微生物小开放阅读框:小蛋白及翻译调控研究进展

小开放阅读框(small open reading frame, sORF)广泛存在于不同生物基因组中,由于其序列短,以及编码的产物小蛋白(smallprotein,或称微蛋白;microprotein或迷你蛋白miniprotein)检测困难等原因,小开放阅读框长期未得到充分注释和研究。近年来,随着高通量测序、翻译组和质谱分析等技术的不断发展,在不同生物中发现大量新的小开放阅读框,其编码的小蛋白及介导的翻译调控已应用于药物开发及植物抗病机理等研究。但是,目前对微生物的小开放阅读框相关研究和应用还相对有限。本文综述了小开放阅读框编码产物小蛋白的发现和鉴定,以及上游开放阅读框(upstream open reading frame, uORF)对mRNA翻译调控等最新研究进展,重点介绍了微生物基因组中小开放阅读框的鉴定和功能研究进展,为深入认识微生物中小开放阅读框的功能和作用机制,以及植物和动物等高等其他生物的小蛋白和翻译调控相关研究提供参考。     

鸡PPARγ基因的表达特性及其对脂肪细胞增殖分化的影响

为分析鸡PPARγ基因的组织表达特性及其在脂肪细胞增殖和分化过程中的功能,文章以东北农业大学高、低腹脂双向选择品系肉鸡为实验材料,利用Western blotting方法,检测PPARγ基因的组织表达特性及其在高、低脂系肉鸡腹部脂肪组织间的表达差异;采用RNAi技术,在鸡原代脂肪细胞中抑制PPARγ基因的表达后,通过MTT和油红O提取比色的方法,研究鸡PPARγ基因对脂肪细胞增殖和分化的调控作用;利用Real-timePCR和Western blotting技术,分析PPARγ基因表达下调后,其他脂肪细胞分化转录因子以及与脂肪细胞分化相关的重要基因的表达变化情况。结果表明,PPARγ基因在7周龄高脂系肉鸡腹部脂肪组织、肌胃、脾脏、肾脏组织中表达量较高,在心脏中表达量较低,在肝脏、胸肌、腿肌、十二指肠中未检测到表达信号;与高脂系相比,PPARγ基因在5和7周龄低脂系肉鸡腹部脂肪组织中的表达量较低(P<0.05);PPARγ基因的表达量下降后,鸡脂肪细胞的增殖能力增强,分化能力减弱;同时,C/EBPα、SREBP1、A-FABP、Perilipin1、LPL、IGFBP-2基因的表达量均下降(P<0.05)。由此可见,PPARγ基因的表达可能与肉鸡腹部脂肪的沉积有一定的关系,该基因可能是调控鸡脂肪细胞增殖与分化的关键因子。     

人类珠蛋白相关基因上游开放阅读框的变异分析

β-地中海贫血症是一种珠蛋白生成障碍的常染色体隐性遗传病。而γ珠蛋白基因的开放表达和胎儿血红蛋白的合成,是缓解β地中海贫血病人临床表型的一个重要因素。本研究针对202个血红蛋白相关调控基因或miRNA,对1802个β-地中海贫血症患者进行了目标区域捕获测序。通过生物信息学的分析,检测出了所有捕获区域内的突变。进一步对位于5′端非编码区(5′untranslated region, 5′UTR)的突变进行系统扫描,共计寻找到41个影响uORF(upstream open reading frame, uORF)有或无的功能性突变。从中选取了CHTOP基因(chr1:153606541 C>T)和TGFB1基因(chr19:41859418 G>A)的两个突变,通过定点诱变和双荧光素酶报告实验,在体外证实这两个突变均可显著地改变下游基因的表达。该研究结果为β-地中海贫血症临床表型的精确诊断提供了潜在的筛查靶点。     

3种蝙蝠听力相关基因EYA4(eyes absent 4)开放阅读框序列的克隆与分析

EYA4 基因是与果蝇(Drosophila melanogaster)的无眼基因eya同源的4个脊椎动物转录激活因子eya基因家族(EYA1-4)的一员.相关的研究表明EYA4基因与非综合征听觉障碍有关.蝙蝠特化的听觉系统在回声定位生理过程中负责回声信息的接收和处理,并起到重要作用.利用RT-PCR技术,通过克隆测序得到3种蝙蝠(大足鼠耳蝠Myotis ricketti,黑髯墓蝠Taphozous melanopogon,棕果蝠Rouaettusleschenaulti)EYA4 基因的开放阅读框序列.通过比对分析,发现这3种蝙蝠均没有第五外显子,而在第十一外显子与第十二外显子之间有一个其他哺乳动物所没有的外显子 exon b.此外,实验结果还显示,在棕果蝠中没有发现其他已知哺乳动物 EYA4 基因的第二十外显子;在黑髯墓蝠 EYA4 基因中缺少第十九外显子,而且与其他哺乳动物相比,黑髯墓蝠 EYA4 基因具有较短的第十六外显子,即缺少了30个碱基;大足鼠耳蝠与非蝙蝠哺乳动物一样存在第十九和第二十外显子的可变剪接模式,且在第二与第三外显子中间存在外显子exon a.     

小开放阅读框编码微肽的研究进展

已有的研究表明,生命体中存在着大量的非编码RNA(non-codingRNA,ncRNA),先前被错误注释为ncRNA的分子序列中实际上包含小的开放阅读框(short open reading frame, sORF),部分sORF可转录并翻译成进化保守的微肽(micropeptide),这些sORF由于序列较短和研究技术手段的限制而被忽略。迄今为止,已在生命体中发现一些sORF编码的功能各异的微肽,它们对生命活动的调控起着重要作用。本文对近年来发现的功能性微肽进行综述,介绍了本课题组发现新型微肽MIAC (micropeptide inhibiting actin cytoskeleton)的过程,同时总结了研究潜在微肽的相关技术,以期为研究人员利用相关技术发现新微肽提供借鉴和参考。     

植物小开放阅读框编码肽的研究进展

小开放阅读框（small open reading frame,sORF）一般指基因组中能够编码长度在100个氨基酸左右或以内短肽的开放阅读框。它们广泛存在于植物基因组,却因编码短肽而常被基因组注释忽视。随着翻译组学和蛋白质组学测序技术的发展,具有翻译活性的sORF被证实广泛存在于植物基因组,且参与植物生长发育等重要过程的调控。该文归纳了近些年来植物领域sORF的一些研究进展,主要包括sORF的来源与分类、信息学预测方法和生物学功能等,并基于此对植物sORF未来的研究方向进行了展望。     

鸡γ干扰素成熟蛋白基因的表达及其产物抗病毒活性测定

以血淋巴细胞提取的总RNA为模板,通过RT-PCR的方法克隆出鸡干扰素成熟蛋白的基因,把它与非融合表达载体pRLC相重组。通过对阳性宿主菌的不同时间的诱导摸索出最佳表达时间。把表达产物进行变性,复性,纯化后加入鸡胚成纤维细胞上,用水疱性口炎病毒进行攻毒,测出鸡重组干扰素的活性单位为1.0?06U/mL,获得了满意结果。     

RT－PCR联合一步法扩增G蛋白α亚基基因的开放阅读框

报道逆转录－多聚酶链式反应（ＲＴ－ＰＣＲ）联合一步程序,扩增大于１ｋｂ的拟南芥菜Ｇ蛋白α亚基基因的开放阅读框。该程序中,当ＲＮＡ模板和引物变性,并在同一管中加入ＰＣＲ缓冲液、４种ｄＮＴＰ底物、逆转录酶和ＴａｑＤＮＡ聚合酶之后,就不需其它手工操作步骤,因而可同时进行大批量样品的操作。实验结果证明ＡＭＶ（鸟类骨髓性白血病病毒）逆转录酶对ＴａｑＤＮＡ聚合酶的活性没有抑制作用。这种ＲＴ－ＰＣＲ联合一步法可从０．５μｇ的总ＲＮＡ中快速地扩增长于１．０ｋｂ的ｃＤＮＡ片段。     

RT－PCR联合一步法扩增G蛋白α亚基基因的开放阅读框

报道逆转录－多聚酶链式反应（ＲＴ－ＰＣＲ）联合一步程序,扩增大于１ｋｂ的拟南芥菜Ｇ蛋白α亚基基因的开放阅读框,该程序中,当ＲＮＡ模板和引物变性,并在同一管中加入ＰＣＲ缓冲液,４种ｄＮＴＰ底物,逆转录酶和ＴａｑＤＮＡ聚合酶之后,就不需其它手工操作步骤,因而可同时进行大批量样品的操作,实验结果证明ＡＭＶ（鸟类骨髓性白血病病毒）逆转录酶对ＴａｑＤＮＡ聚合酶的活性没有抑制作用,这种ＲＴ－ＰＣＲ联合一步法可     

鸡γ干扰素成熟蛋白基因的表达及其产物抗病毒活性测定

以血淋巴细胞提取的总RNA为模板,通过RT-PCR的方法克隆出鸡γ干扰素成熟蛋白的基因,把它与非融合表达载体pRLC相重组.通过对阳性宿主菌的不同时间的诱导摸索出最佳表达时间.把表达产物进行变性,复性,纯化后加入鸡胚成纤维细胞上,用水疱性口炎病毒进行攻毒,测出鸡重组γ干扰素的活性单位为1.0×106U/mL,获得了满意结果.     

Dystrophin基因3-7号外显子缺失后下游新翻译区启动与BMD关系的生物信息学分析

目的:研究dystrophin基因3-7号外显子缺失后下游新翻译区启动与贝克氏肌营养不良(Becker muscular dystrophy,BMD)的关系及可能机制.方法:用生物信息学方法对dystrophin基因3-7号外显子缺失后可能的启动子、开放阅读框、翻译起始位点、蛋白疏水性性质改变及重要结构域进行分析.结果:3-7号外显子缺失后,起始于正常肌肉启动子的转录体,其翻译阅读框提前终止,但在8号外显子内可能启动一个新的翻译阅读框;内含子2或7里可能含有类似启动子的元件,也可能导致8号外显子内翻译区的启动.新阅读框编码的蛋白仍然保留有重要的功能区,患者可以表现为BMD.结论:dystrophin基因3-7号外显子缺失后下游新翻译区仍有存在启动的可能,患者可以表现为BMD表型.     

PPARγ基因真核表达载体的构建及其在乳腺癌MDA-MB-231细胞中的表达

目的:构建以绿色荧光蛋白(GFP)为报告基因的重组表达质粒pEGFP-C1-PPARγ,观察小鼠PPARγ基因在MDA-MB-231细胞中的表达及定位.方法:采用克隆和亚克隆技术构建小鼠PPARγ基因真核表达栽体,脂质体Lip2000介导转染MDA-MB-231细胞,real-time PCR和western-blot验证其mRNA和蛋白的表达,荧光显微镜观察该基因亚细胞定位.结果:酶切和测序结果证实重组质粒含有PPARγ编码区序列且插入方向正确,转染后观察该基因亚细胞定位于胞核,胞质有弥散分布.结论:成功构建了小鼠PPARγ基因真核表达载体,该基因在MDA-MB-231细胞中成功表达,PPARγ基因主要集中表达于胞核.     

缺铁应答基因FOX1上游调控基因的筛选

[目的]筛选与莱茵衣藻FOX1基因启动子结合的调控基因序列。[方法]利用酵母单杂交的方法,构建pHIS2.1-FOX1诱饵载体,并将其转入到酵母菌株Y187中,在SD/-Trp/-His/-Leu/50 mmol/L 3-AT筛选培养基上挑选酵母阳性转化子,PCR克隆阳性转化子的序列并测序,利用Blastx程序检索phytozome莱茵衣藻基因组数据库,获得阳性转化子序列的同源基因信息。[结果]18个酵母阳性转化子测序成功,其同源基因主要有CTR型铜离子转运体(CTR2)、核糖体蛋白,和参与光合作用、氧化还原反应和物质运输等方面的功能蛋白。[结论]利用酵母单杂交技术筛选到缺铁应答基因FOX1潜在的上游调控基因。     

共表达MDV糖蛋白B和鸡γ干扰素基因的重组鸡痘病毒的构建

鸡马立克氏病 (ＭＤ)是鸡的常见的淋巴组织增生性疾病 ,由α 疱疹病毒引起。由于该病既能引起免疫抑制作用 ,又能导致较高的病死率 ,一直是危害养鸡业发展的重要疾病之一[1] 。现使用的疫苗有马立克氏病病毒 (ＭＤＶ)血清 1、2、3型单价苗和混合多价苗 ,在疾病的预防中起重要作用。但ＭＤ冻干疫苗免疫保护力低而液氮疫苗保存运输不方便 ,并常因此造成免疫失败。为了研制免疫保护率高、使用方便新一代疫苗 ,国内外许多实验室开展了ＭＤ重组基因工程疫苗的研究 ,如ＭＤ亚单位疫苗、重组活病毒载体疫苗、基因疫苗等。目前研制成功的重组疫苗的…     

PPARγ基因真核表达载体的构建及其在乳腺癌MDA—MB-231细胞中的表达

目的：构建以绿色荧光蛋白（GFP）为报告基因的重组表达质粒pEGFP—C1—PPARγ,观察小鼠PPARγ基因在MDA-MB-231细胞中的表达及定位。方法：采用克隆和亚克隆技术构建小鼠PPARγ基因真核表达载体,脂质体Lip2000介导转染MDA—MB-231细胞,real—time PCR和western—blot验证其mRNA和蛋白的表达,荧光显微镜观察该基因亚细胞定位。结果：酶切和测序结果证实重组质粒含有PPAIh编码区序列且插入方向正确,转染后观察该基因亚细胞定位于胞核,胞质有弥散分布。结论：成功构建了小鼠PPARγ基因真核表达载体,该基因在MDA—MB-231细胞中成功表达,PPARγ基因主要集中表达于胞核。     

M－CAT盒在鸡AchR γ－亚基基因转录激活中的作用

原代培养鸡胚肌细胞瞬时转染结合氯霉素乙酰基转移酶水平测试表明：鸡ＡＣｈＲγ－亚基基因缺失近起始点一对Ｅ盒（ＣＡＮＮＴＧ）的－２０４／－５０片段与含Ｅ盒的－２０４／＋３６片段一样,均可独立激活ｔｋ启动子的转录活性,证明了该片段的增强子样作用,利用鸡胚肌肉核抽提物与－２０４／－５０片段进行胶阻滞分析,检出了明显的迁移位移条带的发生;迁移条带不仅可被未标记的－２０４／－５０片段消除,而且还可被含Ｍ－ＣＡＴ盒（ＣＡＴＴＣＣＴ）的２３ｂｐ寡核苷酸竞争阻断,说明胶阻滞分析中出现的迁移条带系由核内因子特异结合－２０４／－５０片段中的Ｍ－ＣＡＴ序列所致,上述结果证明,Ｍ－ＣＡＴ盒对鸡ＡＣｈＲγ－亚基基因－２０４／－５０片段的转录激活功能起作用。     

地塞米松和胰岛素调节猪脂肪细胞SOCS-3、OB、GLUT4和PPARγ基因的表达

猪是研究糖尿病最理想的模型动物,研究胰岛素和胰岛素抵抗是研究糖尿病的重要环节。为明确SOCS-3在胰岛素抵抗中的作用,分别用100nmol／L的胰岛素,300nmol／L的地基米松处理原代培养的猪脂肪细胞诱导胰岛素抵抗;利用半定量RT-PCR技术分别检测SOCS-3、OB、GLUT4和PPARγ基因表达变化。结果发现,胰岛素增加了GLUT4、SOCS-3和PPARγ基因的表达,对OB基因表达变化没有显著性影响;地塞米松诱导的胰岛素抵抗状态下OB和SOCS-3基因表达水平升高,而GLUT4和PPARγ基因表达水平显著下调。研究结果表明,GLUT4基因表达量水平的升高可能是由于PPARγ的高表达引起,SOCS-3基因的不同表达水平对胰岛素信号的抑制效果不同。地塞米松诱导的胰岛素抵抗不仅表现在对葡萄糖转运的抑制,也反映在抑制了胰岛素信号;而SOCS-3基因可能是消除胰岛素抵抗的一个有效靶基因。     

转录因子OCT-4对靶基因AP-2γ表达调控的研究

OCT-4和AP-2γ是近年来睾丸生殖细胞瘤诊断过程中研究的热点基因.作为一个在胚胎发育中起着重要作用的转录因子,OCT-4基因在发育的不同时期、不同分化过程中发挥着多种生物学功能,其作用是通过对靶基因的调控来实现的.本研究运用多种软件分析,发现AP-2γ启动子区域的序列部分有OCT-4的结合位点.利用CHIP-PCR方法鉴定AP-2γ是OCT-4调控的靶基因.应用Luciferase assay、免疫荧光实验、小鼠隐睾模型等实验进行验证,OCT-4基因抑制AP-2γ转录活性和影响其蛋白质水平的表达.这一新发现,有利于从分子水平上研究睾丸生殖细胞瘤的发生机制.     

IRES介导的非帽依赖翻译调控研究进展

内部核糖体进入位点(Internal ribosome entry site, IRES)是一种存在于RNA内部的特殊功能元件,其可在不依赖5’端帽子结构的情况下直接招募核糖体启动蛋白翻译,已被发现与多种细胞过程密切相关。近来,越来越多的证据表明IRES在环形RNA翻译调控中扮演着极其重要的角色,由此IRES引起人们的极大关注。本文针对目前真核细胞中IRES介导的翻译调控机制进行了综述,并对IRES元件相关生物信息学工具进行了总结。     

棉纤维蔗糖合酶基因SS3上游调控序列的克隆及其表达分析

棉纤维蔗糖合酶基因SS3在棉纤维发育过程中起着重要作用.采用YADE技术克隆了该基因5′上游1717bp的调控区,该调控区含有典型的启动子核心元件TATA box ,以及TATC box、G box、GCN4 -motif、Prolamin box、Skn 1 likemotif、TCA element、HSE和O2 site等各种顺式调控元件和其他一些反应元件.将此序列和报告基因GUS融合在烟草、棉花中表达.组织化学分析结果显示棉花SuSyR序列启动GUS基因在烟草的子房、胎座、种子以及在棉花花蕾与棉铃中表达.在棉花花蕾蕾长为3mm、6mm、9mm和15mm花蕾中表达主要存在于雄蕊及雄蕊管、胎座等器官;在棉铃中,1DPA棉铃的花柱、花药、子房及胚珠中出现了蓝色,6DPA棉铃的子房及胚珠被染成蓝色,在2 0DPA的棉铃中蓝色只出现在胚珠及其纤维中、在胚珠中只有珠心被染成蓝色,在4 0DPA胚珠中只有纤维呈蓝色.研究结果揭示,棉花的SuSyR调控序列启动GUS基因主要在子房、胚珠和纤维等器官和主叶脉、茎微管束等输导组织中表达,在棉花中尤为明显,表明棉纤维蔗糖合酶基因SS3除参与棉花蕾铃发育、纤维素的合成外,还参与了光合产物的运输与分配过程.