利用启动子缺陷型打靶载体敲除五指山小型猪GGTA1基因

目的:获得α-1,3-半乳糖基转移酶(GGTA1)基因敲除的五指山小型猪胎儿,为异种器官移植研究提供基础平台。方法:以新霉素磷酸转移酶基因(neo)为筛选标记基因构建启动子缺陷型打靶载体,打靶载体线性化后用电转染法将其导入胎儿成纤维细胞中,转染后的细胞经G418筛选后,用PCR法检测药物抗性的细胞克隆,对阳性细胞进行核移植构建重构胚胎及胚胎移植。结果:转染后,经筛选共得到176个具有G418抗性的细胞克隆,经PCR检测,其中2个细胞克隆发生了同源重组;以其中1个GGTA1+/-细胞克隆为供体细胞进行核移植,将重构胚移植到2头自然发情的受体母猪中,1头受体妊娠;第37 d将代孕母猪处死,获得2个胎儿,经PCR和Southern印迹鉴定,均为GGTA1单等位基因敲除胎儿。结论:构建了五指山小型猪GGTA1基因部分外显子4区域敲除的启动子缺陷型打靶载体,获得了GGTA1单等位基因敲除的胎儿,为培育GGTA1基因敲除的五指山小型猪奠定了基础。     

锌指核酸酶技术制备肌肉生长抑制素基因敲除的五指山小型猪成纤维细胞

敲除猪肌肉生长抑制素(Myostatin, MSTN)基因可能提高猪瘦肉率, MSTN基因敲除猪也可作为相关疾病的动物模型。文章利用锌指核酸酶(Zinc-finger nucleases, ZFNs)技术敲除五指山小型猪胎儿成纤维细胞MSTN基因, 为制备MSTN基因敲除猪奠定基础。ZFNs质粒或编码ZFNs的mRNA均能高效敲除MSTN基因, 使用ZFNs mRNA能直接得到MSTN+/-和MSTN-/-两种基因型的细胞克隆。DNA序列测定与分析发现, 细胞克隆的突变类型多为ZFNs作用靶位点处不大于10 bp的碱基插入或缺失(92.18 %); 氨基酸预测发现, 突变型MSTN基因的终止密码子常常提前出现。将MSTN基因敲除的细胞进行体细胞核移植(Somatic cell nuclear transfer, SCNT)发现, 胚胎体外早期发育潜力与野生型无显著差异, 表明这些细胞可用于后续MSTN基因敲除猪的制备。     

利用CRISPR/Cas9系统构建Tiki1基因修饰猪模型

Tiki1基因是哈佛大学儿童医学院贺熹教授实验室发现的一个对蛙头部的诱导起到决定性作用的新基因,但Tiki1基因在小鼠等啮齿类动物中缺失,因此无法利用小鼠等小动物来研究其在哺乳动物中的作用.本文利用CRISPR/Cas9系统结合体细胞克隆技术构建Tiki1基因修饰猪模型,研究Tiki1基因在猪发育中的作用.我们利用贺熹教授团队提供的人Tiki1基因序列,在猪的基因组数据库中比对出与其同源性最高的一段序列设计2个靶位点(g1和g2).以设计的靶位点构建打靶质粒转染猪胎儿成纤维细胞,经细胞筛选、PCR扩增及测序共鉴定了52个单细胞克隆株.最终选择靶位点g1为纯合双敲的5个单细胞克隆株和靶位点g2为纯合双敲的3个单细胞克隆株作为构建Tiki1基因敲除猪的核供体.我们共计构建了720个重组胚胎,分别植入3头代孕母猪,其中有1头经B超检测成功怀孕并妊娠到期产下13头发育正常的克隆猪,经测序鉴定其中12头为Tiki1基因双敲除猪模型,Tiki1基因敲除克隆猪健康存活至今.结果表明Tiki1基因对于猪早期发育的作用机理不同于蛙,其在猪早期发育的过程中的具体作用机理有待后续进一步的深入研究.     

利用CRISPR/Cas9技术建立OXTR基因敲除猪胎儿成纤维细胞系

利用CRISPR/Cas9系统建立催产素受体(oxytocin receptor,OXTR)基因敲除的巴马猪胎儿成纤维细胞系(porcine fetal fibroblasts,PFFs),为构建OXTR基因敲除巴马猪模型提供供体细胞。首先,对人和猪的OXTR基因进行了生物学信息分析。其次,利用在线设计工具设计了2个靶向猪OXTR外显子区的sgRNA,并克隆至pX330骨架质粒中,最后将打靶质粒和Neomycin抗性质粒共转染至PFFs中,用G418药物筛选出抗性单克隆细胞,测序鉴定其基因型。生物信息学分析显示人和猪OXTR基因进化距离较近,氨基酸序列一致性达到91%,相似性为93%,三维结构的RMSD值为0.009。成功构建OXTR基因的Cas9/sgRNA打靶载体,转染PFFs细胞后,药物筛选获得OXTR基因敲除的单克隆细胞并测序证实了基因突变型。人和猪OXTR基因具有高度同源性;构建的Cas9/sgRNA表达载体高效实现了OXTR基因编辑,成功获得基因敲除的单细胞克隆,为后续构建OXTR敲除的巴马猪模型奠定了前期基础。     

利用CRISPR/Cas9技术建立敲除JAK2基因K562细胞系

目的:利用CRISPR/Cas9技术对K562细胞系JAK2基因进行编辑,构建JAK2基因敲除的K562细胞系。方法:使用CRISPR在线设计工具,针对JAK2基因设计sgRNA,构建Cas9-sgRNA共表达质粒。使用第二代慢病毒包装系统包装慢病毒并感染K562细胞,提取细胞基因组DNA,Sanger测序和TA克隆检测基因编辑活性。无限稀释法将编辑阳性的细胞接种于96孔板并扩培得到单克隆细胞株,提取基因组DNA,Sanger测序和TA克隆分析敲除JAK2单克隆细胞的基因型。结果:成功构建靶向敲除JAK2基因的lentiCRISPRv2-sgRNA3-1质粒。优化方案得到低细胞毒性高转染效率的感染K562细胞慢病毒量。CRISPR/Cas9系统成功在JAK2基因sgRNA3-1识别位点发挥基因组编辑活性,获得纯合敲除JAK2基因细胞株K562-JAK2~(-/-)(两个等位分别发生移码突变,预期编码没有功能的JAK2蛋白)。结论:CRIAPR/Cas9系统通过慢病毒感染方式获得JAK2基因纯合敲除的K562细胞株,该细胞模型可用于研究在慢性髓系白血病中JAK2基因的作用,为构建K562敲除其他基因细胞系提供实验依据,为探究造血分化机制的研究奠定实验基础。     

利用CRISPR/Cas9系统建立Xist基因敲除猪模型

体细胞核移植技术在家畜良种繁育、基因修饰动物生产、濒危动物的拯救和人类疾病的治疗等领域具有重要的应用价值,但目前克隆动物生产效率较低,平均不超过5%。低下的克隆效率极大地限制了该技术的快速发展。在影响克隆猪生产效率的诸多因素中,X染色体的异常失活是导致克隆效率低下的重要原因,而与X染色体失活密切相关的一个重要基因是Xist基因,这表明Xist基因可能直接或间接地影响猪的克隆效率。本文以CRISPR/Cas系统为基础,在Xist基因上设计5个CRISPR/Cas系统打靶位点,并筛选出有效的Target 3、Target 4 sgRNA,在细胞水平切割效率为1%和3%,在胚胎水平为75%和85.7%。同时将有效的sgRNA体外转录并显微注射至胚胎体内,发现Target 3和Target 4组合效果最好,敲除效率为100%。通过胞浆注射和胚胎移植方法生产出6头克隆猪,有2头活仔实现完全敲除。本文成功建立Xist基因敲除猪模型,为后续通过敲除猪Xist基因提高克隆效率的研究奠定了基础。     

广西巴马小型猪PGC-1α基因克隆与组织表达分析

目的克隆广西巴马小型猪PGC-1α基因编码区（CDS）序列,利用RT-PCR和QRT-PCR方法分析PGC-1αmRNA组织表达情况。方法本实验以广西巴马小型猪背最长肌cDNA为模版,PCR扩增PGC-1α基因CDS序列,将其连接至pEASY-T5载体,转染细菌、验证和序列测定;通过RT-PCR半定量和QRT-PCR实时荧光定量检测PGC-1α基因在小型猪多个组织中的表达情况。结果克隆获得广西巴马小型猪PGC-1α基因CDS序列,全长2391 bp,编码796个氨基酸,与参考序列的同源性为99.9%,两处碱基发生同义突变,分别是C-A1105和GA1524;PGC-1α基因在广西巴马小型猪心脏和肾脏中的表达丰度最高,其次是肝脏、皮下脂肪和背最长肌,而在胰腺中未检测到其表达。结论成功克隆了广西巴马小型猪PGC-1α基因编码区序列并进行了多种组织表达分析,为后续研究PGC-1α在小型猪2型糖尿病发生过程中作用途径打下基础。     

基于CRISPR/Cas9技术敲除SAMHD1肝癌细胞系的构建及对增殖的影响

运用CRISPR/Cas9基因编辑技术,建立SAMHD1基因敲除的Huh7细胞系,并检测敲除SAMHD1基因后对人肝癌细胞Huh7细胞增殖的影响.针对SAMHD1基因作用的功能区域,设计靶向SAMHD1的小向导sgRNA(Small Guide RNA).构建lentiCRISPRv2-SAMHDl-gRNA重组质粒转化后测序.筛选稳定敲除SAMHD1的稳定细胞系并测序鉴定.采用克隆形成实验分析基因SAMHD1敲除后肝癌细胞Huh7细胞的增殖能力.测序结果显示lentiCRISPRv2-SAMHDl-gRNA载体构建成功.Western blot结果和测序结果表明成功构建敲除SAMHD1的Huh7稳定细胞系.克隆形成实验结果表明,相对于Huh7-WT细胞,Huh7-KO SA-MHD1的细胞增殖能力增强(P＜0.01).成功构建基于CRISPR/Cas9技术敲除SAMHD1基因的Huh7细胞系,SAMHD1的表达缺失促进肝癌细胞的增殖.     

利用CRISPR/Cas9技术构建VPS34基因敲除的A549/293T细胞系

该研究利用CRISPR/Cas9策略构建敲除VPS34基因的A549/293T细胞系,并初步将其用于自噬功能研究。应用在线工具设计了针对VPS34基因的3条sgRNA,并克隆至pX459载体。将重组质粒转染A549/293T细胞,嘌呤霉素初步筛选,通过PCR后测序和Western blot技术检测发现, sgRNA-1的敲除效果最好。将转染sgRNA-1的两种细胞单克隆化, PCR测序发现,存在碱基缺失, Western blot结果显示,对应的单克隆也未检测到VPS34蛋白,可见成功获得了VPS34敲除的A549/293T细胞系。由于VPS34参与自噬起始,实验结果显示, VPS34敲除后, LC3-I向LC3-II转化显著被抑制,自噬底物P62大量累积。结果表明,该方法成功获得稳定敲除VPS34基因的A549/293T细胞系,且细胞中的自噬被显著抑制。同时,敲除VPS34能够降低人肺癌A549细胞的生长速率。该实验利用CRISPR/Cas9系统首次获得稳定敲除VPS34基因的哺乳动物细胞A549/293T细胞系,为后续自噬功能研究提供有力工具。     

GGTA1~(-/-)五指山小型猪SLAI类基因分子特征及与HLA相似性分析

目的明晰α-1,3半乳糖基转移酶基因敲除(GGTA1-/-)的五指山小型猪SLA经典I类基因分子结构特征及其与人HLA的相似性,对研究异种器官移植细胞性排斥反应具有重要意义。方法采集6头祖代GGTA1-/-五指山小型猪耳组织,利用RT-PCR对SLA I类基因(SLA-1、SLA-3、SLA-2)扩增、克隆及测序,对序列进行BLAST分析,并采用生物信息学方法对SLA I类基因分子结构特征及其与人HLA的同源性进行分析。结果测序分析表明,共获得6条等位基因序列,其中4条为已公布的等位基因(SLA-1*0703、SLA-2*1102、SLA-3*0401、SLA-3*0403),另2条为新等位基因(SLA-1*0401wz01、SLA-2*11wz01)。五指山小型猪与人HLA同源性为70.5%~72.1%。SLA-1*0401wz01、SLA-1*0703、SLA-2*11wz01、SLA-2*1102和SLA-3*0401的CD8+分子识别的关键结合域与人HLA氨基酸序列比对,均仅在位点225、228处发生了突变(T→S、T→M),其他位点高度保守。SLA-2*11wz01和SLA-2*1102与人HLA I类基因NK细胞抑制性受体(killer inhibitory receptor,KIR)结合区氨基酸同源性较高,在NKTA-1亚型结合域内仅有1个氨基酸差异,而在NKTA-2和NKTA-3亚型结合域内有2个氨基酸差异。结论从免疫细胞介导的异种排斥反应角度出发,GGTA1-/-五指山小型猪SLA I类基因氨基酸序列与人HLA高度相似,可作为未来猪-人异种器官移植的良好供体之一。     

CRISPR/Cas9介导的LATS1/2敲除抑制卵巢癌细胞ES-2增殖

Hippo信号通路在哺乳动物肝脏发育、动态平衡、再生和疾病中发挥非常重要的作用。大肿瘤抑制基因1/2（large tumor suppressor 1/2, LATS1/2）激酶是Hippo信号通路的关键激酶,可以磷酸化YES相关蛋白（yes-associated protein,YAP）,从而调节YAP的核质定位和降解。本文采用CRISPR/Cas9方法构建慢病毒介导的Last1/2基因敲除的载体,通过包装、感染和嘌呤霉素筛选,获得LATS1/2部分敲除的人卵巢癌ES-2和H08910细胞,免疫印迹方法检测LATS1/2表达明显减少。细胞增殖实验检测LATS1/2缺失明显抑制ES-2和HO8910细胞增殖。软琼脂克隆形成实验表明,LATS1/2缺失抑制卵巢癌ES-2细胞的克隆形成能力。细胞划痕和Transwell实验证明,LATS1/2缺失明显抑制卵巢癌ES-2细胞迁移。流式细胞检测发现,LATS1/2敲除促进卵巢癌ES-2细胞凋亡并影响细胞周期。裸鼠成瘤实验表明,LATS1/2缺失明显抑制体内肿瘤组织增殖。分子机制研究表明, LATS1/2敲除促进卵巢癌ES-2细胞中胶原I型α1（collagen type I α1,ColIα1）基因表达量增加,在卵巢癌ES-2细胞中同时敲除LATS1/2和COL1A1,可以促进细胞克隆形成。综上结果,人卵巢癌ES-2细胞中LATS1/2缺失能促进COL1A1表达增加, 从而抑制细胞增殖、转移和克隆形成,并影响细胞周期和促进细胞凋亡。     

GHR基因敲除香猪的鉴定及生长指标测定

为获得纯合的GHR基因敲除香猪的种群,本研究以贵州从江香猪为母本,中国农业大学提供的GHR基因敲除猪(GHR(+/-))为父本杂交选育F1代,筛选出F1代阳性杂合子猪和阴性猪,再用F1代阳性杂合子猪进行扩繁得到F2代。测定F1代和F2代猪的生长指标,同时检测F1代和F2代阳性猪。实验结果表明F1代GHR基因敲除阳性猪(GHR+/+)和阴性猪(GHR+/-)生长指标差异均不显著(p0.05)。F2代GHR基因敲除猪在3月龄时体长、体重存在显著差异(p0.05),F2代4月龄阳性猪与阴性猪各项指标均差异显著(p0.05)。测序结果显示F1阳性杂合子猪共11头,阴性猪15头;F2阳性纯合子猪共8头,阴性猪9头。     

广西巴马小型猪Presenilin-2基因真核表达载体的构建及其在小鼠N2a细胞中的表达验证

本研究的目的是构建广西巴马小型猪Presenilin-2真核表达载体并在细胞水平对其进行验证。利用RT-PCR的方法扩增并克隆Presenilin-2基因,再将Presenilin-2亚克隆到p EGFP-N1,通过脂质体转染方法将p EGFP-PS2-N1转至N2a细胞,48 h后在荧光显微镜下观察细胞是否表达绿色荧光蛋白。结果显示,本研究成功构建了阅读框架正确的广西巴马小型猪Presenilin-2基因真核表达载体,转染p EGFP-PS2-N1后,N2a细胞有绿色荧光蛋白的表达。该研究将为下一步研究Presenilin-2基因的功能和生产转Presenilin-2基因猪奠定基础。     

利用CRISPR/Cas9技术定点敲除烟草多酚氧化酶基因NtPPO1

植物多酚氧化酶具有多种重要的生理功能。为研究烟草中多酚氧化酶基因功能,从GenBank中挑选一个烟草多酚氧化酶基因(基因登录号为XM_016608009.1),命名为NtPPO1。NtPPO1编码序列经PCR扩增、克隆测序验证后,采用CRISPR/Cas9技术定点敲除NtPPO1,并利用实时荧光定量PCR检验基因敲除效果。研究表明烟草NtPPO1全长1 746 bp,存在2种可变剪切方式。经测序与分析发现,T2突变体中的NtPPO1序列在靶位点处发生了1个、2个碱基的缺失突变与1个碱基的插入突变。实时荧光定量PCR检测结果显示,与对照相比,T2突变体中NtPPO1表达水平显著下降。烟株外观显示NtPPO1突变体与野生型对照之间无明显差异。     

实验用西藏小型猪CYP3A基因的克隆及序列分析

目的:克隆西藏小型猪CYP3A基因并与人及其它小型猪品种进行序列比对分析。方法:根据Genebank数据库设计引物,取西藏小型猪新鲜肝脏组织,Trizol法提取肝脏总RNA,应用RT-PCR反转获得肝脏cDNA。分别扩增基因CYP3A46、CYP3A22、CYP3A29及CYP3A39,PCR片段回收后分别连接pMD-18T载体,获得重组质粒pT-CYP3A,阳性重组克隆送测序。采用NCBI Blast及vector NTI软件进行序列比对分析。结果:CYP3A46、CYP3A22、CYP3A29及CYP3A39基因编码序列全长1512 bp,编码503个氨基酸,与人CYP3A4相同。其中CYP3A22和CYP3A39与NCBI记录巴马小型猪序列相同;CYP3A46与巴马小型猪CYP3A46(NM_001134824.1)有6个位点碱基不同。CYP3A29与巴马小型猪CYP3A46(EU918131.1)亦有6个位点碱基不同。对来自2个母本后代猪的基因经过PCR扩增后测序发现CYP3A46、CYP3A29序列完全一致。结论:成功克隆西藏小型猪CYP3A的4个基因,其中CYP3A46与人CYP3A4的序列相似性最高。所得CYP3A46与CYP3A29序列可能为西藏小型猪独有。     

广西巴马小型猪克隆胚的构建及胚胎移植

通过胚胎移植验证构建的广西巴马小型猪克隆胚是否可以发育到期.利用刺入式手术胚胎移植法,将0.5～1.5日龄巴马小型猪克隆胚移植到2头巴马小型猪和2头陆川猪的输卵管壶腹部.其中2头巴马小型猪和1头陆川猪返情,另外一头陆川猪于2007年10月13日产下1头克隆雄性巴马小型猪.说明巴马小型猪克隆胚能够在受体猪体内发育到期并产仔.     

Myostatin基因打靶载体的构建及猪胎儿成纤维细胞Myostatin基因的敲除

目的:用缺口修复等技术构建Myostatin(肌肉生长抑制素,MSTN)基因打靶载体,并对大白猪胎儿成纤维体细胞进行转染,获得基因敲除细胞。方法与结果:首先构建用于MSTN基因同源长臂(LA)的抓捕载体,然后在大肠杆菌内利用Red同源重组系统介导的缺口修复,从含大白猪MSTN基因座的细菌人工染色体上亚克隆9.9 kb的LA到抓捕载体上,经过部分序列测定,同源性为100%;通过PCR获得1.4 kb的同源短臂(SA);将LA和SA连入载体pLOXP,构建含有neo和tk正负筛选标记基因的MSTN基因打靶载体pLOXP-MSTN-KO;将线性化的pLOXP-MSTN-KO通过电转染整合到大白猪胎儿成纤维细胞基因组中,利用G418和丙氧鸟苷进行药物筛选,获得抗性细胞克隆890个,通过PCR和DNA测序鉴定获得基因敲除的细胞克隆4个。结论:构建了有效的MSTN基因打靶载体,通过转染获得基因敲除细胞,为利用体细胞核移植制备MSTN基因敲除猪奠定了基础。     

CRISPR/Cas9慢病毒系统敲除胰岛β细胞PKA C-α的研究

利用CRISPR/cas9系统建立稳定敲除PKA C-α基因的INS-1细胞株,研究PKA C-α在胰岛β细胞中的功能。设计2个长25 bp且分别靶向PKA C-α基因的exon 5和exon 7的sgRNA,将其克隆至LentiCRISPRv2-sgRNA质粒并转染至293T细胞中制备sgRNA-Cas9慢病毒,慢病毒感染INS-1细胞,嘌呤霉素筛选出阳性细胞并采用有限稀释法筛选单克隆细胞,Western blotting印记法检测单克隆细胞中PKA C-α蛋白的表达水平,测序确认单克隆细胞中PKA C-α基因的突变位点。WB实验证实靶向Exon 5的sgRNA可成功敲除PKA C-α基因,得到稳定敲除PKA C-α基因的细胞株,测序结果表明该细胞株的PKA C-α基因发生1 bp碱基插入突变,并且敲除PKA C-α基因的INS-1细胞胰岛素分泌能力下降。本实验利用CRISPR/Cas9系统成功敲除INS-1细胞中的PKA C-α基因,为研究PKA C-α在胰岛β细胞中的功能奠定了基础。     

基于CRISPR/Cas9技术构建严重联合免疫缺陷小鼠

目的应用CRISPR/Cas9技术靶向敲除编码小鼠T、B细胞的Rag2基因及编码NK细胞的IL2rg基因,构建T、B细胞及NK细胞联合免疫缺陷小鼠。方法根据Genbank报道的Rag2及IL2rg基因序列,分别针对其外显子设计25 bp左右的sgRNA并进行合成,sgRNA退火后克隆入p X330载体。Rag2-sgRNA、IL2rg-sgRNA及Cas9重组质粒体外转录为mRNA后显微注射入BALB/c小鼠受精卵细胞,受精卵细胞移植到受体动物获得子代小鼠,首建鼠(F0)与野生型小鼠交配获得F1代小鼠,突变的F1代小鼠互交后筛选F2代纯合子小鼠。通过基因测序、流式细胞技术及接种人源性肿瘤细胞系方法检测子代小鼠基因型和表型。结果成功构建了Rag2-sgRNA、IL2rg-sgRNA重组质粒并对其进行了体外转录,mRNA显微注射并移植后获得57只F0小鼠。连续交配后,获得F2代纯合子小鼠。序列分析表明子代小鼠中IL2rg有两个基因型,分别是10 bp和11 bp的缺失突变;而Rag2只有一个基因型,为8 bp的缺失突变。与野生型BALB/c小鼠相比,小鼠外周血中CD3、B220及NKp46阳性细胞数量明显降低。接种人乳腺癌细胞系SKBR-2HL后,肿瘤生长良好,且随着时间延长肿瘤组织逐渐增大。结论利用CRISPR/Cas9技术可有效实现BABL/c小鼠体内Rag2、IL2rg基因突变,并导致小鼠T、B及NK细胞功能异常。