下调TLR4对LPS诱导的支气管上皮16HBE细胞损伤的影响及其机制

目的探讨TLR4对脂多糖（LPS）诱导的支气管上皮16HBE细胞损伤的影响及其机制。 方法将3条siRNA-TLR4-1、siRNA-TLR4-2和siRNA-TLR4-3转染至16HBE细胞中,筛选出最佳的siRNA-TLR4干扰序列进行实验。实验分为对照组（未处理）、LPS组（给予50 μg/ml LPS处理）、LPS+siNC组（转染siRNA-NC后给予50 μg/ml LPS处理）和LPS+siTLR4组（分别转染设计的3条siRNA-TLR4后给予50 μg/ml LPS处理）,采用RT-PCR检测TLR4、IL-6和TNF-α mRNA的表达,MTT法检测细胞活力,流式细胞仪检测细胞凋亡率,Western Blot检测Bcl-2、Bax、Cleaved Caspase-3、NF-κB p65和IκBα蛋白的表达。多组间比较使用单因素方差分析,组间多重比较采用SNK-q,两组间比较采用独立样本t检验。 结果LPS组与LPS+siTLR4-2组TLR4 mRNA（2.05±0.12,3.28±0.15）和蛋白表达（0.38±0.03,0.77±0.05）比较,差异具有统计学意义（t?= 11.091,11.585,P均< 0.001）;LPS组与LPS+siTLR4-3组TLR4 mRNA（1.39±0.09,3.28±0.15）和蛋白表达（0.31±0.02,0.77±0.05）比较,差异具有统计学意义（t?= 20.857,12.650,P均?< 0.001）且siRNA-TLR4-3的效果最为显著。与对照组相比,LPS组、LPS+siNC组和LPS+siTLR4组细胞中IL-6 mRNA（11.42±1.05,11.38±1.34,6.22±0.35,0.97±0.06,F?= 98.803,P均< 0.01）、TNF-α mRNA（15.76±1.12,15.69±0.87,7.54±0.41,1.03±0.09,F?= 278.064,P均< 0.01）、Cleaved Caspase-3蛋白（0.75±0.06,0.77±0.05,0.38±0.03,0.13±0.02,F?= 154.851,P均< 0.01）、Bax蛋白（0.48±0.05,0.52±0.05,0.33±0.02,0.11±0.02,F?= 71.310,P均< 0.01）、NF-κBp65蛋白（0.64±0.05,0.67±0.05,0.45±0.04,0.28±0.02,F?= 56.571,P?均?< 0.01）的表达水平和细胞凋亡率[（21.36±2.85）﹪,（20.94±3.22）﹪,（13.08±1.16）?﹪,（7.25±1.28）﹪,F?= 25.685,P均< 0.01]均明显升高,而细胞活力（0.53±0.04,0.51±0.04,0.78±0.06,1.15±0.08,F?= 80.811,P均< 0.01）和Bcl-2蛋白（0.28±0.03,0.25±0.03,0.40±0.03,0.69±0.06,F?= 76.762,P均< 0.01）、IκBα蛋白（0.38±0.03,0.35±0.03,0.44±0.03,0.72±0.06,F?= 53.635,P均< 0.01）的表达水平均明显降低;与LPS组相比,LPS+siTLR4组中IL-6 mRNA、TNF-α mRNA、Cleaved Caspase-3蛋白、Bax蛋白、NF-κBp65蛋白的表达水平和细胞凋亡率均明显降低,差异有统计学意义（t = 8.138,11.937,9.553,4.825,5.140,4.661,P均< 0.01）,而细胞活力和Bcl-2蛋白、IκBα蛋白的表达水平均明显升高,差异有统计学意义（t = 6.005,4.899,3.674,P < 0.05）,而LPS组和LPS+siNC组间差异无统计学意义（P > 0.05）。 结论下调TLR4可通过抑制NF-κB通路激活抑制LPS诱导的细胞凋亡和炎症反应减轻16HBE细胞损伤。     

miR-214通过调控Notch1信号对口咽鳞状细胞癌细胞株增殖、侵袭及凋亡的作用机制研究

目的研究miR-214通过调控Notch1信号对口咽鳞状细胞癌（OSCC）细胞株增殖、侵袭及凋亡的作用机制。 方法在ATCC细胞库购买OSCC细胞株,分为3组：抑制组（IN组）、模拟组（SI组）及对照组（CO组）。通过Western blot法、qRT-PCR法、TUNEL法、侵袭实验及CCK-8法分析3组癌细胞中Notch1的蛋白、mRNA表达水平、细胞凋亡、迁移及增殖能力的差异性,三组间比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用LSD-t检验。 结果IN、SI、CO组细胞内miR-214mRNA表达量分别为1.15±0.26,3.34±0.89,2.08±0.67,SI组分别与IN组、CO组比较,差异具有统计学意义（t = 5.281,P = 0.002;t = 2.529,P = 0.045）;SI组、IN组的Notch1-UTR表达分别为0.42±0.11、0.86±0.09,差异具有统计学意义（t = 5.362,P = 0.006）;IN、SI、CO组的OSCC细胞凋亡率分别为（0.78±0.10）﹪、（0.32±0.06）﹪、（0.56±0.12）﹪,IN组分别与CO组、SI组比较,差异具有统计学意义（t = 3.149,P = 0.020;t = 8.823,P < 0.001）;IN、SI、CO组癌细胞的增殖率分别为（0.65±0.05）﹪、（1.26±0.06）﹪、（1.89±0.04）﹪,IN组与SI组、IN组与CO组比较,差异具有统计学意义（t = 11.056,P < 0.001;t = 27.394,P < 0.001）,CO组与SI组比较,差异具有统计学意义（t = 12.365,P < 0.001）;IN、SI、CO组癌细胞侵袭率分别为（0.13±0.02）﹪、（0.89±0.13）﹪、（0.48±0.11）﹪,SI组与CO组、SI组与IN组比较,差异具有统计学意义（t = 4.176,P = 0.006;t = 10.147,P < 0.001）;IN、SI、CO组的Notch1蛋白含量分别为：2.38±1.34、0.94±0.23、1.76±0.67,SI组与CO组、SI组与IN组比较,差异具有统计学意义（t = 2.588,P = 0.041;t = 2.368,P = 0.056）;IN、SI、CO组的Notch1 mRNA表达量分别为4.26±1.06、1.45±0.38、2.46±0.87,IN组与CO组、IN组与SI组比较,差异具有统计学意义（t = 2.935,P = 0.026;t = 5.583,P = 0.001）。 结论miR-214可能与OSCC细胞株增殖呈负相关,在细胞中miR-214含量升高,可能抑制Notch1信号通路表达,从而促进癌细胞增长、侵袭,抑制癌细胞凋亡。     

miR-142-3p靶向FSTL1基因对结直肠癌细胞增殖、凋亡以及放疗敏感性的影响

目的探究miR-142-3p靶向卵泡抑素样蛋白1（FSTL1）对结直肠癌（CRC）细胞增殖、凋亡以及放疗敏感性的影响。 方法培养正常人结肠细胞FHC与CRC细胞系SW480、DLD-1、HCT116和Caco-2,qRT-PCR检测细胞中miR-142-3P水平,Western Blot检测FSTL1蛋白水平;分别转染miR-142-3p模拟物（miR-142-3p组）、模拟物阴性对照（miR-NC组）、FSTL1的si-RNA9（si-FSTL1组）、si-RNA阴性对照（si-con组）至CRCSW480细胞,MTT检测细胞增殖情况,流式细胞仪检测细胞凋亡水平,Western Blot检测增殖、凋亡相关蛋白水平,克隆形成实验检测放射敏感性;双荧光素酶报告基因、Western Blot验证miR-142-3p与FSTL1关系及在CRC中作用。采用t检验和方差分析进行统计学分析。 结果CRC细胞SW480、DLD-?1、HCT116、Caco-2中miR-142-3p水平（0.86±0.09、1.09±0.11、0.76±0.08、0.98±0.10）低于正常结肠细胞FHC （2.56±0.26）,差异具有统计学意义（t?= 18.536,15.621,19.851,17.016,P均< 0.01）,FSTL1 mRNA水平2.26±0.23、1.39±0.14、2.01±0.20、1.98±0.19高于FHC细胞（0.79±0.08）,差异具有统计学意义（t?= 18.110,11.163,16.991,17.317,P均?< 0.01）,FSTL1蛋白水平（1.16±0.12、1.09±0.11、0.96±0.09、0.95±0.10）高于FHC细胞（0.37±0.04）,差异有统计学意义（t?= 18.736,18.454,17.972,16.155,P均?< 0.01）;miR-?142-?3p组CRC细胞SW480凋亡率（30.23±3.10）和Bax水平（1.02±0.11）高于miR-?con?组8.96±0.89,0.45±0.05,t?= 19.785,14.152,P均< 0.01,72?h细胞增殖活力（1.16±0.11）、CyclinD1 （0.35±0.05）、Bcl-2 （0.38±0.04）、8?Gy （7.56±0.75）细胞存活率低于miR-con组（1.60±0.16,1.02±0.12,0.98±0.10,10.35±1.25,t?= 6.798,15.462,16.713,5.742,P均< 0.01）;si-FSTL1组SW480细胞72?h的细胞增殖活力（1.05±0.11）、CyclinD1（0.40±0.05）、Bcl-2（0.42±0.05）低于si-?con组（1.60±0.16,1.05±0.10,1.00±0.12,t?= 8.498,17.441,13.385,P均< 0.01）,Bax（1.00±0.11）高于si-con组（0.41±0.04,t?= 15.122,P?< 0.01）;miR-?142-3p负调控FSTL1表达,过表达FSTL1逆转了miR-142-3p过表达SW480细胞增殖、凋亡及放射敏感性的影响。 结论过表达miR-142-3p可能通过下调FSTL1表达抑制CRC细胞增殖,诱导其凋亡,并增强其放疗敏感性。     

二氢杨梅素对高糖诱导的H9C2心肌细胞损伤的影响

目的探讨二氢杨梅素（DHM）对高糖（HG）诱导的心肌细胞H9C2损伤的影响及机制。 方法细胞处理分为对照组、35 mmol/L HG组、35mmol/L HG+50 μmol/L DHM组及50 μmol/L DHM组。CCK-8法检测细胞活力,化学比色法检测丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）水平,流式细胞术检测ROS水平;荧光定量PCR法及Elisa法分别检测TNFα、IL1β、IL6 mRNA和含量,Western Blotting检测p-IκBα、IκBα蛋白及核蛋白NF-κB p65的表达水平。采用单因素方差分析进行组间比较。 结果对照组、35mmol/?L HG组、35?mmol/L HG+50?μmol/L DHM组、35?mmol/L HG+100?μmol/L DHM组的细胞活力分别是（100±0.00） ﹪、（52.23±5.69） ﹪、（74.58±6.12） ﹪和（86.04±3.76）﹪,差异具有统计学意义（F?= 40.61,P?< 0.01）。对照组、35?mmol/L HG组和35?mmol/L HG+100?μmol/L DHM组的MDA和ROS水平,SOD和CAT活性分别是（0.44±0.06）?nmol/?ml,（2.33±0.40）?nmol/?ml,（1.48±0.41）?nmol/ml、（156.0±9.00）U/ml,（325.3±10.69）U/ml,（244.0±9.54）?U/ml,（10.62± 1.59）?U/?ml,（5.18±0.34）U/ml,（7.75±0.53）U/ml,（11.31±0.98）?U/ml,（5.20±1.12）?U/?ml和（8.06±0.66）U/ml,差异具有统计学意义（F?= 30.34,29.75,14.72,P均< 0.01）。DHM预处理可明显拮抗HG对H9C2心肌细胞TNFα、IL1β和IL6 mRNA及含量的上调作用,差异存在统计学意义（P?均< 0.01）。DHM可抑制HG对H9C2心肌细胞p-IκBα/?IκBα蛋白和核蛋白NF-κB p65表达的增加作用,差异存在统计学意义（P均< 0.01）。 结论DHM可拮抗HG诱导的H9C2心肌细胞损伤,这可能与其抑制NF-κB信号通路有关。     

AngⅡ通过激活Notch1/Sox2通路对肝星状细胞LX2的活化和增殖的作用

目的探讨AngⅡ通过靶向调控Notch1/Sox2肝星状细胞LX2细胞的增殖。 方法通过CCK8检测AngⅡ对肝星状细胞增殖能力的影响,通过羟脯氨酸酸法检测AngⅡ对肝星状细胞胶原合成能力的影响,并通过脂质体转染siRNA-Notch1构建Notch1低表达细胞模型,通过CCK8检测敲低Notch1对AngⅡ诱导的肝星状细胞LX2增殖的影响,通过Western Blot检测敲低Notch1对AngⅡ诱导的肝星状细胞LX2蛋白表达的影响。所有的检测结果都进行生物学重复。采用方差分析和t检验进行统计学分析。 结果CCK8结果显示,AngⅡ（5、10、20、40、80 nmol/L）预处理A450值分别为0.67±0.06、0.88±0.07、0.98±0.07、1.08±0.07、1.23±0.07,较对照组0.57±0.05上升,差异具有统计学意义（F = 45.76,P < 0.01）,羟脯氨酸检查结果显示,AngⅡ（10、20、40 nmol/L）预处理组羟脯氨酸浓度分别为（2.60±0.20）、（3.47±0.25）、（4.17±0.21）mg/L,羟脯氨酸浓度较对照组（1.90±0.10）mg/L上升,差异具有统计学意义（F = 75.18,P < 0.01）。Western Blot结果显示,AngⅡ10、20、40 nmol/L组Notch1蛋白表达水平分别为0.20±0.02、0.54±0.04、0.82±0.03,与正常对照组0.11±0.02发生升高,差异具有统计学意义（F = 400.50,P < 0.01）。Notch1干扰后,CCK8结果显示,siRNA-Notch1+AngⅡ组（10、20、40 nmol/L）A450值分别为0.53±0.06、0.83±0.03、1.03±0.03,与siRNA-NC+ AngⅡ对照组0.97±0.06,1.43±0.06,1.73±0.06比较发生降低（P < 0.01）。进一步Western Blot结果显示,Notch1敲低组（AngⅡ+ siRNA-Notch1）Notch1、HES1和Sox2蛋白表达水平分别为1.47±0.12、0.77±0.06和0.50±0.10,分别与AngⅡ对照组2.83±0.15、2.20±0.10和1.17±0.06比较,差异具有统计学意义（P < 0.01）。 结论AngⅡ通过激活Notch1/Sox2信号促进肝星状细胞LX2增殖。     

下调血管生成素样蛋白7表达对血管紧张素Ⅱ介导的血管平滑肌细胞炎症反应的影响

目的探讨RNA干扰血管生成素样蛋白7 （Angptl7）基因对血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）诱导的血管平滑肌细胞（VSMC）炎症因子的影响及其作用机制。 方法体外培养人VSMC,分为常规F12K培养基培养（对照）和1 μg/mL AngII培养24 h。VSMC用AngⅡ（1 μg/mL）处理24 h后,采用siRNA-Angptl7和阴性对照siRNA-NC在Lipofectamine 2000介导下转染VSMC。RT-qPCR检测mRNA表达水平;Griess反应测定一氧化氮（NO）含量;蛋白免疫印记法检测相关蛋白的改变;酶联免疫吸附法检测VSMC中炎症因子肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素-1β （IL-1β）和IL-6水平。多组间比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用LSD-t检验,两组间比较采用独立样本t检验。 结果与对照比较,1 μg/mL AngⅡ处理可促进VSMC中Angptl7 mRNA （0.97±0.06比3.05±0.21）和蛋白表达（1.01±0.12比1.61±0.14）,亦可促进VSMC中IL-1β[（45.21±8.10）比（126.17±11.77） pg/mL]、IL-6[（50.50±7.51）比（108.50±9.51）pg/mL]和TNF-α的表达[（60.77±9.58）比（185.67±17.35）pg/mL],差异有统计学意义（P均< 0.01）。与对照和转染siRNA-NC相比,转染siRNA-Angptl7下调Angptl7蛋白表达（0.99±0.12,0.98±0.12比0.44±0.14,P < 0.01）。与AngⅡ干预组相比,siRNA-Angptl7降低AngⅡ介导的VSMC炎症反应相关蛋白TNF-α、IL-6和IL-1β的表达,核因子κB （NF-κB）/诱导型一氧化氮合酶（iNOS）/环氧化酶2 （COX-2）信号通路相关蛋白NF-κB、iNOS和COX-2表达及NO含量亦降低,差异有统计学意义（P均< 0.01）。与siRNA-NC相比,siRNA-Angptl7组AngⅡ诱导的VSMC炎症反应相关蛋白TNF-α （0.99±0.13比0.51±0.12）、IL-6 （1.00±0.12比0.38±0.05）和IL-1β的表达（0.99±0.14比0.48±0.11）,NF-κB （1.00±0.10比0.42±0.08）、iNOS （1.02±0.12比0.42±0.10）和COX-2表达（1.00±0.11比0.52±0.12）均降低,NO含量[（54.78±2.76）比（18.08±3.61）μmol/L]亦降低,差异有统计学意义（P均< 0.01）。 结论AngⅡ可通过Angptl7促进VSMC炎症反应,下调Angptl7蛋白表达可以抑制VSMC的炎症反应,其作用机制可能与抑制NF-κB/iNOS-COX-2信号通路有关。     

间歇式轴向压应力对组织工程骨种子细胞的黏附增殖与成骨分化促进作用的研究

目的探究间歇式轴向压应力对组织工程骨种子细胞黏附、增殖与成骨分化能力的影响。 方法构建表达绿色荧光蛋白的兔骨髓间充质干细胞（rBMSCs）作为示踪种子细胞,运用旋转细胞培养仪将松质骨支架和种子细胞共培养7 d获得组织工程骨（TEB）,实验组在第7 ~ 14天施加大小10 N、频率1 Hz、4 h/d的间歇式轴向压应力刺激,对照组常规培养,14 d后胰酶消化法获取两组种子细胞并比较其黏附、增殖和成骨分化能力。采用两组独立样本t检验进行统计学分析。 结果（1）流式细胞术显示rBMSCs被成功提取分离。（2）倒置荧光显微镜及扫描电镜显示TEB中种子细胞与支架相容性良好。（3）活体荧光成像系统及扫描电镜显示应力刺激组种子细胞的生长状况要优于非应力刺激组,前者平均荧光密度及细胞数/500倍视野均大于后者,差异均具有统计学意义（平均荧光密度：（3.75±0.34）×10⁸ vs （2.91±0.22）×10⁸,t = 2.90,P = 0.04;细胞数/500倍视野：30.50±4.43 vs 21.00±5.13,t = 3.14,P = 0.01）。（4）细胞黏附实验显示,应力刺激组种子细胞的75%细胞贴壁时间短于非应力刺激组,两组时间分别为（3.00±0.41）h、（13.33±1.70）h,差异具有统计学意义（t = 8.20,P < 0.01）,前者的最终细胞贴壁率高于后者（99.97%±0.34% vs 85.83%±1.18%）,差异具有统计学意义（t = 11.31,P < 0.01）。（5）CCK-8检测显示,在培养第48 ~ 96 h,应力刺激组种子细胞的增殖能力优于非应力刺激组,将两者的450 nm吸光度值在第48小时（0.49±0.02、0.40±0.02）、72 h（0.76±0.07、0.64±0.04）和96 h（1.58±0.07、1.34±0.13）分别进行比较,差异均具有统计学意义（t = 5.15、2.57、2.86,P均< 0.01）。（6）在成骨诱导14 d后,应力刺激组种子细胞的ALP和Ca结节染色阳性率要强于非应力刺激组：两组ALP染色阳性率分别为26.73%±4.56%、16.68% ± 3.89%,差异具有统计学意义（t =3.33,P = 0.03）;两组Ca结节染色阳性率分别为41.81%±3.56%、27.40% ± 2.35%,差异具有统计学意义（t = 3.68,P = 0.02）。 结论间歇性轴向压应力可促进组织工程骨种子细胞的黏附、增殖与成骨分化。     

miR-363-3p靶向 TWIST1调控上皮间质转化抑制非小细胞肺癌A549细胞迁移和侵袭

目的探讨miR-363-3p靶向TWIST1调控非小细胞肺癌A549细胞迁移和侵袭的分子机制。 方法将体外培养的A549细胞分为空白对照组（细胞未做任何处理）;模拟物对照组（转染miR-363-3p模拟物阴性对照）;模拟物组（转染miR-363-3p模拟物）;后期实验另设：模拟物+ pcDNA组（转染miR-363-3p模拟物和pcDNA3.1空载体质粒）;模拟物+ TWIST1组（转染miR-363-3p模拟物和pcDNA3.1-TWIST1过表达质粒）。采用RT-PCR检测细胞中miR-363-3p的表达,Western blot检测细胞中TWIST1蛋白和上皮间质转化（EMT）相关蛋白Vimentin、E-cadherin的表达,Transwell小室实验检测细胞的迁移和侵袭。双荧光素酶报告基因实验检测miR-363-3p和TWIST1的靶向关系。两组间比较采用独立样本t检验,多组间比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用LSD-t检验。 结果与空白对照组和模拟物对照组比较,模拟物组A549细胞中miR-363-3p表达水平（1.00±0.08、0.97±0.05比3.82±0.45）升高,TWIST1 mRNA （1.00±0.06、0.98±0.06比0.39±0.02）和蛋白的表达水平（0.81±0.05、0.78±0.06比0.42±0.02）降低,差异具有统计学意义（P均< 0.05）。与空白对照组和模拟物对照组比较,模拟物组A549细胞Vimentin蛋白表达水平（0.58±0.04、0.55±0.05比0.36±0.03）降低,E-cadherin蛋白的表达水平（0.22±0.02、0.25±0.03比0.47±0.03）增高,迁移细胞数（85.75±5.45、83.52±6.85比53.05±4.50）和侵袭细胞数（128.26±6.15、125.95±8.05比71.64±5.75）降低,差异有统计学意义（P均< 0.05）。与模拟物对照组比较,模拟物组细胞中Vimentin蛋白的表达水平（0.55±0.05比0.36±0.03）降低,而E-cadherin蛋白表达水平（0.25±0.03比0.47±0.03）升高,迁移细胞数（83.52±6.85比53.05±4.50）和侵袭细胞数（125.95±8.05比71.64±5.75）均减少（P均< 0.05）。TWIST1是miR-363-3p潜在的靶基因。与模拟物+ pcDNA3.1组比较,模拟物+ TWIST1组A549细胞中Vimentin蛋白的表达水平（0.32±0.02比0.42±0.03）升高,而E-cadherin蛋白表达水平（0.56±0.04比0.38±0.03）降低,A549细胞的迁移数（49.45±4.22比67.52±5.05）和侵袭数（72.45±5.73比108.35±6.56）增加（P均< 0.05）。 结论miR-363-3p可通过靶向TWIST1调控EMT抑制A549细胞迁移和侵袭。     

柚皮苷对高糖作用下MC3T3-E1细胞活力和Akt通路相关因子表达的影响

目的探讨柚皮苷（NG）对高糖环境下MC3T3-E1细胞活力的影响及可能的分子机制。 方法体外培养小鼠MC3T3-E1细胞，实验分5组：对照组（正常无血清培养基）、高糖组（含25 mmol/L葡萄糖）、0.1 μmol/L +高糖组（0.1 μmol/L NG + 25 mmol/L葡萄糖）、1 μmol/L +高糖组（1 μmol/L NG+25 mmol/L葡萄糖）、10 μmol/L +高糖组（10 μmol/L NG+25 mmol/L葡萄糖）。药物干预后，采用CCK-8法检测细胞活力；实时荧光定量PCR（qPCR）法检测细胞成骨特异性转录因子（Runx2）、胰岛素样生长因子-1（IGF-1）、蛋白激酶（Akt1）mRNA的表达；蛋白质印迹法（Western blot）检测细胞碱性磷酸酶（ALP）、Akt1、IGF-1蛋白的表达。多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。 结果CCK8检测结果显示，与对照组比较，高糖组细胞OD值（12 h：0.90±0.01比0.80±0.01，24 h：1.00±0.05比0.84±0.01，48 h：1.09±0.03比0.90±0.01）均降低，差异有统计学意义（P < 0.01）；与高糖组比较，0.1 μmol/L+高糖组细胞OD值（24 h：0.84±0.01比0.93±0.05，48 h：0.90±0.01比0.99±0.01）、1 μmol/L +高糖组和10 μmol/L+高糖组OD值（12 h：0.80±0.01比0.92±0.01、1.01±0.32，24 h：0.84±0.01比1.01±0.04、1.16±0.03，48 h：0.90±0.01比1.12±0.02、1.20±0.02）均升高，差异有统计学意义（P < 0.05）。与对照组比较，高糖组细胞Runx2、IGF-1、Akt1的mRNA的表达水平（24 h：1.00比0.34±0.02、1.00比0.34±0.01、1.00比0.15±0.02）、（48 h：1.00比0.72±0.03、1.00比1.09±0.07、1.00比0.38±0.04）降低，差异有统计学意义（P < 0.01）。与高糖组比较，1 μmol/L +高糖组和10 μmol/L+高糖组细胞Runx2、IGF-1、Akt1的mRNA表达水平（24 h：0.34±0.02比0.62±0.09、0.64±0.05，0.34±0.01比0.77±0.03、1.02±0.07，0.15±0.02比0.24±0.08、0.4±0.09）、（48 h：0.72±0.03比1.27±0.02、1.37±0.02，1.09±0.07比2.44±0.19、2.73±0.04，0.38±0.04比0.86±0.06、1.43±0.03）均升高，差异有统计学意义（P < 0.05）。与对照组比较，高糖组细胞ALP、Akt1、IGF-1蛋白表达水平（48 h：1.00比0.72±0.02、1.00比0.89±0.03、1.00比0.09±0.01）均降低，差异有统计学意义（P < 0.05）；与高糖组比较，0.1 μmol/L+高糖组、1 μmol/L+高糖组和10 μmol/L+高糖组ALP、Akt1、IGF-1蛋白表达水平（48 h：0.72±0.02比1.92±0.02、2.30±0.30、3.09±0.10，0.89±0.03比1.50 ± 0.03、1.43±0.04、1.40±0.13，0.09±0.01比1.75±0.01、2.30±0.31、2.07±0.07）均升高，差异有统计学意义（P < 0.05）。 结论NG逆转高糖诱导的MC3T3-E1细胞活力减退；同时改善高糖的抑制作用，促进MC3T3-E1细胞IGF-1、AKt-1、Runx2 mRNA和IGF-1、AKt-1、ALP蛋白的表达。     

miR-98-5p靶向PYGO2基因对宫颈癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响及其作用机制研究

目的探讨miR-98-5p对宫颈癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响以及其作用机制。 方法选取2016年1月至2019年1月郴州市第一人民医院收治的宫颈癌患者的癌组织和癌旁组织;予以miR-98-5p、si-PYGO2及anti-miR-98-5p单独或共培养Siha细胞,记为：miR-NC组、miR-98-5p组、si-NC组、si-PYGO2组、anti-miR-NC组、anti-miR-98-5p组、miR-98-5p+pcDNA组、miR-98-5p+pcDNA-PYGO2组。运用qRT-PCR检测宫颈癌组织和细胞中miR-98-5p和PYGO2 mRNA的表达水平;Western blot检测蛋白表达;MTT法检测细胞增殖活性;Transwell检测细胞迁移和侵袭;将WT-PYGO2、MUT-PYGO2分别与miR-NC、miR-98-5p共转染至Siha细胞中,双荧光素酶报告基因检测实验检测荧光活性。采用方差分析和t检验进行统计学分析。 结果与癌旁组织相比,宫颈癌组织中miR-98-5p表达水平降低（0.98±0.08比0.47±0.05）,PYGO2 mRNA （1.00±0.07比2.43±0.24）和蛋白表达水平（0.27±0.03比0.62±0.05）均升高（P均< 0.001）。与正常宫颈细胞Ect1/E6E7相比,宫颈癌细胞Siha、Hela、Caski中PYGO2 mRNA （0.98±0.09比2.76±0.23、2.46±0.24、2.55±0.21）和蛋白表达水平（0.21±0.03比0.62±0.06、0.51±0.05、0.57±0.06）升高;miR-98-5p的表达水平降低（1.00±0.08比0.34±0.04、0.56±0.05、0.46±0.04） （P均< 0.05）。与miR-NC组相比,miR-98-5p组宫颈癌Siha细胞活性（48 h：0.61±0.05比0.42±0.04,72 h：1.02±0.09比0.59±0.06）、迁移数量[ （112.46±10.27）个比（48.35±4.96）个]及侵袭数量[ （92.47±9.56）个比（39.46±3.52）个]均降低（P均< 0.05）。与si-NC组相比,si-PYGO2组宫颈癌Siha细胞活性（48 h：0.64±0.06比0.46±0.05,72 h：1.05±0.08比0.67±0.06）、Siha迁移数量[ （106.48±9.75）个比（42.16±4.25）个]和侵袭数量[ （87.63±8.11）个比（35.42±6.20）个]均降低（P均< 0.05）;Cyclin D1、MMP-2、MMP-9、MMP-14表达水平降低,p21、p27表达水平升高,差异有统计学意义（P均< 0.05）。与miR-NC组比较,miR-98-5p组转染WT-PYGO2的Siha细胞荧光素酶活性（0.38±0.04比0.99±0.08）降低（P < 0.05）,转染MUT-PYGO2的Siha细胞荧光素酶活性（1.03±0.08比1.01±0.09）差异无统计学意义（P > 0.05）。PYGO2过表达逆转了miR-98-5p过表达对宫颈癌Siha细胞的增殖、迁移和侵袭的抑制作用。 结论miR-98-5p可抑制宫颈癌细胞增殖、迁移和侵袭,其机制可能与其靶向调控PYGO2的表达有关,将可为宫颈癌的预防和治疗提供新靶点。     

HOXA-AS2靶向miR-17对人脐静脉内皮细胞生物学功能以及炎症因子的影响

目的探讨HOXA-AS2对动脉粥样硬化（AS）模型细胞生物学功能以及炎症因子的影响及分子机制。 方法本实验共分为4个实验;实验1：用100 μg/mL的ox-LDL处理EA.hy926细胞作为ox-LDL组,正常培养的细胞作为对照组;实验2：将pcDNA3.1、pcDNA3.1-HOXA-AS2转染至EA.hy926细胞中再用100 μg/mL的ox-LDL处理,记为ox-LDL+pcDNA3.1组、ox-LDL+pcDNA3.1-HOXA-AS2组;实验3：将pcDNA3.1、pcDNA3.1-HOXA-AS2、si-NC、si-HOXA-AS2分别转染至EA.hy926细胞中,记为pcDNA3.1组、pcDNA3.1-HOXA-AS2组、si-NC组、si-HOXA-AS2组;实验4：将pcDNA3.1-HOXA-AS2与miR-NC、miR-17分别共转染至EA.hy926细胞中再用100 μg/mL的ox-LDL处理,记为ox-LDL+pcDNA3.1-HOXA-AS2+miR-NC组、ox-LDL+pcDNA3.1-HOXA-AS2+miR-17组。实时荧光定量PCR （RT-qPCR）检测HOXA-AS2和miR-17的表达水平;蛋白质印迹（Western blot）法检测细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1A （P21）、cleaved caspase 3蛋白表达;MTT检测细胞增殖情况;流式细胞术检测细胞凋亡;ELISA法检测白细胞介素-1 （IL-1）、白细胞介素-6 （IL-6）水平;荧光素酶报告实验检测HOXA-AS2和miR-17的靶向关系。两组间比较采用独立样本t检验,多组间比较采用方差分析,组间两两比较采用LSD-t检验。 结果与对照组比较,ox-LDL组EA.hy926细胞中HOXA-AS2表达水平（0.23±0.02比1.02±0.10）,细胞增殖率[（47.83±5.01）﹪比（100.06±10.20）﹪]均降低,细胞凋亡率[（26.81±2.47）﹪比（8.23±0.80）﹪]、P21 （0.82±0.08比0.20±0.02）、cleaved caspase 3 （0.67±0.06比0.14±0.01）、IL-1[（792.34±59.37）ng/L比（326.14±34.59） ng/ L]和IL-6表达水平[（53.67±4.65）ng/L比（19.25±2.11）ng/L]均升高,差异具有统计学意义（P均< 0.05）。与ox-LDL+pcDNA3.1组比较,ox-LDL+pcDNA3.1-HOXA-AS2组EA.hy926细胞中HOXA-AS2表达水平（0.87±0.09比0.22±0.02）、细胞增殖率[（89.94±8.34）﹪比（48.21±4.86）﹪]均升高,细胞凋亡率[（12.33±1.18）﹪比（26.83±2.48）﹪]、P21 （0.33±0.03比0.81±0.08）、cleaved caspase 3 （0.24±0.02比0.69±0.06）、IL-1[ （446.25±46.84）ng/L比（802.21±60.18）ng/L]和IL-6表达水平[（25.64±2.65）ng/L比（55.21±5.10）ng/L]均降低,差异具有统计学意义（P均< 0.001）。与ox-LDL+pcDNA3.1-HOXA-AS2+miR-NC组比较,ox-LDL+pcDNA3.1-HOXA-AS2+miR-17组EA.hy926细胞中miR-17表达水平（2.14±0.21比1.05±0.10）、细胞凋亡率[（23.31±2.33）﹪比（13.75±1.44）﹪]、IL-1水平[（684.26±62.38）ng/L比（451.21±43.58）ng/L]、IL-6水平[（41.29±4.37）ng/L比（26.11±2.39）ng/L]均升高,细胞增殖率[（53.67±5.46）﹪比（90.21±9.16）﹪]降低,差异具有统计学意义（P均< 0.001）。HOXA-AS2与miR-17存在结合位点,荧光素酶报告实验显示,与miR-NC组比较,miR-17组中转染WT-HOXA-AS2的EA.hy926细胞荧光素酶活性降低（0.33±0.03比1.01±0.10,P < 0.05）,而转染MUT-HOXA-AS2的EA.hy926细胞荧光素酶活性差异无统计学意义（P > 0.05）;与anti-miR-NC组比较,anti-miR-17组中转染WT-HOXA-AS2的EA.hy926细胞荧光素酶活性升高（2.29±0.21比1.00±0.10,P < 0.05）,而转染MUT-HOXA-AS2的EA.hy926细胞荧光素酶活性差异无统计学意义（P > 0.05）。 结论过表达HOXA-AS2促进细胞增殖,抑制ox-LDL引起的细胞凋亡和炎症因子的释放,其机制可能与miR-17有关。     

艾拉莫德增强丝裂霉素C诱导的人食管癌Eca109细胞凋亡

目的探讨艾拉莫德增强丝裂霉素C（MMC）诱导的人食管癌Eca109细胞凋亡的作用及其机制。 方法将人食管癌Eca109细胞分为五组：对照组、MMC组、25,50,100 μg/ml浓度艾拉莫德+MMC组;通过CCK-8和DCFH-DA染色法分别检测25,50,100 μg/ml浓度艾拉莫德联合MMC对人食管癌Eca109细胞活力和细胞活性氧（ROS）生成的影响,流式细胞术检测艾拉莫德联合MMC对人食管癌Eca109细胞凋亡的影响,并通过Western Blot检测艾拉莫德联合MMC对TNF-α和cleaved caspase3蛋白表达的影响。采用单因素方差分析和t检验进行统计学分析。 结果CCK-8结果显示,与0 μg/ml T-614+MMC组A450值（0.85±0.03）比较,25、50、100 μg/ml T-614+MMC组A450值（0.73±0.02,0.52±0.02,0.33±0.02）均降低,差异具有统计学意义（F = 127.60, P < 0.01）;DCFH-DA染色检测结果显示,与0 μg/ml T-614+MMC组DCFH荧光值（130.00±10.00）比较,25、50、100 μg/ml T-614+MMC组DCFH值（219.67±9.50,280.33±10.50,338.33±16.07）均升高,差异具有统计学意义（F = 170.20,P < 0.01）;流式细胞术检测结果显示,与对照组的细胞凋亡率（5.33±0.35）﹪比较,T-614和MMC组的凋亡率（20.30±2.00）﹪,（25.60±3.00）﹪均升高。与MMC组细胞凋亡率（25.60±3.00）﹪比较,艾拉莫德与MMC联用组（T-614+MMC）食管癌Eca109细胞的细胞凋亡率（56.20±3.00）﹪升高,差异均具有统计学意义（F = 247.50,P < 0.01）;Western Blot结果显示,与MMC组细胞TNF-α和cleaved caspase3蛋白表达（0.87±0.06,0.25±0.03）比较,艾拉莫德与MMC联用组（T-614+MMC）食管癌Eca109细胞的TNF-α和cleaved caspase3蛋白表达（1.28±0.08,0.59±0.03）升高,差异均具有统计学意义（F = 96.90,P < 0.01）。 结论艾拉莫德能够增强MMC对食管癌Eca109细胞活力的抑制作用,其机制可能通过促进ROS的生成,激活线粒体凋亡通路,最终导致食管癌Eca109细胞凋亡。     

替米沙坦调控miR-495-3p/心肌细胞增强因子2A通路减轻缺氧诱导的神经细胞PC12损伤

目的探讨替米沙坦（TM）调控miR-495-3p/心肌细胞增强因子2A （MEF2A）通路对缺氧诱导PC12细胞损伤的影响和机制。 方法将PC12细胞进行正常培养（对照）,缺氧（缺氧24 h）,缺氧+ 0.1、1、10 μg/mL TM、缺氧+ miR-NC （转染miR-NC）,缺氧+miR-495-3p （转染miR-495-3p模拟物）,缺氧+TM+anti-miR-NC （转染anti-miR-NC,10 μg/mL TM）和缺氧+ TM+anti-miR-495-3p （转染anti-miR-495-3p,10 μg/mL TM）处理。酶联免疫吸附实验（ELISA）检测乳酸脱氢酶（LDH）漏出量和超氧化物歧化酶（SOD）的活性,流式细胞术检测细胞凋亡,实时荧光定量PCR （RT-qPCR）和Western blot检测miR-495-3p、心肌细胞增强因子2A （MEF2A）表达水平。两组间比较采用t检验,多组间比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用LSD-t检验。 结果与对照比较,缺氧处理的PC12细胞LDH漏出率[（9.46±0.97）﹪比（45.69±4.31）﹪]、细胞凋亡率[（5.36±0.54）﹪比（28.36±2.41）﹪]、MEF2A mRNA（1.00±0.08比2.74±0.26）和MEF2A蛋白表达水平（0.39±0.03比0.87±0.06）均升高;SOD活性[（12.24 ±1.13）比（5.13±0.52 ）U/mL）]和miR-495-3p表达水平（1.00±0.08比0.35±0.03）均降低,差异有统计学意义（P均< 0.05）。与缺氧处理比较,缺氧+0.1、1、10 μg/mL TM干预的PC12细胞LDH漏出率[（45.69±4.31）﹪比（32.14±3.84）﹪、（23.54±3.17）﹪、（16.87±1.46）﹪]、细胞凋亡率[（28.36±2.41）﹪比（22.46±2.31）﹪、（17.14±1.65）﹪、（10.23±1.12）﹪]、MEF2A mRNA（2.74±0.26比2.26±0.23、1.87±0.19、1.34±0.18）和MEF2A蛋白表达水平（0.87±0.06比0.75±0.05、0.63±0.04、0.46±0.03）均降低;SOD活性[（5.13±0.52）比（6.87±0.69 ）、（8.01±0.81）、（10.12±1.02）U/mL]、miR-495-3p表达水平（0.35±0.03比0.49±0.04、0.61±0.06、0.83±0.07）均升高,差异有统计学意义（P均< 0.05）。与缺氧+ miR-NC比较,缺氧+ miR-495-3p的PC12细胞LDH漏出率[（46.87±4.28）﹪比（19.65±1.87）﹪]和细胞凋亡率[（28.38±2.44）﹪比（12.36±1.25）﹪]均降低,SOD活性[（5.15±0.51）比（9.67±0.97）U/mL]升高,差异有统计学意义（P均< 0.05）。与缺氧+TM+anti-miR-NC比较,缺氧+TM+anti-miR-495-3p的PC12细胞LDH漏出率[（17.64±1.79）﹪比（32.69±3.57）﹪]和细胞凋亡率[（10.98±1.75）﹪比（22.64±2.13）﹪]均升高,SOD活性[（12.63±1.27）比（7.32±0.71）U/mL]降低,差异有统计学意义（P均< 0.05）。 结论TM通过上调miR-495-3p/MEF2A通路对缺氧诱导的PC12细胞损伤具有保护作用。     

MSCs线粒体转移对脑缺血后损伤修复的作用研究

目的探索骨髓基质细胞（MSCs）中线粒体转移在脑缺血后的损伤保护作用。 方?法采用小鼠骨髓MSCs分离与原代培养方法,培养MSCs并通过流式细胞仪进行鉴定;取出生后第0天（P0）SD幼鼠的皮层,进行原代神经元培养,并进行氧糖剥夺（OGD）处理,将含有线粒体的MSCs培养基（MCM）组和不含有线粒体的MSCs培养基（mdMCM）组与OGD神经元进行共培养,另以未经过OGD处理的神经元（Neuron组）和经过OGD处理的神经元（OGD组）作为对照;通过MitoTracker追踪线粒体,分析线粒体从MSCs向OGD神经元的转移情况;通过检测试剂盒对神经元内ATP含量和神经元活性进行分析;通过对线粒体膜电势检测,分析线粒体的功能;采用Western Blot分析线粒体Miro1蛋白的表达水平;通过MCAO造模和计算梗死体积,分析MSCs移植对脑缺血的保护作用。采用方差分析和t检验进行统计学分析。 结?果原代培养的骨髓MSCs纯度达到99﹪以上。取原代培养MSCs的培养基分别去除线粒体（mdMCM）与不去除线粒体（MCM）,与OGD神经元共培养,在MCM组,观察到神经元中存在MSCs来源的线粒体;经过OGD处理的神经元,其胞内ATP水平降低至0.634±0.023,给予MCM处理后,神经元胞内ATP水平上升至1.623±0.039,当给予mdMCM处理后,神经元胞内ATP水平降低至0.645±0.011,ATP比率变化的差异具有统计学意义（F?= 3413.62,P?< 0.01）;经过OGD处理,神经元活性降低至（73.7±1.12）﹪;给予MCM处理后,神经元活升高到（83.3±1.57）﹪,当给予mdMCM处理后,神经元活性降低至（72.9±1.25）﹪,与MCM组相比差异具有统计学意义（F?= 654.280,P?< 0.01）。在未经过处理的对照组中,线粒体膜电势丢失1.7﹪;经过OGD处理后,膜电势丢失70.3﹪;添加MCM后的OGD神经元,线粒体膜电势丢失44.7﹪,与OGD组相比,差异具有统计学意义（P?= 0.036）;而添加mdMCM的OGD处理神经元,线粒体膜电势丢失67.7﹪,与OGD+MCM组相比,差异具有统计学意义（P?= 0.041）。给予CCCP处理后的阳性对照神经元,膜电势丢失为99.3﹪。在Miro1表达干预中,空白对照组神经元胞内的ATP平均水平记为1,神经元活性为100﹪,计算其余各组相对空白对照组的ATP水平和神经元活性。在Miro1高表达组,胞内ATP水平为2.304,与对照质粒组（ratio = 1.611）相比,差异具有统计学意义（P?= 0.034）;神经元活性检测中,Miro1高表达组相比对照质粒组（90.4﹪vs 81.7﹪）,差异具有统计学意义（P?= 0.040）。在MCAO手术后,小鼠的脑梗死体积达到38.4﹪,而给予MSCs后的小鼠,梗死面积降低到14.4﹪,差异具有统计学意义（P?= 0.004）。 结论MSCs来源的线粒体可以向损伤神经元转移,提升神经元胞内ATP水平和神经元活性,降低缺血损伤中小鼠的脑梗死体积。线粒体Miro1蛋白参与了线粒体向神经元转移保护过程。     

Involvement of kinase PKC-zeta in the p62/p62P392L-driven activation of NF-κB in human osteoclasts

Mutations of the gene encoding sequestosome1 (SQSTM1/p62), clustering in or near the UBA domain, have been described in Paget's disease of bone (PDB); among these the P392L substitution is the most prevalent. Protein p62 mediates several cell functions, including the control of NF-κB signaling, and autophagy. This scaffolding protein interacts with atypical PKCζ in the RANKL-induced signaling complex. We have previously shown that osteoclasts (OCs) overexpressing the p62^P392L variant were in a constitutively activated state, presenting activated kinase p-PKCζ/λ and activated NF-κB prior to RANKL stimulation. In the present study, we investigated the relationships between PKCζ and NF-κB activation in human OCs transfected with p62 variants. We showed that PKCζ and p-PKCζ/λ co-localize with p62, and that PKCζ is involved in the RANKL-induced NF-κB activation and in the RANKL-independent activation of NF-κB observed in p62^P392L-transfected cells. We also observed a basal and RANKL-induced increase in IκBα levels in the presence of the p62^P392L mutation that contrasted with the NF-κB activation. In this study we propose that PKCζ plays a role in the activation of NF-κB by acting as a p65 (RelA) kinase at Ser⁵³⁶, independently of IκBα; this alternative pathway could be used preferentially in the presence of the p62^P392L mutation, which may hinder the ubiquitin–proteasome pathway. Overall, our results highlight the importance of p62-associated PKCζ in the overactive state of pagetic OCs and in the activation of NF-κB, particularly in the presence of the p62^P392L mutation.     

Protein kinase C-δ negatively regulates T cell receptor-induced NF-κB activation by inhibiting the assembly of CARMA1 signalosome

T-cell receptor (TCR)-induced T-cell activation is a critical event in adaptive immune responses. The engagement of TCR complex by antigen along with the activation of the costimulatory receptors trigger a cascade of intracellular signaling, in which caspase recruitment domain-containing membrane-associated guanylate kinase 1 (CARMA1) is a crucial scaffold protein. Upon stimulation, CARMA1 recruits downstream molecules including B-cell CLL/lymphoma 10 (Bcl10), mucosa-associated lymphoid tissue lymphoma translocation gene 1 (MALT1), and TRAF6 to assemble a specific TCR-induced signalosome that triggers NF-κB and JNK activation. In this report, we identified protein kinase Cδ (PKCδ) as a CARMA1-associated protein by a biochemical affinity purification approach. PKCδ interacted with CARMA1 in TCR stimulation-dependent manner in Jurkat T cells. Overexpression of PKCδ inhibited CARMA1-mediated NF-κB activation, whereas knockdown of PKCδ potentiated TCR-triggered NF-κB activation and IL-2 secretion in Jurkat T cells. Reconstitution experiments with PKCδ kinase-dead mutant indicated that the kinase activity of PKCδ was dispensable for its ability to inhibit TCR-triggered NF-κB activation. Furthermore, we found that PKCδ inhibited the interaction between MALT1 and TRAF6, but not the association of CARMA1 with PKCθ, Bcl10, or MALT1. These observations suggest that PKCδ is a negative regulator in T cell activation through inhibiting the assembly of CARMA1 signalosome.