枸杞Lb14-3-3b基因的表达分析及转烟草研究

在宁夏枸杞(Lycium barbarum L.)品种宁杞1号花药发育差异蛋白质组学研究的基础上,克隆了一个花药发育相关基因Lb14-3-3b,证实该基因在花器官中优势表达。本试验进一步利用荧光定量PCR技术分析枸杞Lb14-3-3b基因在花药发育过程中不同时期的表达特征,并通过构建植物过表达载体Lb14-3-3b-pCambia1305. 1-35s,经根瘤农杆菌介导法转化模式植物烟草,探究该基因在植物生长发育中的功能。结果表明,在枸杞花药发育的各个时期,Lb14-3-3b都有表达,在花药二核花粉时期表达量最高。与野生型烟草相比,转Lb14-3-3b基因烟草生长发育迟缓,植株矮小,花器官畸变,花瓣缺少致使花型趋于四角化,雄蕊及花丝数目缺少且发育异常。推测枸杞Lb14-3-3b基因在烟草生长发育及花器官发育中起调控作用,研究结果为进一步探讨该基因在枸杞生长发育中的调控作用提供参考依据。     

枸杞脂肪酰基还原酶基因的克隆及表达分析

脂肪酰基还原酶基因广泛参与植物的脂类代谢过程,影响植物雄配子体花药发育以及表皮蜡酯合成等。本研究利用RACE方法从宁夏枸杞(宁杞1号)花药中克隆脂肪酰基还原酶LbMS2-2基因,开放阅读框全长1800bp,编码599个氨基酸,等电点为9.00。生物信息学分析表明,LbMS2-2蛋白定位于叶绿体中,该蛋白序列与茄科植物甜辣椒、烟草和马铃薯中的脂肪酰基还原酶表现出较高的序列相似性;实时荧光定量PCR显示,LbMS2-2基因在枸杞花器官中表达,且在枸杞花药发育的四分体时期、单核花粉时期和双核花粉时期表达量较高。原位杂交结果证实该基因只在花药绒毡层和小孢子中表达。亚细胞定位结果进一步验证LbMS2-2基因的叶绿体定位。以上结果表明,枸杞脂肪酰基还原酶基因是枸杞花器官发育过程中的重要基因。     

枸杞WRKY_3基因克隆及组织表达分析

以枸杞为材料,采用PCR及RACE方法,克隆了枸杞WRKY转录因子基因cDNA序列,命名为Lb WRKY3,GenBank登录号为KX196192。在生物信息学分析的基础上,进行亚细胞定位、基因表达分析。结果显示:(1)Lb WRKY3开放阅读框ORF长度为1 068bp,编码356个氨基酸。(2)生物信息学分析显示,Lb WRKY3编码蛋白具有一个WRKY结构域,二级结构中不规则卷曲结构所占比例最大(58.67%),延伸链结构次之(18.88%),α螺旋比例为15.82%,β转角最少,仅为6.63%;Lb WRKY3蛋白与案头菊WRKY蛋白、黄花蒿WRKY蛋白相似性较高。(3)亚细胞定位显示,Lb WRKY3蛋白定位于细胞核。(4)实时定量PCR分析表明,Lb WRKY3在根中表达量最高,在花中表达量最低;在枸杞果实发育过程中Lb WRKY3均有表达,表达量随果实成熟逐渐升高,并于35d达到峰值;Lb WRKY3基因在果实中的表达具有组织特异性表达特性(果肉果皮种子)。研究表明,Lb WRKY3基因参与了枸杞果实生长发育调控。     

枸杞花药发育基因LbMS2的克隆及表达分析

MS2(Male sterily2)类基因编码脂肪酰基还原酶,参与了花药绒毡层中脂类代谢过程。该研究以宁夏枸杞(‘宁杞1号’)为试验材料,采用RACE方法从枸杞花药cDNA中获得枸杞LbMS2基因。结果显示,LbMS2基因开放阅读框为1 782bp,编码593个氨基酸,等电点为8.98;生物信息学分析显示,LbMS2蛋白定位于叶绿体;LbMS2蛋白序列与茄科植物矮牵牛、茸毛烟草、马铃薯、番茄以及甜辣椒中的MS2蛋白表现出较高的序列相似性;实时荧光定量PCR结果显示,LbMS2基因具有器官表达特异性,只在枸杞花器官中表达,并且在枸杞花药发育的四分体时期以及单核花粉时期表达量最高。研究表明,LbMS2基因是枸杞花器官发育过程中的重要基因。     

ANAC092参与调控花药发育的功能初探

NAC家族转录因子是高等植物特有的一类转录因子, 功能广泛, 这类蛋白在植物次生生长、细胞分裂、植物衰老、尤其在激素和信号途径起关键调控作用。ANAC092已报道参与侧根发育, 并与衰老相关。为研究ANAC092基因在花药发育过程中的功能, 文章构建了拟南芥ANAC092启动子的GUS载体, 结合原位杂交分析结果表明, ANAC092在花药发育过程中时序性表达, 在花药发育的8~11期绒毡层表达, 其中在9~10期的表达量达到最高值, 与AMS(Aborted microspores)的表达时期有重合。构建ANAC092过表达体系, 筛选出转基因纯合株系。与野生型相比, 过表达ANAC092转基因植株中花粉数量减少, 花粉粒的长度增加。qRT-PCR结果表明, 过表达株系中与花粉发育相关的基因SPL、EMS1、DYT1、AMS的表达量上调。结合生物信息学分析表明, ANAC092启动子序列中有7个AMS的结合位点, 因此推测ANAC092可能位于AMS的下游而参与花药发育过程。     

马铃薯块茎特异性启动子驱动的人白细胞介素-12的遗传转化研究

为获得高效表达人白细胞介素-12(h IL-12)蛋白的转基因马铃薯植株,利用根瘤农杆菌侵染法将前期构建的马铃薯块茎特异性启动子Ppatatin驱动的h IL-12植物表达载体导入马铃薯,通过共培养、筛选、分化等过程获得转基因植株,并结合PCR、RT-PCR、GUS染色及ELISA分析对转基因植株进行鉴定。结果显示,获得12个马铃薯转基因株系,PCR检测表明其中的10个株系目的基因已导入马铃薯基因组,转基因阳性率为83%;RT-PCR分析表明其中的7个株系外源基因在转录水平成功获得表达,ELISA分析表明其中的5个株系有明显的蛋白水平表达。对这7个株系后代的检测表明外源基因成功表达且具有良好的遗传稳定性。     

拟南芥CYCD2;1基因植物表达载体的构建及在烟草中的遗传转化分析

细胞分裂是生物的基本特征之一,在植物生长发育的过程中,发挥着极其重要的作用,细胞周期蛋白CYCD2;1基因作为一个调控因子,对调节细胞周期具有重要作用。本文以拟南芥细胞周期蛋白(At CYCD2;1基因)作为研究对象,利用PCR技术从拟南芥花序c DNA扩增出At CYCD2;1基因,构建植物表达载体(pROKIIAt CYCD2;1)并利用农杆菌介导的叶盘法转化野生型烟草。转基因植株的PCR检测结果表明,At CYCD2;1基因已经整合到了烟草基因组中。在T2代植株中,通过实时定量荧光PCR检测显示,At CYCD2;1在mRNA水平也均有表达。过量表达CYCD2;1的转基因烟草在花器官中存在明显表型,与野生型相比主要表现为转基因植株花冠宽度变大,花瓣和萼片长度变长,果实变大,上述结果表明At CYCD2;1基因影响花的发育。     

复合调控Wx与SBE3基因对水稻籽粒直链淀粉含量的影响

颗粒淀粉合成酶（GBSS）和淀粉分支酶3（SBE3）是淀粉合成过程中的两个关键酶,这两个酶主要由耽和SBE3两个基因分别控制,它们的表达量直接影响直链淀粉和支链淀粉的含量比例。为了探讨水稻淀粉关键酶基因耽过量与SBE3干涉复合表达对直链淀粉含量的影响,构建了Wx过量表达与SBE3干涉结合的多基因表达载体,并通过农杆菌介导的方法将其导入日本晴水稻中。经过PCR检测分析获得了65株转基因阳性植株,半定量RT—PCR检测表明转基因株系中Wx基因表达量明显增加,而SBE3基因表达量显著减少。转基因株系籽粒透明度明显降低,直链淀粉含量比野生型的平均高45％,但是千粒重变化不大,与野生型相当。遗传分析表明这些转基因株系多数可稳定遗传。     

水稻受盐抑制基因OsZFP1的转基因分析

OsZFP1(水稻锌指蛋白1)基因编码的蛋白含有3个推测的Cys2/Cys2-型锌指结构域,它的表达受盐胁迫负调控。构建了以35S为启动子的OsZFP1基因的植物表达载体,并将其转入拟南芥(ArabidopsisthalianaL.)植物和水稻(OryzasativaL.)愈伤组织中以过量表达OsZFP1基因。转基因的拟南芥植株和水稻愈伤组织对盐处理的敏感性都比野生型要高。这一结果表明OsZFP1基因可能编码一种负调控蛋白,它可能抑制某些盐诱导基因的表达。在ABA处理下,转基因拟南芥植株比野生型植株抽苔晚,说明OsZFP1基因的作用可能受ABA调节。     

水稻受盐抑制基因OsZFP1的转基因分析

OsZFP1(水稻锌指蛋白1)基因编码的蛋白含有3个推测的Cys2/Cys2-型锌指结构域,它的表达受盐胁迫负调控.构建了以35S为启动子的OsZFP1基因的植物表达载体,并将其转入拟南芥(Arabidopsis thaliana L.)植物和水稻(Oryza sativa L.)愈伤组织中以过量表达OsZFP1基因.转基因的拟南芥植株和水稻愈伤组织对盐处理的敏感性都比野生型要高.这一结果表明OsZFP1基因可能编码一种负调控蛋白,它可能抑制某些盐诱导基因的表达.在ABA处理下,转基因拟南芥植株比野生型植株抽苔晚,说明OsZFP1基因的作用可能受ABA调节.     

枸杞LbMYB103基因克隆及转化拟南芥的研究

以枸杞品种‘宁杞1号’花药为材料,采用 RT-PCR技术,分离了R2R3类MYB基因LbMYB103包含完整开放阅读框（ORF）的cDNA片段,碱基序列与已知基因HQ415755完全一致。运用Gateway技术构建LbMYB103基因植物过表达载体pMDC83-LbMYB103,利用基因枪法将融合有绿色荧光蛋白（GFP）的过表达载体转入洋葱表皮细胞,将LbMYB103基因定位在细胞核。实时荧光定量PCR分析发现,LbMYB103基因在花药中优势表达,果实中表达量较低,在根、茎和叶中均未检测到其转录本,推测LbMYB103基因可能在花药发育过程中起重要作用。通过根癌农杆菌介导法将pMDC83-LbMYB103转入拟南芥（Col-0）,经筛选获得T₁代抗性再生植株52棵,PCR鉴定有41棵阳性植株,收获T₁代种子,经抗性筛选获得T₂代抗性植株29棵,PCR鉴定有23棵阳性植株。实时荧光定量PCR分析表明,LbMYB103在拟南芥植株的基因组中正常表达。表型观察发现T₁和T₂代拟南芥花药发育异常,花发育迟缓,果荚短小无种子,进一步表明LbMYB103可能与植物的育性有关。该结果为进一步开展枸杞遗传转化,深入研究LbMYB103基因在枸杞花药发育过程中可能发挥的调控功能奠定了基础。     

马铃薯块茎形成相关基因STI-LIKE在拟南芥植株发育中的功能验证

马铃薯块茎的形成涉及一系列基因的表达和关闭。以马铃薯普通栽培品种"大西洋"为试验材料,采用RT-PCR扩增获得马铃薯STI-LIKE基因全长片段。RT-PCR定量分析表明,该基因在马铃薯营养器官中均有表达。生物信息学分析表明STI-LIKE蛋白具有3个TPR结构域,在高等植物中具有高同源性,是一个普遍存在的蛋白质。为验证STI-LIKE蛋白在拟南芥植株发育中功能,分别构建该基因强启动子表达载体(p BI121)和干扰载体(p HANNIBAL和p ART27),转化拟南芥获得了两种载体的拟南芥转基因植株,同时制备STI-LIKE蛋白抗体验证转基因植株蛋白表达。研究结果表明STI-LIKE基因可能参与拟南芥株型发育过程。     

山葡萄CBF基因表达载体构建及对拟南芥根生长的影响

为了研究山葡萄CBF基因调节植物对盐胁迫的应答机理,分别构建了山葡萄Va CBF1、Va CBF2和Va CBF3的植物过表达载体。经酶切及琼脂糖电泳检测证实3个基因均插入到p BASTA中,表明表达载体构建成功。然后,分别将3个植物过表达载体转入农杆菌EHA105中,并通过浸花法浸染拟南芥。利用除草剂筛选获得3个基因的拟南芥过表达株系。最后,对野生型拟南芥与转基因拟南芥进行盐胁迫处理,发现OE-CBF2转基因植株的主根伸长长度显著长于其它植株,3个转基因株系的侧根长度也明显长于野生型植株。上述结果表明山葡萄CBF基因可能在植物盐胁迫中对根部生长发育起到非常重要的调控作用。     

马铃薯遗传转化体系的优化及玉米淀粉分支酶基因SBEⅡb的导入

以马铃薯脱毒试管苗茎段为转化受体材料,建立并优化了农杆菌介导的马铃薯遗传转化体系。通过农杆菌介导法将玉米淀粉分支酶基因(Starch branching enzyme b,SBEⅡb)的过表达载体转化马铃薯,接种762个茎段,共获得35株抗性植株。经PCR检测获得了4株转基因阳性植株;对转基因植株进一步进行GUS活性组织化学染色,发现转基因植株的茎段与试管薯均被染上蓝色,表明外源SBEⅡb基因已整合到马铃薯基因组,且正常表达。     

Optimization of genetic transformation system of potato and introduction of maize starch branching enzyme gene SBEⅡb into potatoFAN

以马铃薯脱毒试管苗茎段为转化受体材料,建立并优化了农杆菌介导的马铃薯遗传转化体系.通过农杆菌介导法将玉米淀粉分支酶基因(Starch branching enzyme b,SBEⅡb)的过表达载体转化马铃薯,接种762个茎段,共获得35株抗性植株.经PCR检测获得了4株转基因阳性植株;对转基因植株进一步进行GUS活性组织化学染色,发现转基因植株的茎段与试管薯均被染上蓝色,表明外源SBEⅡb基因已整合到马铃薯基因组,且正常表达.     

拟南芥AtPI基因植物表达载体的构建及其在烟草中的遗传转化

花是被子植物主要的繁殖器官,在繁育后代的过程中,发挥着极其重要的作用,PISTILLATA(PI)基因作为控制花器官发育的B类功能基因中的一员,在花器官发育中起到重要的作用。为探究PI基因在花瓣和雄蕊发育中的功能,本文以拟南芥(Arabidopsis thaliana)中的PI基因作为研究对象,利用PCR技术从拟南芥花序c DNA扩增出At PI基因,构建植物表达载体(p ROKⅡ-At PI)并进行烟草(Nicotiana tobacum)转化。转基因植株的PCR检测结果表明,At PI基因已经整合到了烟草基因组中。在T2代植株中,通过实时定量荧光PCR检测显示,At PI在m RNA水平也均有表达。过量表达PI的转基因烟草在花器官中存在明显表型,与野生型相比主要表现为转基因植株花冠变小,雄蕊缩短,果实畸形且子房基部比野生型长5~10 mm,上述结果表明At PI基因是特异性参与雄蕊和花瓣的发育并起着至关重要的作用。     

超量表达拟南芥油菜素内酯基因BAS1对烟草维管组织发育的影响

为了研究AtBAS1基因对烟草维管组织发育中的影响,本研究构建了含有杨树维管组织特异启动子pLXM5和植物组成性启动子35S驱动的BAS1基因的植物表达载体,并利用叶盘转化法遗传转化烟草,经PCR和GUS组织化学染色检测筛选获得转基因植株。测量转基因烟草的株高和茎围,发现转pLXM5::BAS1基因烟草茎围比野生型烟草高27.3%;对转基因植株茎部进行切片分析和显微观察,转pLXM5::BAS1基因烟草与野生型烟草相比,韧皮部细胞层数是野生型烟草的2.1倍而韧皮部细胞大小没有明显差异。结果说明,BAS1基因在烟草维管组织发育过程中能够促进韧皮部细胞的分化。     

过表达或沉默棉花GhPCBER基因株系的获得及其茎叶木质素和木脂素含量研究

编码苯基香豆满苄基醚还原酶(phenylcoumaran benzylic ether reductase,PCBER)的基因PCBER属于PIP亚家族,是苯丙烷代谢途径中参与木脂素合成的关键基因。该研究构建了棉花GhPCBER基因的植物过表达载体并转化拟南芥,同时构建了VIGS(virus induced gene silencing,病毒诱导的基因沉默)载体转化棉花,采用实时荧光定量PCR技术对GhPCBER基因在不同组织中的表达进行分析;对野生型和转基因植株茎叶组织中的木质素和木脂素含量进行测定分析。结果表明:(1)成功构建了GhPCBER植物过表达载体pGWB17-GhPCBRE以及基因沉默重组载体pTRV2-GhPCBER;经遗传转化获得6株转棉花GhPCBER基因抗性拟南芥植株,同时获得15株GhPCBER基因沉默棉花植株(5株为一组)。(2)PCR检测表明,6株转基因拟南芥均为过表达株系,其中株系1、2、3相对表达量更高,且在茎、叶组织中的表达量分别较野生型提高了7～14倍和6～16倍,表明GhPCBER基因成功在拟南芥中过表达;GhPCBER基因沉默棉花植株的茎、叶组织中的表达量分别比野生型棉株约下降12%和26%,表明烟草脆裂病毒(TRV)体系(pTRV2-GhPCBER)成功抑制了GhPCBER基因的表达。(3)转GhPCBER基因拟南芥茎、叶中木质素和木脂素含量较野生型均显著降低;GhPCBER基因沉默棉花植株茎、叶中木质素和木脂素含量较野生型均极显著降低;组织化学染色观察发现GhPCBER基因沉默棉花植株茎秆颜色明显比野生型染色浅,也证明沉默基因棉花植株茎秆中的木质素含量减少。(4)苯丙烷代谢通路中8个相关基因的实时荧光定量PCR分析发现,过表达或抑制GhPCBRE基因均会导致苯丙烷代谢途径发生重新定向。     

马铃薯叶特异性启动子驱动的人白细胞介素-12的遗传转化

利用植物生物反应器表达具有应用价值的药用蛋白是近年来生物技术研究的热点之一。本研究利用前期构建的Prbcs驱动的h IL12植物表达载体,导入根瘤农杆菌后侵染马铃薯,通过筛选、分化等过程,获得转基因马铃薯植株。结果显示,获得13个独立的转h IL12基因阳性马铃薯株系,GUS染色分析表明外源基因成功获得表达,且具有良好的遗传稳定性。本研究获得的Prbcs驱动的h IL12转基因马铃薯植株,为下一步利用马铃薯高效表达生产h IL-12蛋白打下了基础。