STAT3 入核分子机制的初步研究

为了研究Stat3入核的分子机制,将SV40大T 抗原的经典核定位序列NLS(nuclear localization sequence)分别融合在Stat3-GFP分子和缺失突变体Dstat3-GFP的分子之间,构建Stat3-NLS-GFP和Dstat3-NLS-GFP融合分子。转染293T细胞,以NLS-GFP为阳性对照,通过激光共聚焦显微镜的观察融合分子的亚细胞位置,未经白介素-6刺激的Stat3-NLS-GFP和经白介素-6刺激的Stat3-GFP呈胞核分布,未经白介素-6刺激的Stat3-GFP和Dstat3-NLS-GFP呈胞浆分布. 初步证明Stat3入核是由于获得了核定位序列。     

STAT3 入核分子机制的初步研究

为了研究Stat3入核的分子机制,将SV40大T抗原的经典核定位序列NLS(nuclear localization sequence)分别融合在Stat3-GFP分子和缺失突变体Dstat3-GFP的分子之间,构建Stat3-NLS-GFP和Dstat3-NLS-GFP融合分子。转染293T细胞,以NLS-GFP为阳性对照,通过激光共聚焦显微镜的观察融合分子的亚细胞位置,未经白介素-6刺激的Stat3-NLS-GFP和经白介素-6刺激的Stat3-GFP呈胞核分布,未经白介素-6刺激的Stat3-GFP和Dstat3-NLS-GFP呈胞浆分布,初步证明Stat3入核是由于获得了核定位序列。     

细胞因子和生长因子信号转导途径中信号蛋白分子的核转运机制

信号蛋白分子的入核及出核转运是细胞因子和生长因子信号转导途径中的重要环节.核定位序列（NLS）是信号蛋白分子上与入核转运相关的氨基酸序列.核孔复合物（NPC）、核转运蛋白importin和能量供应体Ran/TC4在入核转运过程中也发挥了重要作用.另外,很多细胞因子和生长因子或其受体上所含有的NLS序列也具有核定位功能,并可能通过“伴侣机制”参与其他信号蛋白分子的入核转运.     

AcMNPV肌动蛋白核定位基因的亚细胞定位

当前细胞核内肌动蛋白的功能是一个研究热点,核内存在肌动蛋白并参与细胞核内发生的许多生命活动。杆状病毒是迄今唯一报道的利用核内肌动蛋白进行复制增殖的病原微生物,为核内肌动蛋白的结构与功能的研究提供了独特的系统。有报道显示AcMNPV的ie-1,pe38,ac4,he65,ac102和ac152基因与肌动蛋白单体的核转运有关,然而关于这六个基因的亚细胞定位及其在肌动蛋白入核过程中的功能并没有深入的研究。本文首次揭示了这六个基因的亚细胞定位,IE1和AC152是全细胞分布,PE38和AC102也为核质分布,但主要分布在细胞核中,而AC4和HE65定位于细胞质。但AC102和IE1可以分别介导AC4和HE65入核。同时我们发现当使用外源强启动子OpIE2,在转染ie-1或pe38之后表达ac4和he65可以部分招募肌动蛋白单体入核,而时序性共转染这四个基因则可招募最多肌动蛋白单体入核。对肌动蛋白核定位基因在细胞中的定位分析为进一步了解杆状病毒介导肌动蛋白入核的分子机理提供支持。     

苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒E25序列突变对其入核定位和芽殖型病毒体增殖的影响

为了认识杆状病毒E25不同区段序列对其入核运输和定位及对病毒复制的作用,用egfp依次替代苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒e25不同区段序列或插入其不同位点构建7个e25突变体,分别插入e25缺失型或野生型bacmid构建了14个e25突变型bacmids,用于对Sf9细胞的转染-感染实验。免疫荧光和共聚焦显微镜分析显示,由EGFP替代E25 2～45aa构成的融合蛋白在被转染细胞质中弥散分布;EGFP插入1aa/2aa处构成的融合蛋白沿核膜外侧分布,未入核;EGFP替代46～118aa或插入118aa/119aa处形成的E25-EGFP在细胞核膜内、外侧和核质中呈稀疏点块状分布。EGFP替代119～228aa或插入45/46aa或C-末端的融合蛋白的定位与野生型bacmid转染细胞中的E25相似,呈环状或弥散分布。这些结果显示虽然E25N-端序列对其定向入核运输和膜定位是必需的;但其中间段序列对其入核运输和定位也有一定影响。在正常E25和E25-EGFP突变子同时存在的情况下,不同的E25-EGFP突变子与正常E25呈现共定位特征,显示E25可能以二聚体或多聚体形式存在。在转染-感染实验中,只有兼含正常e25和2～45aa编码序列被替代的e25突变体的bacmid能够产生高感染性芽殖型病毒体(Budded virus,BV);其它e25突变型bacmids只能产生少量或完全不能产生感染性BV,显示E25结构严谨,所有替代和插入突变都导致其功能丧失或异常。     

灰盖拟鬼伞核定位蛋白重组表达系统的构建

为构建灰盖拟鬼伞Coprinopsis cinerea的核定位蛋白重组表达系统,本研究通过蛋白序列比对和信息学分析,预测了灰盖拟鬼伞组蛋白H2B的核定位序列,构建了融合组蛋白H2B核定位序列的绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)重组表达载体,将该载体转入灰盖拟鬼伞AmutBmut菌...     

鸡贫血病毒VP3蛋白序列与其核定位功能的相关性

鸡贫血病毒（chicken anemia virus, CAV）编码一种小蛋白VP3.通过构建vp3基因与绿色荧光蛋白基因的真核融合表达载体,转染5种肿瘤/转化细胞株, 观察绿色荧光在亚细胞区域的定位,证实VP3具有核定位的功能;分析VP3的氨基酸序列,将其具核定位序列（nuclear localization sequence, NLS）特征的区域删除,再构建此缺失的VP3的基因与绿色荧光蛋白基因的真核融合表达载体、转染实验显示核定位现象消失;进一步将具核定位序列特征的区域亚克隆到绿色荧光蛋白真核表达载体上,核定位功能再现.从而推断这一区域是VP3蛋白核定位的功能区.此区域位于VP3的C端,且富含碱性氨基酸,二级结构预测发现这一区域形成特定的β折叠结构.用碘丙锭(propidium iodide, PI)染色的方法还得到了VP3促进肿瘤细胞凋亡的初步证据.     

核基质结合序列（MAR）与基因表达调控

核基质结合序列（MAR）是能在体外与核基质特异结合的DNA序列,广泛存在于染色质Loop结构的边界序列中。随着研究的深入,发现MAR序列不仅在染色质折叠中起到重要作用,影响邻近内源基因表达,而且将MAR序列构建到外源基因表达盒两侧转化动植物时,也影响外源基因的表达。因此,MAR序列是基因组中一种重要的基因间边界序列,为阐明非编码序列在基因表达中的作用和构建真核生物高效表达载体提供了新途径。     

EB病毒潜伏膜蛋白1在鼻咽癌细胞中通过STAT3促进VEGF表达

探讨了EB病毒编码的潜伏膜蛋白1(LMP1)是否通过STAT3调控诱导血管内皮细胞生长因子(VEGF)的表达.利用蛋白质印迹的方法对HNE2、HNE2-LMP1以及瞬时转染STAT3显性负性突变体STAT3β的HNE2-LMP1细胞中VEGF含量进行检测,发现LMP1可以上调VEGF的表达,而STAT3β可以抑制VEGF的上调;利用LMP1可控表达细胞系tet-on-LMP1-HNE2进行LMP1时间和剂量诱导表达研究,发现VEGF可以随LMP1的动态表达而表达;将VEGF野生型报告基因和VEGF潜在的STAT3转录因子突变体报告基因与LMP1表达载体分别共转染研究发现,LMP1可以激活VEGF的转录,这种转录通过VEGF启动子区STAT3转录因子的结合位点发挥作用;电泳迁移率变动分析(EMSA)确证了STAT3的这种DNA位点的特异性活性.结果表明：EB病毒编码的LMP1 在鼻咽癌细胞中可以增加VEGF的转录和表达,并能通过VEGF启动子区STAT3转录因子结合位点发挥作用.     

STAT3信号转导系统介导了CNTF对大鼠尾壳核出血后的神经保护作用

目的研究睫状神经生长因子(CNTF)在中枢神经元抗损伤中的作用及机制。方法对尾壳核出血大鼠进行CNTF治疗,观察海马信号转导和转录激活蛋白-3(STAT3)含量及阳性神经元分布的变化。结果CNTF能显增加尾壳核出血大鼠海马STAT3阳性神经元数量、海马STAT3含量。结论CNTF能通过促进STAT3的表达增强中枢神经元的抗损伤能力。     

蛋白质的入核运送和它在基因表达中的调节作用

蛋白质进入细胞核是由蛋白质分子内部的核定位信号（nuclear localization signal, NLS）引导的.NLS蛋白首先与NLS受体结合,然后在多种胞浆因子及核孔复合物蛋白的作用下穿过核孔、转位入核.蛋白质上存在NLS并不一定总能够引导蛋白质入核.当NLS被修饰或遮掩时,它们便不能被核转运装置所识别.因而,NLS的遮掩被解除之前,蛋白质一直被扣留在胞浆中.以调节转录因子的入核运送来控制转录因子的活性是基因表达调节的一个新概念,也是细胞生长和分化的另一水平的调节.     

Nuclear Effectors in Plant Pathogenic Fungi

The nuclear import of proteins is a fundamental process in the eukaryotes including plant. It has become evident that such basic process is exploited by nuclear effectors that contain nuclear localization signal (NLS) and are secreted into host cells by fungal pathogens of plants. However, only a handful of nuclear effectors have been known and characterized to date. Here, we first summarize the types of NLSs and prediction tools available, and then delineate examples of fungal nuclear effectors and their roles in pathogenesis. Based on the knowledge on NLSs and what has been gleaned from the known nuclear effectors, we point out the gaps in our understanding of fungal nuclear effectors that need to be filled in the future researches.     

Nuclear localization of Chfr is crucial for its checkpoint function

Chfr, a checkpoint with FHA and RING finger domains, plays an important role in cell cycle progression and tumor suppression. Chfr possesses the E3 ubiquitin ligase activity and stimulates the formation of polyubiquitin chains by Ub-conjugating enzymes, and induces the proteasome-dependent degradation of a number of cellular proteins, including Plk1 and Aurora A. While Chfr is a nuclear protein that functions within the cell nucleus, how Chfr is localized in the nucleus has not been clearly demonstrated. Here, we show that nuclear localization of Chfr is mediated by nuclear localization signal (NLS) sequences. To reveal the signal sequences responsible for nuclear localization, a short lysine-rich stretch (KKK) at amino acid residues 257–259 was replaced with alanine, which completely abolished nuclear localization. Moreover, we show that nuclear localization of Chfr is essential for its checkpoint function but not for its stability. Thus, our results suggest that NLS-mediated nuclear localization of Chfr leads to its accumulation within the nucleus, which may be important in the regulation of Chfr activation and Chfr-mediated cellular processes, including cell cycle progression and tumor suppression.     

Caspase-3细胞定位信号的检测与分析

Caspase-3是凋亡过程中的重要作用蛋白。凋亡过程中,胞质定位的Caspase3被激活并进入细胞核中执行功能,但该定位变化的分子机制至今仍不清楚。分析caspase3中的细胞定位信号可以为深入了解该过程提供重要的线索。我们通过构建一系列含Caspase-3不同区段的截短突变体,与GFP融合表达,观察这些突变体在细胞中的定位,以鉴定Caspase-3中的核外运信号NES（Nuclear Export Signal）和核定位信号NLS（Nuclear Localization Signal）。Caspase-3中不存在明显的核定位信号NLS,但存在一个明显的核外运信号NES,该NES信号定位在caspase-3小亚基的C端（氨基酸220-245）。     

进入细胞核之门：核移位机制研究进展

细胞中DNA复制和RNA生物形成发生在细胞核,而蛋白质的合成场所位于细胞质,这些生命活动的整合依赖于功能蛋白等在两个亚空间尺度的选择性穿梭.这是一个信号介导的过程,需要能量和可溶性因子如穿梭载体的参与.通过介绍功能蛋白受控核移位机制研究进展,拓宽了其潜在的医学应用,该领域的深入研究,将有力推动抗病毒治疗和基因治疗载体的设计研究.     

核定位信号肽修饰的抗肿瘤纳米载药体系

纳米载药体系作为一类具有可控性和靶向性的药物递送工具,可以保护生物分子药物免于细胞内快速酶促降解、免于快速血液清除,确保将生物分子药物安全递送至作用部位,从而有效改善药物的生物利用度,提高药物疗效并降低毒副作用,在生物医学领域具有广阔的应用前景,在功能材料研究和肿瘤靶向治疗研究中受到广泛关注.近年来,通过使用功能性生物...