β—银环蛇毒素A链cDNA的克隆和表达

从银环蛇毒腺中抽提总ＲＮＡ,ＲＴ－ＰＣＲ扩增编码β－银环蛇毒素Ａ链的ｃＤＮＡ,克隆并测定了全序列。一个新的ｃＤＮＡ得以克隆,其编码一个２７个氨基酸的信号肽和一个１２０个氨基酸的成熟蛋白。该成熟蛋白和其他β－银环蛇毒素Ａ链一样,具有１３个位置固定的半胱氨酸,而且和这些Ａ链具有很高的同源性。此外,以同样的引物,从眼镜蛇毒腺总ＲＮ中。克隆到编码眼镜蛇ＰＬＡ２前体的ｃＤＮＡ。将β－银环蛇毒素Ａ链和眼镜蛇Ｐ     

中华眼镜蛇神经毒素cDNA的克隆及表达

通过ＲＴ－ＰＣＲ的方法,从广西产中华眼镜蛇总ＲＮＡ中克隆到３个新的神经毒素ｃＤＮＡ序列,命名为ＮＬ１、ＮＬ２和ＮＬ３。它们编码的蛋白质序列与台湾眼镜蛇神经毒素ｃｏｂｒｏｔｏｘｉｎ的同源性分别为７７％、７２％和９８％,均具有维持ｃｏｂｒｏｔｏｘｉｎ结构与功能必需的残基Ｔｙｒ＾２５、Ｌｙｓ＾２７、Ｔｒｐ＾２９、Ａｒｇ＾３３和Ｌｙｓ＾４７。ＮＬ３克隆于ｐＥＴ２８ｂ＋表达载体内,转化至ＢＬ２１（ＤＥ３）中     

α-银环蛇毒素同工毒素基因的克隆和表达

α-银环蛇毒素是存在于银环蛇蛇毒中的一种长链神经毒素,能与神经递质受体特异性结合,因此它不仅是神经信号传导机制研究的重要分子探针,更具有开发治疗某些神经性疾病新型药物的可能性。用SMART技术,反转录合成银环蛇毒腺cDNA,克隆并测定了α-银环蛇毒素基因,得到14种mRNA序列;进而将其中一种新的α-银环蛇毒素基因亚克隆到原核表达载体pQE30a和pGEX-4T-1中,在大肠杆菌中通过IPTG诱导表达,其中带有GST融合蛋白的重组质粒α-BgTX(P22-A31)／pGEX-4T-1在BL21菌株中得到高效表达,表达量占菌总蛋白的30％,可溶形式存在的融合蛋白大于25％。     

蛇神经毒素的表达和鉴定

抽提中华眼镜蛇毒腺总RNA,通过反转录PCR扩增Cobrotoxin cDNA,克隆并测序。该cDNA编码83个氨基酸,包括21个氨基酸的信号肽和62个氨基酸的成熟蛋白。该成熟蛋白的氨基酸序列和通过蛋白测序从台湾眼镜蛇鉴定的Cobrotoxin完全一致。PCR扩增编码Cobrotoxin的DNA,并亚克隆到表达载体pMAL-P₂。此外,通过合成寡核苷酸片段,拼接成完整的CM11基因,并将其克隆至pMAL-P₂。经IPTG诱导,两种神经毒素基因在大肠杆菌中都得到高效的可溶性融合表达。表达产物通过SDS-PAGE和蛋白印迹杂交加以鉴定。表达的融合蛋白经过Sepharose 6Bamylose亲和色谱和DEAESepharose FF离子交换色谱得到有效纯化。经Xa因子酶切后得到的两种重组神经毒素都具有小白鼠体内毒性。     

α-银环蛇毒素基因的克隆与表达

与传统的捕蛇或养蛇提毒的方法相比,利用基因工程方法生产蛇神经毒素具有明显的潜在优势。本研究结合国内外的研究现状,以α-银环蛇毒素(α-bungarotoxin,α-BgTx)为例子来探讨蛇神经毒素基因在大肠杆菌表达体系中的表达情况及其规模生产的可行性。首先根据文献报道α-银环蛇毒素的氨基酸序列,推导出其DNA序列并设计成部分互补的4条寡核苷酸片段,利用DNA合成仪人工合成、纯化其寡核苷酸片段,通过片段退火、切口补平、连接、克隆、测序鉴定获得了α-银环蛇毒素基因;然后将α-银环蛇毒素基因克隆至pGEX-2T质粒中分别转化大肠杆菌DH5(和JM109进行表达分析,融合蛋白约占细菌总蛋白的30％～40％,其中部分为可溶性表达,部分以包含体的形式表达;对可溶性表达的条件进行了优化。最后以天然纯化的α-银环蛇毒素作为对照,分析融合方式表达的重组α-银环蛇毒素的活性,ELISA结果显示其与天然的α-银环蛇毒素比较具有相似的抗原性。     

大熊猫垂体泌乳素(PRL)cDNA的克隆与表达

从大熊猫脑垂体中提取总RNA,利用RT-PCR技术,首次扩增出大熊猫垂体泌乳素(PRL)cDNA序列(GenBank登录号：AY161285)。结果表明,大熊猫PRL cDNA的开放阅读框为687bp,编码含229个氨基酸残基的前体蛋白。将克隆的PRL cDNA片段构建到表达质粒pGEX-4T-1中,转化大肠杆菌BL21,在异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)的诱导下表达PRL蛋白。SDS—PAGE电泳结果表明,表达的PRL蛋白为不可溶蛋白。蛋白质同源性比较显示,大熊猫与猪、猫的同源性大于95％,与人、牛、山羊的在70％～80％之间,与小鼠、大鼠的分别为45．9％和52％。大熊猫aa^64为丝氨酸,是亲水性氨基酸;而猫、牛、山羊(脯氨酸)和人(丙氨酸)aa^64是疏水性氨基酸。在二级结构上,aa^64在第一α螺旋与第二α螺旋之间,极性的差别可能导致蛋白空间结构的不同。     

人Leptin基因的cDNA的克隆和表达

克隆人Leptin基因的cDNA并获取表达的Leptin蛋白,为进一步研究新的Leptin相关蛋白打下基础。以人基因组DNA为模板,用引物悬挂延伸PCR法,克隆与6个组氨酸（6×His）密码子相连的人Leptin基因的cDNA,并将其克隆到体外表达载体pIVEX23MCS上,通过体外快速翻译系统(Roche公司的RTS500环状模板试剂盒和RTS500 ProteoMaster仪器)在体外表达了带有6×His的Leptin融合蛋白。经SDSPAGE及Western blot方法鉴定,融合蛋白大小正确,有172个氨基酸,分子量为1946kD,具有特异的抗原性,且主要以可溶形式存在于反应液上清中。     

α—银环蛇毒素基因的合成与表达

结合国内外的研究现状,以α－银环蛇毒素为例来探讨蛇神经毒素基因在大肠杆菌表达体系中的表达情况及其规模生产的可行性。首先根据文献报道α－银环蛇毒素的氨基酸序列,推导出其ＤＮＡ序列并设计成部分互补的４条寡核苷酸片段,利用ＤＮＡ合成仪人工合成,纯化这４条寡核苷酸片段,通过片段退火,切口补平,连接,克隆,测序鉴定获得了α－银环蛇毒素基因,然后将ａ－银环蛇毒素基因克隆至ｐＧＥＸ－２Ｔ质粒中分别转化ＤＨ５α和     

中华眼镜蛇短链神经毒素cDNA的克隆及在大肠杆菌中的表达

利用RT－PCR技术从中华眼镜蛇毒腺组织中成功地克隆了短链神经毒素CDNA。测序结果表明,该基因开放阅读框架编码83个氨基酸残基,其中对个为信号肽,成熟肽为62个氨基酸残基。该基因与GenBank报道的相同物种的神经毒素基因有相当的同源性,不同物种之间的信号肽序列十分保守。将短链神经毒素CDNA再经PCR扩增除去信号肽序列,克隆到pT7ZZ表达质粒中,转化E.coliBL21（DE3）后,经IPTG诱导可高效表达分子量为23kDa②左右的融合蛋白。表达产物占菌体总蛋白的25％左右。     

东亚钳蝎神经毒素基因BmK IT3的克隆及其在大肠杆菌中的表达

东亚钳蝎毒素基因ＢｍＫＩＴ3 编码是由 6 5个氨基酸残基组成的多肽物质。该类毒素为专一性作用于昆虫的抑制型神经毒素 ,它已被广泛用于研究离子通道作用机理[1 ] ;同时 ,它是研究蛋白质结构和功能的极好模型 ,是研究神经药理学的理想工具 ,将具有药理活性和昆虫毒性的基因导入细胞或动植物体内具有十分重要的应用价值。它对昆虫作用的专一性很高 ,对哺乳动物无害或毒性很小 ,可作为一种安全、有效的生物杀虫剂[2 ,3 ] 。我们的研究是对该基因密码子进行优化 ,采用化学合成的方法合成了适于在昆虫中表达的ＢｍＫＩＴ3 的两条长的引物 ,通过…     

胭脂鱼胰岛素样生长因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)cDNA的分子克隆、序列分析及组织表达

参考多种生物的胰岛素样生长因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)基因序列,设计并合成引物。用胭脂鱼(Myxocyprinus asiaticus)肝总RNA逆转录得到cDNA并扩增获得特异性片段,回收纯化后亚克隆到pMD-18T载体上。测序后经序列比对分析表明,所得到的序列是胭脂鱼胰岛素样生长因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)cDNA片段,共489bp,包括该基因完整的开放阅读框(ORF)486bp,编码162个氨基酸。氨基酸序列与其他鲤形目鱼类具有较高的同源性,对胭脂鱼IGF-Ⅰ在一些组织中的表达研究发现,IGF-Ⅰ在肝中表达最多,其次是胰、性腺,在脑、垂体、鳃、心、脾中也有不同程度的表达,而在肠、肾、肌肉中的表达不十分明显。     

羊驼显性白毛调控KIT基因的分子克隆及在大肠杆菌中的表达

为研究羊驼显性白毛调控基因的结构特点及体外表达产物的生物活性,利用RT-PCR技术,首次从羊驼皮肤组织中扩增出羊驼KIT基因exon10-14 cDNA编码序列。结果表明:羊驼KIT基因exon10-14 cDNA长414bp,包括30 bp的exon10、127 bp的exon11、125 bp的exon12、91 bp的exon13和41 bp的exon14(全长151 bp),编码含138个氨基酸残基的蛋白;羊驼与牛、羊、猪、人、马等相比,核苷酸的同源性分别为94%、93%、93%、92%、92%,氨基酸的同源性均大于97%。构建了原核表达载体pET-32a( )-KIT,转化大肠杆菌DH5α,在异丙基硫代半乳糖苷诱导下表达KIT蛋白。结果表明:羊驼KIT基因在大肠杆菌中进行了高效特异性融合表达,融合蛋白分子量约为36 kD,目的蛋白约占菌体总蛋白的20%。     

东亚钳蝎K+通道阻断肽cDNA的克隆与表达

目的：克隆东亚钳蝎毒素基因,以进一步研究其生物学和药理学功能。方法：利用已知蝎神经毒素基因序列,设计引物,用RT-PCR方法克隆从蝎毒腺组织蝎毒素cDNA。结果：成功地克隆了一个新的东亚钳蝎毒素基因,该基因开放阅读框架编码59个氨基酸残基,其中前22个为信号肽,成熟肽为37个氨基酸残基,经PCR扩增除去信号肽序列,克隆到pTreHisA质粒中,在E．coli中表达了分子质量为7ku左右融合蛋白,表达产物占菌体总蛋白的21％左右。结论：其结构中含有三对二硫链,6个Cys残基组成蝎K^ 通道毒素共同特征序列-CXXXC-、-GXC-、-CXC-,推断其为K^ 通道阻断肽,命名为KChTX1。已被Gene-bank收录,收录号为AY129234。     

胡萝卜体细胞胚胎发生培养物cDNA的分子克隆和选择

从13日龄的胡萝卜Woolc细胞株培养物分离PolyA+mRNA,按Leonard程序合成双链cDNA,将cDNA甲基化、末端变平,并与EcoR I接头连接之后再与λgtll DNA连接构成重组DNA分子,经离体包装,构建得到一个复杂度为1．5×10⁶的cDNA文库。组织特异的cDNA克隆用与胚胎组织抗原特异反应的多克隆抗体进行筛选得到。     

肝再生增强因子的cDNA克隆,表达及表达产物的生物活性研究

以肝部分切除后再生肝组织为起始材料,利用ＲＴ－ＰＣＲ扩增出大夺再生增强因子（ＡＬＲ）,亚克隆子于ＰＧＥＭ－Ｔ载体,核苷酸序列测定证实为大鼠ＡＬＲ;将ＡＬＰＣＤＮＡ亚克隆于ＰＢＶ２２０质粒,构建了原核表达载体,并获高效表达菌株,特异表达蛋白占细菌总蛋白的１５％,原核表达的ＡＬＲ在体外缺乏促进大鼠原代培养肝细胞及ＳＭＭＣ－７７２１肝癌细胞ＤＮＡ合成的活性,但天体内１／３肝部分切除模型中可刺激肝细胞ＤＮ     

α-银环蛇毒素基因的克隆及其非融合型原核表达研究

根据文献报道α－银环蛇毒素的氨基酸序列推导出其DNA序列,设计并人工合成两两互补的14条寡核苷酸片段。经片段延伸、PCR、克隆,成功构建α-银环蛇毒素基因克隆质粒;质粒经XbaI和EcoRI双酶切回收后连接于表达载体pET28a(+)中,分别转化BL21（DE3）、BL21（DE3）Codonplus、BL21（DE3）plysS进行诱导表达,表达产物经Tris/tricine系统进行SDS-PAGE分析。结果表明：该基因已在大肠杆菌BL21（DE3）宿主菌中进行了非融合表达,其表达量占细菌总蛋白的11.98％,主要以包涵体形式存在;同时对表达条件进行了优化,其表达量可达16.28%。经Westernblot分析,在大约8kDa处出现明显的目的带,与预计蛋白分子量大小一致,说明表达产物与天然α-银环蛇毒素具有相似的免疫原性。表达产物纯化、复性后经动物毒性试验表明：表达的α-银环蛇毒素蛋白具有生物学活性,小鼠腹腔注射其LD50约为1.28μg/g。     

蛇毒神经毒素类似物的免疫学分析

选取眼镜蛇蛇毒和银环蛇蛇毒中 1 0个差异较大的神经毒素类似物 ,通过麦芽糖融合表达系统使它们在大肠杆菌中得到高效可溶性表达 .通过 Amylose- Sepharose6B亲和树脂纯化这些融合蛋白 .分别制备这 1 0种融合蛋白多克隆抗体 .同时将这 1 0种神经毒素类似物进行硫氧还蛋白融合表达 ,表达产物基本上都是包涵体 .以硫氧还蛋白融合表达产物为抗原和上述 1 0种神经毒素类似物抗血清进行 Western blotting.结果显示 ,大多数神经毒素类似物之间没有免疫交叉反应 ,表明这些神经毒素类似物的抗原性差别较大 ,可能存在不同的分类和进化