建立同时分离培养小鼠肝细胞及肝星状细胞的技术

目的:建立一种简便、经济、高产的同步分离培养肝细胞以及肝星状细胞的方法。方法:在参照国内外方法的基础上加以改良,首先采用肝脏原位胶原酶灌注消化的方法,获得总细胞悬液,经多次低速离心分离肝细胞;再用Nycodenz作为分离介质,通过密度梯度离心法从非实质细胞中得到肝星状细胞。通过台盼蓝染色方法鉴定细胞的活力,用倒置相差显微镜、立体显微镜、CK-18、白蛋白免疫荧光细胞化学染色对培养的肝细胞形态以及功能进行检测。使用Desmin、α-SMA免疫荧光细胞化学对肝星状细胞进行鉴定。结果:成功的在体外同步分离、培养肝细胞及肝星状细胞,肝细胞产率为5-6×107/只小鼠,两只小鼠肝星状细胞产率达1×106个。细胞存活率及纯度均可达90%。肝细胞在培养24h后呈不规则铺路石样形态,此为典型的肝细胞形态,其标志分子CK-18以及白蛋白免疫荧光染色阳性。倒置相差显微镜下可见贴壁后的肝星状细胞呈典型的星形细胞形态,且其标志分子Desmin、α-SMA免疫荧光染色阳性。结论:改良的原位灌注以及分离方法可以同时分离并且培养具有高活性和功能的肝细胞和肝星状细胞。     

注射紫杉醇的小鼠骨髓细胞体外分化巨噬细胞增强

目的研究小鼠腹腔注射紫杉醇对体外骨髓细胞诱导分化巨噬细胞的影响。方法小鼠连续5d腹腔注射紫杉醇,无菌制备骨髓细胞,用含巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）的RPMI1640培养液培养骨髓细胞,通过流式细胞仪对其诱导分化的巨噬细胞表面分子、吞噬功能进行分析。结果紫杉醇明显降低小鼠骨髓细胞数量,但骨髓细胞体外诱导分化成巨噬细胞的数量明显增加;F4/80^＋巨噬细胞中CD80、CD14表面分子表达升高,而I-A^d表达降低;紫杉醇处理组诱导分化的巨噬细胞吞噬鸡红细胞的能力提高。结论结果提示紫杉醇可能具有调节巨噬细胞表面分子的表达和吞噬功能。     

小鼠巨噬细胞吞噬功能测定方法的改进及应用(英文)

对巨噬细胞吞噬鸡红细胞活性的体内检测方法进行改进.收集小鼠腹腔巨噬细胞,加入不同浓度甘草多糖、鸡红细胞于37℃共同孵育1 h,在倒置显微镜下观察吞噬状态,统计吞噬百分率和吞噬指数.并将改进后的体外吞噬方法用于检测酵母多糖对小鼠腹腔巨噬细胞形态和吞噬功能的影响.结果表明:改进后的体外吞噬法测定的结果与传统的体内吞噬法比较,两者具有显著的相关性(n=6,P<0.01).酵母多糖对巨噬细胞刺激1 h后,与对照组相比,其吞噬功能显著性增强;巨噬细胞形态上出现被活化的特征.应用改进后的方法研究巨噬细胞吞噬鸡红细胞,不需染色,在模拟生理条件下进行,保持了细胞活性,有简便、成本低以及准确率高的特点,适用于普通实验室的科研和教学.     

改良组织块法培养小鼠成骨细胞的研究

目的 探讨简便、经济、高效的成骨细胞培养方法.方法 取新生乳小鼠的颅骨,用改良的组织块法分离培养成骨细胞;从细胞的形态学、增殖、碱性磷酸酶染色、矿化结节茜素红染色及骨钙素基因表达水平等方法鉴定、比较培养的成骨细胞.结果 分离培养的成骨细胞生长状态良好,纯度较高,具有典型的成骨细胞形态特征,碱性磷酸酶染色及矿化结节茜素红染色阳性,骨钙素基因表达水平明显高于阴性对照,差异有统计学意义(P＜0.05).比较1～4次分离培养的成骨细胞在形态、增殖及分化功能上差异均无统计学意义(P＞0.05).结论 改良的组织块法分离培养乳小鼠的颅骨可获得大量纯度较高的成骨细胞,节约经费、时间,操作简便.     

红景天苷干预小鼠肝纤维化的研究

目的:以药物诱导的小鼠肝纤维化为实验模型,研究中药红景天苷对该模型是否有治疗作用,及可能的作用方式,结合该药对大鼠肝纤维化的治疗作用,为临床应用该药提供指导.方法:选取10对同窝同性别8周龄小鼠,每对内两只小鼠随机分进实验组(experimental group,EG)与对照组(control group,CG).进行CCl4腹腔注射诱导小鼠肝纤维化,并在诱导中期实验组加入红景天苷,对照组继续原诱导方案.诱导12周结束后取小鼠肝组织进行H&E染色、MASSON染色、巨噬细胞的免疫荧光染色及血清Hyp含量表达测定.结果:实验组小鼠肝组织形态较好,假小叶形成较少,胶原沉积也相对较少(P＜0.001),其血清中的Hyp含量低于对照组(P＜0.01),以上差异有统计学意义.在实验组小鼠肝脏中,F4-80标记的巨噬细胞百分比明显低于对照组(P＜0.001),该差异有统计学意义.结论:红景天苷能够影响小鼠的正常肝纤维化进程,该药减轻了小鼠的肝纤维化程度,对小鼠肝纤维化进程有一定的保护作用.此作用的发挥可能是该药物影响了肝脏中的Kupffer细胞的增殖或者凋亡,从而使得该细胞对炎性信号调控发生变化,使得肝星形细胞分泌胶原减少得以实现.该药在大鼠及小鼠肝纤维化模型上的治疗作用提示其临床应用前景较好.     

一种高效、快捷、经济的小鼠胰岛细胞分离纯化方法

采用改良的胶原酶P胆总管内逆行灌注膨胀胰腺的分离方法,比较Ficoll-400不连续密度梯度离心法和人工挑取法两种纯化胰岛的方法,用双硫腙(DTZ)对胰岛细胞团进行特异性染色计算胰岛产量及纯度,用台盼蓝染色判定胰岛细胞活性,使用间接免疫荧光法检测体外培养7 d后胰岛的功能.采用人工挑取法平均每只小鼠可获取的胰岛细胞团(245±35.6个)明显高于密度梯度离心法(120±26.3个)(n=5,P<0.05),两种方法分离纯化的胰岛活力均大于98%;但人工挑取法获得胰岛细胞团的纯度(100%)要高于密度梯度离心法(90%);纯化胰岛所用时间,采用人工挑取法(22±4 min)也少于密度梯度离心法(31±3 min).间接免疫荧光染色检测体外培养7 d后的胰岛细胞团,两种方法分离纯化的胰岛细胞团均具有良好的功能.胶原酶P胆总管内灌注消化分离法联合人工挑取纯化胰岛细胞团的方法,是一种高效、快捷、经济的小鼠胰岛细胞团分离纯化方法.     

CREG促进小鼠腹腔巨噬细胞溶酶体发生及溶酶体组织蛋白酶表达*

目的:研究E1A激活基因阻遏子(Cellular repressor of E1A-stimulated genes,CREG)对小鼠腹腔巨噬细胞溶酶体发生及溶酶体组织蛋白酶表达的影响。方法:应用loss-of-function和gain-of-function模型,Lysotracker Red染色和透射电镜观察CREG对小鼠腹腔巨噬细胞溶酶体发生的影响,并通过细胞免疫荧光染色和Western blot方法,观察CREG对小鼠腹腔巨噬细胞溶酶体组织蛋白酶表达的影响。结果:Lysotracker Red染色和透射电镜证实CREG可促进小鼠腹腔巨噬细胞溶酶体发生;细胞免疫荧光染色和Western blot方法证实CREG可促进小鼠腹腔巨噬细胞溶酶体组织蛋白酶cathepsin B及cathepsin S表达。结论:CREG可促进小鼠腹腔巨噬细胞溶酶体发生及组织蛋白酶cathepsin B及cathepsin S表达。     

小鼠巨噬细胞吞噬马尔尼菲青霉酵母相细胞的实验观察

目的探讨小鼠腹腔巨噬细胞对马尔尼菲青霉酵母相细胞的影响,为研究抗马尔尼菲青霉的免疫机制提供一定的实验依据。方法将马尔尼菲青霉酵母相细胞与小鼠腹腔巨噬细胞在体内和体外两种方式下进行共培养,分别于60min、120min、240min和360min后进行菌落形成单位(CFU)计数,统计分析体内组与体外组CFU数结果的差异性。利用钙荧光白染色巨噬细胞胞内的马尔尼菲青霉酵母相细胞,荧光显微镜下观察细胞形态特征的变化。结果经体内和体外两种方式共培养,两组之间的CFU计数差异无统计学意义,但两组内不同时间点的CFU计数差异存在统计学意义。荧光显微镜下可见巨噬细胞内的酵母细胞被钙荧光白染上淡蓝色荧光。结论小鼠腹腔巨噬细胞在体内、外对马尔尼菲青霉酵母相细胞不起明显的杀灭或溶解作用,其最大的吞噬时间为共培养240min。钙荧光白染色可快速有效的区分巨噬细胞与真菌,是一种良好的检测真菌方法。     

大剂量地塞米松快速高效诱导巨噬细胞凋亡

运用透射电镜、DNA琼脂糖凝胶电泳、流式细胞术、原位末端标记法(TUNEL)染色等技术,检测了大剂量地塞米松处理小鼠腹腔巨噬细胞的各种变化.结果显示,大剂量地塞米松处理的巨噬细胞发生胞体皱缩、染色质凝聚、胞质浓缩;TUNEL染色呈阳性;0.5 h后DNA凝胶电泳即呈梯状条带;流式细胞术作周期分析出现凋亡峰等明显的凋亡特征.并且随处理时间延长凋亡率升高.结果表明,大剂量地塞米松快速、高效诱导小鼠腹腔巨噬细胞凋亡.     

小鼠主动脉血管平滑肌原代细胞的分离培养及鉴定

目的:血管平滑肌细胞在人类心血管疾病中具有重要的作用,而作为重要的遗传学研究模式生物的小鼠血管平滑肌材料有限,因此建立一种简单高效的小鼠血管平滑肌原代细胞分离培养方法很重要。方法:分离小鼠主动脉中膜层,胶原酶消化法获得原代平滑肌细胞,免疫荧光方法检测细胞的纯度和分化状态;分离平滑肌细胞特异的报告小鼠的平滑肌细胞,LacZ染色鉴定。结果:用该方法分离的原代平滑肌细胞生长迅速,3d后即可达5×106个。免疫荧光显示,细胞传至第3代后纯度在98%以上,细胞传至8代分化状态没有改变。LacZ染色鉴定报告小鼠分离的3代平滑肌细胞98%以上显示特异的蓝染。两种实验证明,应用此方法分离原代平滑肌细胞可以满足平滑肌体外功能实验的需求。结论:与传统的组织块培养法相比,该方法操作简便、经济,可以获得更多高纯度的血管平滑肌细胞。