纯化嗜酸嗜热硫化叶菌（Sulfolobus acidocaldarius）的核酸内切酶V （Saci_0544）,对其核酸内切酶活性及酶学特征进行探究。[方法] 将Sulfolobus acidocaldarius核酸内切酶V （SacEndoV）在大肠杆菌中进行重组表达,经亲和层析纯化得到目标蛋白;利用带有不同类型损伤的寡核苷酸作为底物,结合变性聚丙烯酰胺凝胶电泳技术,鉴定SacEndoV对相应损伤寡核苷酸底物的剪切活性。[结果] SacEndoV特异性剪切含脱氧肌苷（Deoxyinosine）的损伤DNA底物,明显偏好单链DNA底物。SacEndoV在70-95℃温度范围内酶活性高,酶活性依赖于二价金属离子,Mg²⁺为最佳辅助离子,其最佳反应pH为7.5-8.0,高于200 mmol/L的NaCl会明显抑制其剪切活性。损伤DNA中脱氧肌苷3''端相邻的脱氧核糖核苷酸的结构完整性对于SacEndoV识别并剪切相应底物具有重要影响,脱氧肌苷3''端无碱基位点的存在使得SacEndoV不能够切断损伤DNA。此外,经测定SacEndoV对于含肌苷的损伤RNA底物具有剪切活性。[结论] 本研究证实SacEndoV是一种典型的核酸内切酶V,对含脱氧肌苷的损伤DNA具有特异性的内切酶活性,推测其在Sulfolobus acidocaldarius体内参与脱氧肌苷的切除修复。     

限制性内切酶诱发的姊妹染色单体互换

用限制性内切酶PstⅠ,SalⅠ,PvuⅡ和BamHⅠ处理CHO细胞后,发现其SCE率升高,与对照相比,前三种酶具有显著性差异。但这些酶诱导SCE的效应与其致染色体畸变效应相比则较弱,提示引起DNA双链断裂的限制性内切酶不是SCE的强刺激物。实验结果表明,BrdU取代胸苷不能消除限制酶对底物DNA的识别及裂解。