枯草芽孢杆菌β-糖苷酶的克隆表达、体外定向进化及结构模拟

摘要:【目的】从枯草芽孢杆菌基因组DNA中扩增出bglC基因并在大肠杆菌中表达,分析表达产物的酶学性质并进行结构模拟,为进一步研究其生理功能及结构解析奠定基础。【方法】将bglC基因克隆到大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中表达,通过定向进化获取水解效率提高的突变株,经Ni-NTA镍离子层析柱纯化后,测定野生枯草芽孢杆菌β-糖苷酶与突变酶的性质。利用CD光谱,非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及三维结构建模,分析野生酶与突变酶的高级结构。【结果】野生酶的比活力为9.7 U/mg,最适催化温度为60℃,最适pH值是7.0。经过突变和筛选,我们得到一个突变体BS-GLY_M1(A242T/T385A/S425L),其比活力达到17.1 U/mg,最适温度为55 ℃,最适pH值是7.0,在55 ℃下的半衰期为3.5 h,比野生酶增加2 h。突变酶对4-硝基苯基-β-半乳糖苷、乳糖和熊果苷的催化效率(Km/Kcat)有所提高。酶在天然条件下以二聚体、四聚体状态存在,推测它以二聚体为基本功能单位。结构模拟结果表明突变后酶的三维结构有轻微地变化,这可能是酶热稳定性和催化效率提高的原因。【结论】枯草芽孢杆菌β-糖苷酶可以在大肠杆菌中高效表达并可以通过定向进化提高其水解效率。     

产外切葡聚糖酶真菌的筛选鉴定及毕赤酵母中的表达

【目的】外切葡聚糖酶是纤维素酶组分中一类对结晶纤维素有降解作用的酶类,如何提高外切葡聚糖酶活力是研究的关键问题。【方法】从筛选鉴定得到的一株产外切葡聚糖酶酶活较高的黑曲霉Asp-524菌株出发,通过PCR技术克隆得到外切葡聚糖酶基因序列,生物学信息分析后,构建了毕赤酵母诱导型表达载体,实现了该基因在毕赤酵母中的成功表达。【结果】抗性筛选得到的阳性转化子,用终浓度为1%甲醇诱导5 d后,酶活达到4.74 U/mL。酶学性质分析显示重组外切葡聚糖酶最适pH为5.0,pH稳定性分析显示在pH为4.0-6.0范围内相对稳定,酶活能保持在最高酶活力的80%以上,最适反应温度为50°C,经60°C保温1 h后,酶活仍能保持80%以上。【结论】结果说明该外切葡聚糖酶具有较好的热稳定性和pH稳定性,这一研究为纤维素酶的实际应用奠定了一定基础。     

里氏木霉纤维素酶的分离纯化及酶学性质

通过(NH4)2SO4分级沉淀、HiPrep 26/10 Desalting凝胶色谱脱盐、Source 15 Q阴离子交换色谱技术,里氏木霉(Rut C-30)纤维素酶主要组分得以初步分开,再经过Source 15 S阳离子交换色谱、HiPrep Sephacryl S-100 HR凝胶过滤色谱、Superdex 75 PrepGrade凝胶过滤色谱进一步分离纯化,得到2个纯化的内切葡聚糖酶组分EGⅡ、EGⅠ和一个外切葡聚糖酶组分CBHⅠ;经过SDS-PAGE电泳鉴定为电泳纯,测得相对分子质量分别为5.22×104,5.62×104和6.90×104。EGⅡ的最适反应pH是5.6,最适反应温度为65℃;EGⅠ的最适反应pH是4.4,最适反应温度为55℃;以羧甲基纤维素(CMC)为底物时,EGⅠ、EGⅡ的米氏常数(Km)分别为2.20 mg/mL、3.38 mg/mL。CBHⅠ的最适反应pH是5.8,最适反应温度为60℃,以对硝基苯基-β-D-纤维二糖苷(PNPC)为底物时,米氏常数(Km)为0.12 mg/mL。     

野生茯苓鉴定及其木质纤维素降解酶系研究

为揭示茯苓木质纤维素降解酶系及培养方式对其主要酶系的影响，该研究通过对野生茯苓菌株进行培养特性的显微观察，利用3对引物PCR扩增进行系统发育学的鉴定，经定性培养筛选出优势菌株YX1,采用酶标仪测定不同条件下茯苓纤维素酶、半纤维素酶和木质素降解酶的活力大小。结果表明：(1)茯苓有菌丝体、子实体和菌核3种形态特征。(2)PCR分别获得rDNA-ITS序列1 652 bp、核糖体大亚基序列660 bp和翻译延伸因子序列545 bp,提交至NCBI,登录号分别为ON129554、ON129553和ON155840。(3)纤维素酶和半纤维素酶在有松木屑和无松木屑条件下，外切β-葡聚糖酶(CBH)、内切β-葡聚糖酶(EG)、β-葡萄糖苷酶(BGL)最高分泌量分别为16～17 U·mL^-1、32～35 U·mL^-1、36～37 U·mL^-1;木聚糖酶、甘露聚糖酶和α-葡萄糖苷酶最高分泌量分别为28～38 U·mL^-1、280～342 U·mL^-1、9～11 U·mL^-1...     

Comparative study of the activity of lignocellulolytic enzymes in captive and field colonies of Coptotermes formosanus

以台湾乳白蚁Coptotermes formosanus Shiraki的室内群体与野外群体为研究对象,测定工蚁体内4种糖基水解酶和滤纸酶活(FPA)的活力大小及分布.结果表明:内切-β-1,4-葡聚糖酶(EG)、β-葡萄糖苷酶(BG)、外切-β-1,4-葡聚糖酶(CBH)、内切-β-1,4-木聚糖酶(Ex)及FPA的活性在不同组织中有较大差异.两类群体的BG、EX及CBH有相似分布,BG和EX分别高度集中于中肠和后肠,CBH主要在中肠及后肠分布.FPA和EG在两类群体中有不同分布,室内群体的主要在中肠,野外群体的则集中于后肠.两类群体各种酶活力大小顺序同为:EX＞EG≥BG＞CBH.此外,室内饲养群体的大小及年限对台湾乳白蚁木质纤维素酶活力无显著影响.     

室内饲养与野外台湾乳白蚁木质纤维素水解酶活性的比较研究

以台湾乳白蚁Coptotermes formosanus Shiraki的室内群体与野外群体为研究对象,测定工蚁体内4种糖基水解酶和滤纸酶活(FPA)的活力大小及分布。结果表明:内切-β-1,4-葡聚糖酶(EG)、β-葡萄糖苷酶(BG)、外切-β-1,4-葡聚糖酶(CBH)、内切-β-1,4-木聚糖酶(EX)及FPA的活性在不同组织中有较大差异。两类群体的BG、EX及CBH有相似分布,BG和EX分别高度集中于中肠和后肠,CBH主要在中肠及后肠分布。FPA和EG在两类群体中有不同分布,室内群体的主要在中肠,野外群体的则集中于后肠。两类群体各种酶活力大小顺序同为:EX>EG≥BG>CBH。此外,室内饲养群体的大小及年限对台湾乳白蚁木质纤维素酶活力无显著影响。     

一株纤维素降解真菌的筛选及鉴定

[目的]分离筛选高效降解纤维素的真菌菌株,并研究其产酶能力.[方法]利用刚果红染色法从甘蔗地土壤中分离纤维素降解真菌,再通过测定滤纸的降解率及发酵酶活复筛.[结果]综合考虑水解圈,水解圈和菌株直径的比值(HC值),滤纸的降解率和复筛酶活,对试验真菌降解纤维素的能力进行综合评价,筛选到具有较强纤维素降解能力的真菌菌株SJ1,经形态学观察及分子生物学鉴定,该菌属于草酸青霉.其滤纸酶活、内切葡聚糖酶酶活(CMC酶活)、β-葡聚糖苷酶酶活和外切葡聚糖酶酶活(CBH酶活)分别为25.15、740.42、58.03和2.442 U/mL.[结论]菌株SJ1是一株十分具有研究开发潜力的纤维素酶生产菌株.     

定点突变Ca~(2+)平衡位点对粘质沙雷氏菌脂肪的影响

为了研究粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)脂肪酶lip A中的Ca~(2+)对酶活力的影响,采用定点突变的方法对平衡Ca~(2+)的位点D388进行定点突变,对突变体进行诱导表达后,纯化目的蛋白并进行酶学性质分析。与野生酶相比,突变酶的最适温度由40℃降低到25℃,最适p H值由8.5降到8.0,T_(1/2)值比野生酶提高了2℃。由此可知,该Ca~(2+)对脂肪酶lip A酶学性质有着至关重要的作用。     

绿色木霉葡聚糖内切酶EGIII基因在大肠肝菌中的表达、定点突变及其动力学特性的研究

将绿色木霉葡聚糖内切酶EGIII基因亚克隆到表达载体pET-22b(+),构建重组质粒pET-egl3,转化到大肠杆菌BL21(DE3).利用金属亲和层析对重组EGIII进行纯化,纯化后酶比活力达到6 U/mg蛋白,最适反应温度为60 ℃,最适pH为4.0.同时对EGIII催化区的氨基酸残基R130和E218进行定点饱和突变,各筛选到一株酶活有提高的突变子R130P和E218F,其比活力为野生型EGIII的2.8倍和3.45倍.突变酶E218F的Km提高了一倍,催化效率Kcat提高了5.4倍;而R130P的Km和Kcat没有明显变化.两个突变酶的最适酶解温度和pH分别都提高至65 ℃和4.4.     

家蝇幼虫消化器官中纤维素酶的组成及酶活性分析

采用DNSA法研究家蝇3龄幼虫各消化器官中纤维素酶的组成及特性。结果表明,家蝇各消化器官均含有内切β-1,4-葡聚糖酶（endo-β-1,4 glucanase,EC 3214,EG）、外切β-1,4-葡聚糖酶（exo-β-1,4-glucanase, EC3.2.1.91,CBH）和β-葡萄糖苷酶（β-glucosidase, EC 3.2.1.21,BG）。家蝇消化器官中EG、CBH和BG的最适反应时间均为60 min,最适反应温度为50℃,这些酶在体外的热稳定性较好,在50℃以下处理1 h能保持较高的活性。这三种纤维素酶在不同消化器官中的配比关系和活性表现存在一定的差异,其中中肠的酶活性最高,在最适反应条件下,EG、CBH和BG的酶活性分别达到1.02±0.033 IU/mg、1.57±0.070 IU/mg和1.2±0.048 IU/mg。     

β-葡萄糖苷酶产生菌的筛选及其所产纤维素酶酶系组成分析

从木霉属、曲霉属、担子菌等17种试验菌株中筛选出一株产β-葡萄糖苷酶活性较高的黑曲霉A.niger-nl-1。该菌株在适宜的培养条件下,β-葡萄糖苷酶的最高活力达到4.7U/mL,适宜的产酶周期为4d。制备的β-葡萄糖苷酶最适反应温度为55℃、最适反应pH为5.0。该菌株除能产生β-葡萄糖苷酶外,还能产生内切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶,滤纸酶活达到0.62IU/mL。     

斜卧青霉114-2 cbh1基因的TAIL-PCR克隆及与抗阻遏突变株JU-A10的比较

[目的]研究斜卧青霉(Penicillium decumbens)114-2与其抗阻遏突变株JU-A10外切酶基因序列的差异.[方法]用热不对称交错PCR(TAIL-PCR)和RT-PCR扩增得到斜卧青霉114-2外切葡聚糖酶Ⅰ(cbh1)基因全长和cDNA全长.[结果]cbh1基因全长为1500 bp,含有两个内含子,编码453个氨基酸(GenBank,EF397602).克隆并分析了1.9 kb的cbh1基因上游序列,分别发现了葡萄糖代谢抑制因子CRE Ⅰ与纤维素酶转录调控蛋白ACE Ⅰ的两个的潜在结合位点.[结论]在相同的培养条件下,其抗阻遏突变株JU-A10的外切酶活明显高于野生株114-2.两菌株的cbh1基因序列完全一致,说明外切酶活明显提高不是由于cbh1基因发生突变引起的.     

长足大竹象内切葡聚糖酶最适反应条件的确定及其关键基因的筛选

【目的】本研究旨在阐明长足大竹象Cyrtotrachelus buqueti内切葡聚糖酶最适反应条件,并挖掘长足大竹象消化道内切葡聚糖酶关键基因。【方法】采用3,5-二硝基水杨酸(DNS)法,设置以羧甲基纤维素钠(MC)为反应底物的单因素和正交优化试验测定内切葡聚糖酶反应的最适条件。通过对长足大竹象发育转录组内切葡聚糖酶编码基因进行生物信息学分析,并将基因表达量与酶活性数据进行关联分析,筛选出发育时期中关键内切葡聚糖酶基因,采用实时荧光定量PCR对不同发育时期长足大竹象消化道内切葡聚糖酶关键基因表达量进行验证确定。【结果】研究表明,长足大竹象成虫内切葡聚糖酶的最适反应条件为：温度45℃,pH 5.6,底物浓度2%,酶比活力59.85 U/mg(雌)和52.87 U/mg(雄);幼虫内切葡聚糖酶的最适反应条件为：温度35℃,pH 4.8,底物浓度2％,酶比活力38.34 U/mg。筛选出长足大竹象消化道内切葡聚糖酶关键基因c64192_g1和c57057_g1。实时荧光定量PCR结果表明c64192_g1和c57507_g1基因在成虫时期表达量高于幼虫。【结论】长足大竹象雌雄成虫的内切葡聚糖酶比活力均高于幼虫,存在两个影响内切葡聚糖酶活性的关键基因c64192_g1和c57507_g1。这些研究成果丰富了内切葡聚糖酶来源,并为长足大竹象内切葡聚糖酶异源表达提供数据参考,进而为木质纤维素预处理和生物质能源的开发利用奠定理论基础。     

鳞杯伞α-半乳糖苷酶的提取纯化及酶学性质研究

采用离子交换层析和凝胶过滤层析对鳞杯伞子实体中的α-半乳糖苷酶进行纯化,得到了一种分子量为50 kDa的α-半乳糖苷酶,命名为CSG。纯化后的CSG纯化倍数为891.46倍,比活力为54.78 U/mg,得率为0.71%。通过BLAST比对液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)获得其肽段,发现其为GH27家族的α-半乳糖苷酶。CSG的最适pH为3.0,最适温度为50 ℃。在酸性范围pH 2.2-7.0和温度范围4-30 ℃有较好的稳定性。Mn²⁺、Cd²⁺、Cu²⁺对CSG有较强的抑制作用。半乳糖和蜜二糖对CSG的抑制类型为混合型抑制。化学修饰剂N-溴代琥珀酰亚胺显著降低CSG的活力,碳二亚胺对CSG具有显著的激活作用。该酶具有良好的蛋白酶抗性,且对棉子糖家族寡糖(RFOs)、瓜尔豆胶和赤槐豆胶均表现出良好的水解作用。     

黑曲霉(AS0006)产纤维素酶的纯化研究

利用实验室中黑曲霉菌株AS0006进行粗酶发酵,对产出的纤维素酶液进行不同饱和度(NH4)2SO4的分级沉淀,经过Sephadex G-25、Sephadex G-100分离纯化后,得到两种内切酶(EG)组分、一种外切酶(CBH)组分。通过酶活性及电泳检测发现,两种EG酶组分的相对分子质量分别为29.63 kD、37.49 kD,CBH酶组分相对分子质量为56.51 kD。相较原始粗酶液,EG回收率可达18.07%、纯化倍数为3.46,CBH回收率可达12.96%、纯化倍数为4.14,β-葡萄糖苷酶(CB)回收率可达22.37%、纯化倍数为3.58。     

α-酮戊二酸半醛脱氢酶的定点突变及酶学性质变化

3-HP是一种性质优良的化学中间体,以甘油为底物生产3-HP的研究备受青睐,而限制3-HP产量的主要原因是Ald H活力过低。对源于Azospirillam brasilense的α-酮戊二酸半醛脱氢酶(KGSADH)基因同源建模和结构分析,采用定点突变方法得到高活力KGSADH,将突变酶表达纯化,探讨酶学性质的变化。结果表明,TU-KGSADH(E120D/P219A)酶活力达6.03U/mg,比原始酶比酶活提高了322%,最适温度由35℃降低为30℃,且热稳定性降低,最适p H为8.0,在p H 6.0-8.0条件下酶活力有所提高。Zn~(2+)对KGSADH的酶活有较强的抑制作用,而Co~(2+)、Fe~(3+)、Fe~(2+)对KGSADH的酶活有较大的激活作用。在酶的动力学方面,TU-KGSADH对乙醛的K_m由7.58降为6.28 mmol/L,V_(max)由10.6提高为12.3 U/mg。对酶学性质改变的因素分析发现,120位突变与最适p H下降和p H稳定性向酸性偏移有关,219位突变可能是最适温度和热稳定性降低的原因,为醛脱氢酶进一步定向改造提供参考。     

嗜热革节孢GH1 BGL1进口端位点对酶活性及葡萄糖耐受性的影响

糖苷水解酶第一家族(GH1)β-葡萄糖苷酶(BGL1)有葡萄糖耐受性,进口端位点对酶活性及葡萄糖耐受性有很大影响,但具体作用机制尚不清楚。对嗜热革节孢GH1 BGL1进口端的W168、L173、F348、W349、C169、F180、D237、Y179、A260、H307、N335和E437这12个氨基酸残基进行定点突变,将突变酶与野生酶(WT)在毕赤酵母中表达,表达产物纯化后进行酶活性和葡萄糖耐受性测定。与WT相比,所有突变酶活性均有所降低,其中W168H、N335F和W349G几乎丧失活性。突变F180H、D237S、A260N和H307Y的Km低于WT,所有突变的kcat都降低。除L173Q外,其余突变都保持葡萄糖耐受性,在高浓度(400 mmol/L)葡萄糖时,Y179F和D237S酶活受到显著抑制。本研究表明,进口端位点对酶活性及葡萄糖耐受性均具有一定影响,催化活性通道的结构特异性可能是葡萄糖耐受机制。     

产木聚糖酶菌株的选育及其液体发酵条件

从土壤中筛出一株生长快产木聚糖酶活力较高的黑曲霉(Aspergillus niger)C—2菌株,经紫外线和甲基磺酸乙酯诱变,获得一突变株An—76,其生长减缓,孢子形成能力减弱,产生的术聚糖酶和β—木糖苷酶活力分别可达353．61U／ml和4．51U／ml。测定了An—76的正常产酶曲线,研究了麸皮、氮源、碳源及半纤维素浓度对产酶的影响。最适培养条件为：起始pH6.0、28℃、96h。酶的最适作用条件为50—55℃,pH4．8,在pHl．2—11．4范围内稳定。酶的热稳定性较差,55℃保温1小时,剩余活力为40％。只有在含木糖苷类物质存在时,An—76才大量合成木聚糖酶。     

凝结芽孢杆菌耐热β­N­乙酰氨基葡萄糖苷酶在大肠杆菌的分泌表达及其在制备GlcNAc中的应用

β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶体,可作用于几丁质或壳聚糖等天然底物,从末端水解产生N-乙酰-β-D氨基葡萄糖 (GlcNAc) 单体,其在医药和农业领域有较广泛的用途。文中克隆了耐热菌凝结芽孢杆菌Bacillus coagulans DMS1的β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因 (BcNagZ),并成功在大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3) 进行了分泌表达,蛋白表达量达到0.76 mg/mL。纯化后的BcNagZ分子量为61.3 kDa,测得的比活力为5.918 U/mg;进一步对该酶进行表征,结果显示酶的最适反应pH为5.5,最适反应温度为75 ℃,在65 ℃处理30 min后还有85%的残余酶活力,表明该酶具有良好的热稳定性。该酶的米氏常数Km为0.23 mmol/L,Vmax为0.043 1 mmol/(L·min)。重组BcNagZ可以水解胶体几丁质得到微量的GlcNAc,可以将二糖水解为单糖;偶联已报道的外切几丁质酶AMcase,可以有效地将胶体几丁质水解为GlcNAc,得率达到86.93%。     

内切葡聚糖酶高产菌株的诱变选育

【目的】建立里氏木霉(Trichoderma reesei)高产突变菌株的快速筛选方法,选育出高产内切葡聚糖酶的突变株。【方法】对里氏木霉T306菌株的初筛培养基进行优化,建立快速筛选方法;通过紫外诱变手段选育内切葡聚糖酶高产突变菌株,并对突变菌株的产酶培养基进行优化。【结果】在初筛培养基中添加浓度为0.1%(W/V)的乳糖、蛋白胨及脱氧胆酸钠有利于菌株的筛选。诱变后筛选出菌落形态发生明显变化的内切葡聚糖酶高产突变株0516,其羧甲基纤维素酶活力(CMC酶)较出发菌株提高了38.9%。其产酶培养基经优化后,得到最适碳、氮源分别为:乳糖1.50%、硫酸铵0.14%、尿素0.05%、蛋白胨0.10%,优化后CMC酶活力达64.2 U/mL,较优化前提高了2.3倍。【结论】建立了里氏木霉高产突变菌株的快速筛选方法,通过紫外诱变育种获得了产内切葡聚糖酶能力高且遗传稳定的突变株0516。