草鱼IRE1-like基因的克隆、组织表达及其对微囊藻毒素-LR的响应

为了研究内质网应激相关基因需肌醇酶1(Inositol-requiring enzyme 1, IRE1-like)的结构和生物学功能及其在草鱼(Ctenopharyngodon idella)响应微囊藻毒素-LR(MC-LR)中的作用,研究根据草鱼转录组测序结果得到该基因家族成员IRE1-like的EST序列,采用RACE技术获得了草鱼IRE1-like基因的cDNA全长序列(登录号:MG797683)。该基因序列全长3595 bp,包括3093 bp开放阅读框,编码1030个氨基酸,分子量为116.24 kD,理论等电点为6.26,具有跨膜结构和信号肽。草鱼IRE1-like基因包含Luminal (39—307 aa)、STKc (569—834 aa)和RNase (837—915 aa)三个结构域。同源性和系统进化树结果表明草鱼IRE1-like基因与斑马鱼IRE1-α基因亲缘关系最近。荧光定量PCR(qRT-PCR)检测结果表明,草鱼IRE1-like基因在肝脏组织中的表达量最高,在肌肉、脾脏、鳃和心脏等其他8种不同组织中也均有表达。不同剂量MC-LR诱导草鱼24h和96h...     

微囊藻毒素LR对草鱼肝脏超微结构影响的研究

关于微囊藻毒素对哺乳动物的影响已有较多的研究,指出微囊藻毒素LR是一种作用于肝脏的极强环肽毒素,并能引起肝细胞超微结构的改变［‘］,但是有关该毒素对鱼类影响的报道却很少,作者采用腹腔注射微囊藻毒素的方法,确定其在鱼体内作用的靶器官,观察超微结构的组织病理变化,并与对哺乳动物作用的结果相比较,进而探讨其对鱼类的致毒机理．回材料和方法微囊藻毒素LR由日本名城大学药学部提供。实验鱼为草鱼［Ctenopharyngodonidellus］,体重引一389,体长11—13cm,取自中国科学院水生生物研究所养殖场,在25℃下通以循环水驯化1周…     

TP53INP2/DOR的生物学功能

肿瘤蛋白p53诱导的核蛋白2(TP53INP2),也称糖尿病与肥胖调控蛋白(DOR),在骨骼肌、心肌和脑等代谢旺盛的组织中表达水平较高。TP53INP2在细胞核内主要发挥转录辅激活因子的作用,如作为甲状腺激素受体的辅激活因子调控甲状腺激素相关基因的表达。后续研究发现,TP53INP2为细胞内重要的分解代谢途径—细胞自噬所必需,饥饿时TP53INP2出核参与自噬的起始。在骨骼肌中,TP53INP2通过促进自噬导致肌肉流失,而在白色脂肪组织中,TP53INP2则通过促进自噬抑制脂肪前体细胞的分化。此外,在营养丰富的条件下,TP53INP2能够定位于核仁,协助rDNA转录起始前复合物的组装,促进rDNA的转录,参与细胞内重要的合成代谢—核糖体的生物发生。临床统计数据表明,TP53INP2的表达水平与糖尿病和某些类型的癌症早期的发生发展密切相关。本文对TP53INP2在转录调控、细胞自噬和相关疾病如癌症与糖尿病中的生物学功能进行综述。     

MC-LR对草鱼组织显微结构及HO-1、IL-10R1基因表达的影响

该项目主要研究微囊藻毒素-LR(microcystin-LR, MC-LR)对草鱼机体的毒害作用。草鱼经腹腔注射微囊藻毒素-LR的剂量为100μg/kg, 0.5 h、1 h、3 h、6 h、12 h和24 h后对草鱼组织和血液采样,然后进行组织显微结构和基因HO-1和IL-10R1的表达分析。(1)通过光学显微镜观察,肠道组织病理变化表现为肠绒毛上皮细胞脱落,杯状细胞增多,上皮细胞的细胞核变形; 6 h实验组出现肠道充血; 12 h实验组和24 h实验组肠绒毛黏膜固有层分离,且有时间效应。(2)采用荧光定量PCR技术对HO-1和IL-10R1基因进行检测,结果显示草鱼鳃、肝脏、肠道、脾脏和心脏组织各实验组较对照组的HO-1基因表达量显著降低(P<0.05),同时草鱼脑、肝脏、肠道、脾脏组织和血液各实验组较对照组的IL-10R1基因表达量显著降低(P<0.05)。微囊藻毒素-LR导致草鱼肠道、肝脏和鱼鳃等器官的病理损伤和HO-1和IL-10R1基因表达量显著降低,可为MC-LR刺激草鱼的炎症反应与免疫反应提供相关理论依据。     

微囊藻毒素-LR对小鼠原代肝细胞线粒体功能的影响

目的 蓝藻水华引起的微囊藻毒素污染是世界性关注话题之一,微囊藻毒素LR(MC-LR)具有强特异性肝毒性,但其引起肝损伤的确切机制尚未完全阐明.为解决这一问题,本研究从细胞分子层面探讨MC-LR造成肝细胞线粒体功能改变的分子机制.方法 提取小鼠原代肝细胞,加入梯度剂量的MC-LR(2.5～10 nmol/L)作用48 h...     

miR-155-TP53INP1调节轴在结直肠癌化疗药物敏感性中的作用机制

摘要 目的：初步揭示miR-155通过靶向调节TP53INP1表达水平影响结直肠癌细胞对5-FU化疗敏感性。方法：将人结肠直肠癌细胞系HCT116进行培养,提取细胞总RNA后,采用miR-155逆转录特异性引物构建反转录体系进行PCR扩增,通过qRT-PCR检测miR-155在5-FU耐药细胞HCT116/FU及敏感细胞株HCT116中的表达情况;取对数生长期细胞,分别转染miR-155mimics、miR-155抑制剂、miR-155阴性对照后,采用CCK-8法检测miR-155对细胞5-FU药物敏感性的影响,双荧光素酶报告基因系统验证miR-155与TP53INP1的靶基因关系,Western blot检测miR-155对 TP53INP1表达的影响。结果：miR-155在HCT116 /Fu细胞中的表达量是HCT116细胞的7.25倍;在相同5-FU浓度时,HCT116+阴性对照的细胞生长抑制率均高于HCT116+mimics、半数抑制浓度显著低于HCT116+mimics,差异均具有统计学意义(P＜0.05);TP53INP1是miR-155的靶基因,能显著降低野生型TP53INP1 3''-UTR的荧光素酶活性;转染miR-155 mimics后,TP53INP1的相对表达量显著下降,转染miR-155抑制剂后,TP53INP1的相对表达量显著升高,差异均具有统计学意义(P＜0.05)。结论：miR-155水平升高使HCT116细胞对5-FU的敏感性降低,miR-155可能通过靶向调节TP53INP1的表达水平,从而影响结直肠癌细胞对5-FU的敏感性。     

微囊藻毒素-LR对小鼠肝细胞线粒体功能的影响

目的：探究微囊藻毒素-LR对小鼠肝细胞线粒体功能的影响。方法：采用BALB／c小鼠作为模型动物,随机分为3组：A组,空白对照组,正常饮用水;B组,添加5g门L微囊藻毒素．LR的饮用水;C组,添加30gm微囊藻毒素-LR的饮用水。分组喂养3个月,分离小鼠肝脏、提取线粒体,采用线粒体荧光探针JC-1测定线粒体膜电位（MMP）,qRT-PCR检测自噬相关基因Beclinl和Lc3α的转录水平,WesternBlot检测细胞色素c的释放,电镜观察线粒体的形态和内部结构。结果：微囊藻毒素-LR处理组的小鼠肝细胞线粒体膜电位明显下降,自噬相关基因Lc3α的转录水平上升,细胞色素C由线粒体释放到胞浆,电镜观察线粒体形态异常、内部结构被破坏。结论：微囊藻毒素-LR对小鼠肝细胞线粒体有较强的毒性作用,并引发线粒体自噬。     

微囊藻毒素-LR 对小鼠肝细胞线粒体功能的影响*

摘要目的：探究微囊藻毒素-LR 对小鼠肝细胞线粒体功能的影响。方法：采用BALB/c 小鼠作为模型动物,随机分为3 组：A 组, 空白对照组,正常饮用水;B 组,添加5 g/L微囊藻毒素-LR 的饮用水;C 组,添加30 g/L 微囊藻毒素-LR 的饮用水。分组喂养3 个月,分离小鼠肝脏、提取线粒体,采用线粒体荧光探针JC-1 测定线粒体膜电位（MMP）,qRT-PCR检测自噬相关基因Beclin1 和 Lc3琢的转录水平,Western Blot检测细胞色素C的释放,电镜观察线粒体的形态和内部结构。结果：微囊藻毒素-LR 处理组的小 鼠肝细胞线粒体膜电位明显下降,自噬相关基因Lc3琢的转录水平上升,细胞色素C由线粒体释放到胞浆,电镜观察线粒体形态 异常、内部结构被破坏。结论：微囊藻毒素-LR 对小鼠肝细胞线粒体有较强的毒性作用,并引发线粒体自噬。     

草鱼自噬相关基因Beclin1的克隆及其在MC-LR胁迫下的表达特征

为评估微囊藻毒素-LR (MC-LR)对鱼类自噬的影响, 根据转录组测序结果得到的EST序列, 采用RACE技术获得了草鱼(Ctenopharygodon idella)自噬基因Beclin1 (CiBeclin1)的cDNA全长序列。该基因序列全长1590 bp, 包括1344 bp的开放阅读框, 编码447个氨基酸, 分子量为51.2 kD, 理论等电点为4.88。CiBeclin1包含1个BH3和1个ECD结构域。CiBeclin1氨基酸序列与其他物种的相似性为88%—98%, 构建的进化树显示CiBeclin1与稀有鲫(Gobiocypris rarus)的Beclin1亲缘关系最近。实时荧光定量PCR (qRT-PCR)检测结果表明, CiBeclin1在肝、肾、脾等10种不同组织中均广泛表达, 但在肝脏组织中的相对表达量最丰富, 显著高于相对表达量最低的头肾组织(P<0.05)。在不同剂量(25和100 μg MC-LR/kg BW) MC-LR胁迫24h、48h、72h和96h后, 草鱼肝脏中CiBeclin1表达量均显著低于对照组的表达水平, 研究结果表明, MC-LR能抑制草鱼CiBeclin1的表达, 但MC-LR是否在该剂量下诱导了草鱼的自噬还有待于进一步研究。     

淡水鱼类微囊藻毒素去毒酶基因的克隆

微囊藻毒素去毒酶在鱼类微囊藻毒素去毒过程中起着关键作用,研究成功克隆鲢鱼、鳙鱼、草鱼、鲫鱼、鳜鱼、罗非鱼等淡水鱼类微囊藻毒素去毒酶基因cDNA核心片段而首次获得这些淡水鱼类微囊藻毒素去毒酶氨基酸序列。鲢鱼、鳙鱼、草鱼、鲫鱼、鳜鱼、罗非鱼微囊藻毒素去毒酶基因与人、小鼠、大鼠、牛、猪、羊的谷胱甘肽S-转移酶基因氨基酸同源性为60%左右,表明淡水鱼类微囊藻毒素去毒酶基因在进化上变异性较大,与其承担微囊藻毒素去毒代谢之特殊功能相适应。     

草鱼Noxa基因克隆及其应答GCRV入侵的表达响应

研究通过获得草鱼Noxa基因(Cinoxa)全长cDNA, 进行序列分析和进化树构建, 使用定量PCR (qPCR)的方法研究其在GCRV刺激下的表达模式。研究发现, 草鱼Noxa基因的蛋白序列与斑马鱼Noxa基因具有高度相似性。通过分析草鱼和斑马鱼的Noxa基因的蛋白三维结构(3D)模型, 研究发现两者具有高度一致的蛋白三维结构模式, 该模型与高等哺乳类中的Bcl-2家族蛋白中C端结构域同源。对Cinoxa在GCRV刺激下的表达模式的研究表明, Cinoxa在GCRV感染后中肾、脾脏和头肾中表达发生显著性变化, 攻毒后24h和120h出现显著上调表达。研究表明草鱼Noxa为斑马鱼Noxa的同源基因, 并且参与了草鱼对GCRV入侵的应答反应, 为深入研究鱼类Noxa应答病毒入侵的功能和转录调控机制奠定了基础。     

草鱼转铁蛋白基因的克隆及其组织表达

转铁蛋白(Transferrin,Tf)功能广泛,不仅参与机体内铁离子的运输和代谢,还在细胞呼吸、细胞生长和增殖中起重要作用,而且它具有抗菌杀菌的功能。研究从草鱼肝肾全长cDNA文库中克隆得到草鱼转铁蛋白基因(CtTf),该基因全长cDNA5′非编码区包含31bp,最大开放阅读框为2025bp,编码674个氨基酸,3′非编码区为266bp。研究使用了Signal P、SMART等在线软件对草鱼转铁蛋白全长cDNA的分子特征进行预测,结果显示CtTf编码的蛋白质N-端有1个由15个氨基酸残基组成的信号肽,第24-334个和第338-665个氨基酸为2个保守的结构域,二者同源率为31%。与其他物种的转铁蛋白类似,草鱼转铁蛋白每个结构域包含4个铁离子结合位点,它们在两个结构域中的位置相对保守,除了这8个铁离子结合位点外,还存在多个完全保守的氨基酸位点。草鱼转铁蛋白与人及其他物种有很高的同源性,与其他鲤科鱼类的同源性为65%-73%;与海洋鱼类同源性为43%-50%;与两栖、爬行、鸟类、哺乳类的同源性为40%-42%。系统进化树也显示草鱼转铁蛋白基因与斑马鱼和鲤鱼的亲缘关系最近。RT-PCR的实验结果表明,在草鱼肝、肠、肾、脾、心、肌肉、鳃和脑8种组织中,草鱼转铁蛋白基因在肝中的表达量最高,其次为脾和肠,在鳃和脑中有痕量表达。       

草鱼IGF-I cDNA的克隆和在原核生物中的表达

根据亲缘关系较近的鲤鱼胰岛素样生长因子-I(IGF-I)cDNA设计一对引物,通过RT-PCR从草鱼(Ctenopharyngodon idellus)肝组织首次克隆了草鱼IGF-I cDNA开放阅读框(ORF)片段.经序列分析表明克隆的草鱼IGF-I cDNA为Ea-2亚型,ORF与鲤鱼有95%的同源性,与人有63%的同源性;草鱼IGF-I蛋白与鲤鱼IGF-I仅2个氨基酸残基不同,与人IGF-I也仅有13个残基不同.将表达成熟草鱼IGF-I(gcIGF-I)蛋白的cDNA片段亚克隆至谷胱甘肽S-转移酶(GST)融合表达载体pGEX-4T-3,再将构建的重组表达载体pGEX-T-gcIGF-I转入大肠杆菌BL21.在IPTG的诱导下,GST-gcIGF-I融合蛋白高效表达.兔抗鲑鱼IGF-I抗血清进行的Western B1ot检测显示重组草鱼IGF-I蛋白具有免疫活性.     

银鲫Greb1的克隆、表达及功能研究

为研究银鲫(Carassius gibelio)雌激素应答基因(Growth regulation by estrogen in breast cancer cell 1, Greb1)的表达特征和功能, 采用RACE方法克隆了银鲫Greb1的全长cDNA (CgGreb1)。CgGreb1的cDNA全长为954 bp, 其中包含一个765 bp的开放阅读框, 编码255个氨基酸。大多数脊椎动物有多个Greb1的变体, 长度为386—1988个氨基酸, 其中CgGreb1是最短的一个。序列比对结果表明脊椎动物Greb1蛋白的N端区域极为保守, 且CgGreb1位于Greb1蛋白的N端区域, 该区域与其他脊椎动物Greb1的同源性超过60%。qRT-PCR结果显示, 在成体组织中, CgGreb1主要在垂体、脑、性腺和肝脏中表达, 其中在垂体中CgGreb1的表达最高; 在注射促黄体生成素释放激素类似物和人绒毛膜促性腺激素后的雌鱼垂体中, CgGreb1的表达逐渐上升随后降低, 并在产卵时维持较高的表达; 在胚胎发育过程中, CgGreb1从50%外包开始表达, 其表达量随胚胎发育而升高, 在受精后24h达到峰值, 随后表达量下降, 在受精后48h不表达。原位杂交结果表明, 在原肠期, CgGreb1信号位于胚层的边缘; 在体节期, CgGreb1信号逐渐增强并出现在神经系统; 在受精后24h, CgGreb1信号在脑和脊髓等中枢神经系统增强; 从受精后30h开始, CgGreb1信号减弱; 在受精后48h, 检测不到CgGreb1信号。在注射CgGreb1 MO的银鲫胚胎中, tshβ、prl和gthα分别标记的3种垂体细胞减少, 证明CgGreb1参与早期银鲫垂体细胞的发育。研究结果为进一步揭示银鲫垂体发育和生长调控机制奠定了基础。     

金鱼胰蛋白酶原基因的克隆及镉和过氧化氢暴露对其基因表达的影响

为深入研究胰蛋白酶在鱼类中的蛋白结构和生理功能, 利用RT-PCR和RACE方法, 从金鱼肝胰脏中成功克隆获得了一种全长864 bp的胰蛋白酶原cDNA序列(gfTryp)。gfTrypc DNA包含21 bp的5′-非翻译区、114 bp的3′-非翻译区和729 bp的开放读码框, 编码242个氨基酸组成的胰蛋白酶原(gfTryp)。gfTryp含有15个氨基酸的信号肽和5个氨基酸(LDDDK)的激活肽。氨基酸序列分析表明, gfTryp具备胰蛋白酶原的保守结构特征, 如含有催化三联体氨基酸(His-57、Asp-102和Ser-195), 12个半胱氨酸, 位于底物结合口袋底部Asp-189和口袋开口处的Gly-216、Gly-226等, 提示其可能具有保守的蛋白消化功能。RT-PCR结果显示, gfTryp mRNA在所检测的各个组织中均有表达, 其中在肝胰脏、肠和脂肪中表达量为最高。进一步研究发现, 相较于摄食前, 肝胰脏gfTryp mRNA在金鱼摄食后显著升高。在0.5和5 μg/mL镉暴露处理后, 肝胰脏gfTryp mRNA显著升高(与未处理组相比, 分别约为3.2 和 4.7倍)。随着镉浓度增加到10 μg/mL后, gfTryp mRNA表达量下降。经100 μmol/L过氧化氢处理3h、6h、12h和24h后, 金鱼肝胰脏gfTryp mRNA的表达水平均显著下降, 在6h达到最大效应(约为对照组的0.21倍)。研究结果证实了重金属镉和过氧化氢处理能调控胰蛋白酶原基因表达, 为进一步探讨鱼类消化生理提供了新的视角。     

大菱鲆脂联素受体基因的克隆及饲料糖脂比对其表达的影响

脂联素作为一种重要的细胞因子在哺乳动物中起到调节糖脂代谢的重要作用, 为探究脂联素在大菱鲆糖脂代谢中是否具有同样的调节作用, 研究利用分子克隆和RACE技术克隆到了大菱鲆脂联素AdipoR1受体和AdipoR2受体的基因全长序列。其中AdipoR1受体的核苷酸序列全长为1125 bp, 共编码375个氨基酸, 氨基酸序列与其他脊椎的同源性都很高。AdipoR2受体的核苷酸序列全长为1940 bp, 共编码380个氨基酸, 氨基酸序列与其他脊椎动物同源性也都很高。蛋白跨膜结构域预测得出大菱鲆AdipoR1和AdipoR2都具有7个明显的跨膜区, 最优拓扑模型为N端在细胞内侧模型, 与其他脊椎动物相同。配制不同糖脂比(1鲶6, 1鲶2, 2鲶1和14鲶1)的饲料养殖大菱鲆9周, 利用实时荧光定量PCR技术检测大菱鲆肌肉和肝脏中脂联素受体基因的表达量。结果显示, 在饲料糖脂比为1鲶2的处理组中, 大菱鲆肌肉中AdipoR1的表达量显著低于糖脂比为1鲶6的处理组(P<0.05), 但与其他2组无显著差异。饲料糖脂比的变化对肌肉中AdipoR2和肝脏中这2种受体的表达量均没有产生显著影响(P>0.05)。由此可见, 饲料糖脂比的变化可能通过改变脂联素受体的表达量, 从而间接影响大菱鲆体内脂联素的作用。AdipoR1和AdipoR2对饲料糖脂比变化的反应不同步, 而且肌肉和肝脏中脂联素受体对饲料糖脂比变化的反应也存在不同。适量提高饲料糖脂比可以显著下调肌肉中AdipoR1的表达。     

银鲫果糖-1,6-二磷酸酶的分子克隆与表达分析

果糖-1,6-二磷酸酶(EC 3.1.3.11)是糖异生中的关键限速酶之一, 在糖代谢中起重要作用。哺乳动物存在肝脏型和肌肉型两种果糖-1,6-二磷酸酶同工酶,分别由Fbp1和Fbp2编码。银鲫作为我国重要的经济养殖鱼类, 尚无果糖-1,6-二磷酸酶基因的有关资料, 其组织分布特征和胚胎发育模式亦不清楚。本研究采用RACE方法从银鲫原肠胚SMART cDNA文库中扩增了果糖-1,6-二磷酸酶基因的全长cDNA, 其长度为1170 bp,编码337个氨基酸残基,多重序列比对和系统发育分析表明该基因为肝脏型果糖-1,6-二磷酶。RT-PCR分析虽在银鲫的肝、脑、心、脾、肾、肠、肌肉和卵巢组织中皆能检测到该基因的表达, 但以肝组织的表达量最高。Western Blot检测表明, 肝脏组织除有一条与其他组织(肌肉除外)共有的蛋白带之外,还有一条特异带;肌肉中有不同于其他组织的特异带。成熟卵子和不同发育阶段胚胎的RT-PCR和Western Blot分析都可检测到母源的CagFbp转录本和蛋白,且其转录本从原肠期开始上升, 到神经胚时迅速上升到较高水平, 其蛋白从尾芽期以后出现一条比母源蛋白分子量小、与肝脏的特异带大小基本相同的蛋白带。这些结果证实本研究克隆的CagFbp为肝脏型,且鱼类至少存在肝脏型和肌肉型两种果糖-1,6-二磷酸酶同工酶。       

草鱼CD81基因的克隆及功能分析

为研究白细胞表面分化抗原81(CD81)的功能, 对草鱼CD81进行了克隆, CD81全长共1376 bp, 其中5'非翻译区87 bp, 3'非翻译区581 bp, 开放阅读框为708 bp, 包括8个外显子, 7个内含子, 编码235个氨基酸。实验采用实时荧光定量PCR的方法检测了CD81在健康草鱼不同组织中的表达情况及草鱼出血病病毒(GCRV)攻毒前后的表达变化情况。结果显示草鱼CD81在所有被检测组织中均有表达, 在头肾中表达量最高。在GCRV攻毒前后草鱼鳃、脾、肝、肠及头肾5个组织中的CD81表达量均有明显变化。同时, 采用绿色荧光蛋白(GFP)来示踪CD81的亚细胞表达部位, 激光共聚焦显微镜显示, 同人类一样, 草鱼CD81定位于细胞膜上。       

赤眼鳟Mx1基因的cDNA克隆及表达特性

为探究赤眼鳟(Squaliobarbus curriculus)是否存在Mx1 (Myxovirus resistance)基因及参与抗病毒免疫反应, 研究利用RACE技术获得了赤眼鳟Mx1基因(ScMx1)的cDNA全长序列, 并对其进行了生物信息学分析; 采用荧光定量PCR技术, 检测了ScMx1在赤眼鳟健康组织中的表达情况以及感染GCRV后ScMx1和ScIFN-Ⅰ的表达特征。结果表明, ScMx1的cDNA全长为3000 bp, 包含5′非编码区124 bp, 开放阅读框1893 bp, 3′非编码区983 bp, 共编码630个氨基酸。预测的ScMx1蛋白包含GTP酶结合区域、中央核心结构域和GTP酶效应结构域。ScMx1与青鱼Mx1的相似性最高(97%), 与ScMx的相似性仅为50%。ScMx1在所检测的10种组织中均有表达, 其中在脾脏中表达量最高。经GCRV感染开始至168h, ScMx1和ScIFN-Ⅰ在肝脏和体肾中的表达量持续上调; 在脾脏和头肾中于感染后72h达到峰值。相关性分析显示脾脏中ScMx1和ScIFN-Ⅰ的表达水平呈显著相关(r=0.94, P=0.018)。研究发现赤眼鳟存在Mx1基因, 且可能参与了抗GCRV免疫应答反应。