小鼠单个GV期卵母细胞中ATP8基因的表达分析

目的:探讨小鼠GV期卵母细胞线粒体中ATP8(ATP合酶亚基8)基因的表达情况。方法:应用挤压法从卵巢中分离获得生发泡期(germinal vesicle,GV)卵母细胞;用RT-PCR检测GV期单个卵母细胞中ATP8基因的表达:其中cDNA的合成分两种方法进行:一是将GV期单个卵母细胞直接进行RT合成cDNA,二是先用DNA酶加EcoRⅠ酶祛除mtDNA和核DNA后再进行RT;回收产物构建克隆质粒并测序。结果:1.5%琼脂糖电泳显示、测序结果均表明ATP8基因在GV期卵母细胞中有表达。结论:小鼠GV期卵母细胞特异表达的ATP8基因可能与卵母细胞的正常发育成熟相关。     

牦牛体外成熟卵母细胞差异转录组学研究

卵母细胞体外成熟环节是现代繁殖育种技术的基础环节,体外成熟的MⅡ期卵母细胞的质量直接影响了卵母细胞的后续受精及受精卵卵裂.由于卵母细胞的发育成熟是一个涉及大量基因转录调控的复杂过程.因此,转录组学研究是了解卵母细胞发生发育的关键.本研究以高海拔地区的特有牛属动物牦牛(Bos grunniens)卵母细胞作为研究对象,应用RNA-seq技术对牦牛GV期卵母细胞及体外成熟MⅡ期卵母进行转录组学测序及比对分析.经深度测序后,各获得一个包含51380686条过滤测序序列(cleanreads),4624261740碱基(bp)的GV期牦牛卵母细胞测序文库和一个包含50303412条过滤测序序列(clean reads),4527307080碱基(bp)的MⅡ期牦牛卵母细胞测序文库.基因覆盖率统计表明,GV期和MⅡ期文库中分别有16719条和16339条牦牛基因得到转录.通过比较分析MⅡ和GV期转录组数据,共筛选出4767个差异表达基因,其中1418个基因表达量上调和3349个基因表达量下调.GO功能分类注释显示,差异基因与"代谢过程"等生物学过程存在密切关联,同时结合分子功能相关类别等分子事件表现活跃.按表达量上调和下调分别对差异基因进行KEGG通路互作分析,结果表明,凋亡通路、内吞通路及代谢通路是上调的关键调控通路,而代谢通路、丙酮酸代谢、黏着斑及氧化磷酸化是下调的关键调控通路,其中代谢通路在上调及下调通路互作中均起关键调控作用.进一步对代谢通路进行分析,结果表明,组氨酸代谢、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢、乙醛酸和二羧酸代谢及谷胱甘肽代谢是整个代谢通路的关键调控节点。此外,本研究发现,在牦牛卵母细胞体外成熟过程中,与免疫相关的白细胞介素家族及干扰素家族基因发生了显著差异表达.该研究结果为进一步解析牦牛卵母细胞发育的分子机制及全面了解牦牛繁殖的特异性提供了基础.     

体外培养小鼠卵母细胞及其生长分化因子-9基因表达

体外培养小鼠的窦前卵泡以得到第二次减数分裂中期(MⅡ)卵母细胞,比较体外发育卵母细胞与体内生长的卵母细胞生长分化因子-9(GDF-9)的基因表达量,探讨GDF-9的表达对卵母细胞体外发育成熟的影响。选择体外培养第2天(D2)、D4、D6、D8、D10、D12卵母细胞作为体外发育组;同窝雌性小鼠出生后D12、D14、D16、D18、D20、D22卵母细胞作为体内发育组;半定量逆转录多聚酶链反应技术分别检测两组MⅠ卵母细胞GDF-9基因表达量。结果体外培养小鼠窦前卵泡可以得到MⅡ期卵母细胞,卵泡成活率、窦腔形成率、卵母细胞成熟率分别达到89·5%、51·8%和56·6%。小鼠卵母细胞GDF-9基因表达量随发育时间的改变而发生变化,而体外发育D8—12卵母细胞GDF-9表达量显著低于同期体内发育卵母细胞(P<0·05)。体外发育D8—12卵母细胞GDF-9基因表达量低于同期体内发育的卵母细胞的原因之一可能是其发育潜能较低。     

体外培养小鼠卵母细胞及其生长分化因子-9基因表达

体外培养小鼠的窦前卵泡以得到第二次减数分裂中期(MⅡ)卵母细胞，比较体外发育卵母细胞与体内生长的卵母细胞生长分化因子-9(GDF-9)的基因表达量，探讨GDF-9的表达对卵母细胞体外发育成熟的影响。选择体外培养第2天(D2)、D4、D6、D8、D10、D12卵母细胞作为体外发育组；同窝雌性小鼠出生后D12、D14、D16、D18、D20、D22卵母细胞作为体内发育组；半定量逆转录多聚酶链反应技术分别检测两组MⅠ卵母细胞GDF-9基因表达量。结果体外培养小鼠窦前卵泡可以得到MⅡ期卵母细胞，卵泡成活率、窦腔形成率、卵母细胞成熟率分别达到89.5%、51.8%和56.6%。小鼠卵母细胞GDF-9基因表达量随发育时间的改变而发生变化，而体外发育D8—12卵母细胞GDF-9表达量显著低于同期体内发育卵母细胞(P<0.05)。体外发育D8—12卵母细胞GDF-9基因表达量低于同期体内发育的卵母细胞的原因之一可能是其发育潜能较低。     

一个小鼠睾丸特异表达新基因mtIQ2的克隆和表达谱分析

运用数据库消减杂交筛选出一个在小鼠睾丸中特异表达的新基因--mtIQ2 (Genbank Accession No: DQ153247), Northern blot结果表明该基因的cDNA序列全长为1.2kb,小鼠多组织RT-PCR结果表明:该基因在睾丸中特异表达,而在其他组织中没有表达.运用隐睾模型对该基因的表达研究表明:在手术后第9d,该基因表达急剧下降,到18d完全消失.这些实验提示该基因在睾丸的发育和性成熟过程中可能起重要作用.     

齿肋赤藓中半定量RT-PCR方法的探讨

目的:建立一种半定量RT-PCR方法,用于齿肋赤藓(Syntrichia caninervis)基因表达研究。方法:比较常用的几种内参照基因actin、tubulin及18S rRNA在齿肋赤藓中的表达情况,以确定表达稳定的内参基因;分析PCR扩增动力学,确定内参和靶基因的PCR体系。结果:琼脂糖凝胶电泳检测分析表明:18S rRNA作为齿肋赤藓的内参基因更稳定;同管扩增试验表明:18SrRNA的引物滞后6个循环加入PCR扩增体系中,至第26个循环,二者同时处于指数扩增期,且靶基因RT-A的扩增效率不受影响。结论:18S rRNA与RT-A可以同管扩增,18S rRNA可以作为半定量RT-PCR的内参照,为齿肋赤藓基因表达研究奠定基础。     

SSH法分离早期发育相关基因片段

目的:分离和鉴定与小鼠合子基因组激活(ZGA) 以及母源调控向胚胎调控(MZT) 过渡事件 相关的基因片段,为进一步认识ZGA 和MZT 发生的分子机制奠定基础。方法:利用单个植入前 胚胎抑制性消减杂交(SPE2SSH) 的方法,对单个小鼠MⅡ卵母细胞和22细胞期胚胎进行双向消减 杂交;利用cDNA array 对获得的基因片段作进一步的鉴定。结果:从构建的消减杂交库中随机挑 取得31 个克隆,经cDNA array 鉴定发现其中有5 个MⅡ期特异表达的基因片段和9 个22细胞期 特异表达的基因片段,Genbank 检索发现其中10 个片段是首次报道在植入前发育阶段表达。结 论:这些基因片段具有明显的期特异性表达的特点,可能在ZGA、MZT 和胚胎植入前发育过程中 起着重要的作用。     

小鼠窦前卵泡培养成熟后卵母细胞纺锤体的变化

目的小鼠窦前卵泡体外培养得到成熟卵母细胞,观察卵母细胞的染色体和纺锤体形态,分析其变化及原因。方法完整小鼠窦前卵泡培养12 d,得到的卵母细胞进行免疫荧光染色,共聚焦显微镜观察纺锤体和染色体的形态和分布。结果经过体外培养,得到GV、M I、MⅡ期卵母细胞分别占总数27.9%、37.2%、34.9%;GV期卵母细胞存在完整的染色质圆环,11.8%的M I期卵母细胞显示正常纺锤体和染色体;38.5%的MⅡ期卵母细胞显示正常的纺锤体和染色体。结论小鼠窦前卵泡经体外培养后能够得到成熟的MⅡ期卵母细胞,但是其效率较低。原因可能是卵母细胞骨架结构的异常使染色体分离障碍,部分卵母细胞停留于M I期;同时成熟卵母细胞的受精率低也与纺锤体异常有关。     

银鲫卵母细胞体外诱导成熟技术的建立

研究以银鲫为材料, 根据银鲫(Carassius auratus gibelio)卵母细胞生发泡(Germinal vesicle, GV)边移程度及剥离GV中减数分裂前期染色体的凝集状态, 将银鲫Ⅳ时相的卵母细胞分为GV0、GV1、GV2和GV3四个时期; 并进一步比较了分别处于这4个时期银鲫卵母细胞体外诱导培养的成熟率、卵裂率和孵化率。结果表明, GV1期之后的卵母细胞均可有效进行体外诱导成熟, 可正常受精发育, 由于GV1期卵母细胞有较长时间用于显微操作, 因此GV1期卵母细胞被选为进行体外诱导的最早时期的卵母细胞。以GV1期卵母细胞为研究材料, 摸索了银鲫卵母细胞体外诱导成熟的适宜条件: 取GV1期的Ⅳ时相卵母细胞, 放置于pH 8.5、加有1 μg/mL孕酮激素(17α, 20β-dihydroxy-4-pregnen-3-one, DHP)的格氏平衡盐溶液(Gey’s balanced salt solution, GBSS)中, 在23℃培养箱中体外诱导12h后, 将滤泡膜剥离后再进行人工体外授精, 其所获胚胎的孵化率可达55.5%。此外, 将体外转录合成的带GFP标签的h2af1o mRNA注射到GV1期卵母细胞, 发现经显微操作和体外诱导后不仅可以通过GFP绿色荧光信号活体观察GVBD、受精、卵裂和早期胚胎发育的全过程, 而且诱导成熟的卵子仍可正常受精和胚胎发育。研究建立的银鲫卵母细胞体外诱导成熟技术为银鲫和其他鱼类卵母细胞发育过程研究及其相关基因和细胞显微操作提供了技术平台。     

草鱼MYH mRNA表达量分析中采用的内参基因稳定性比较

本研究分别以β-actin、18S rRNA和GAPDH为内参基因,采用实时荧光定量PCR对草鱼早期发育时期肌球蛋白重链(myosin heavy light,MYH)基因的mRNA表达量进行分析,并比较不同内参基因对MYH基因mRNA表达水平检测结果的准确性.研究结果表明,以β-actin和GAPDH作为内参,MYH基因mRNA表达水平完全一致,其表达量从原肠到仔鱼阶段逐次递增,仔鱼与原肠期阶段相比表达量差异显著;当采用18S rRNA作为内参时,MYH基因mRNA在发育阶段的表达量呈不稳定状态.因此,β-actin和GAPDH均可作为内参基因,用于草鱼早期发育中MYH基因mRNA的相对定量研究:而18S rRNA作为内参时,可能会对检测结果造成偏差.本研究不仅准确的揭示了草鱼MYH基因mRNA的表达特征,并且为荧光定量PCR技术在鱼类基因表达研究方面提供了有价值的参考.